miR-202、AFP及DKK1在原發(fā)性肝癌患者血清中的表達(dá)及其意義

韓 悅，魏殿軍

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211）

原發(fā)性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是肝細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，與肝硬化、病毒性肝炎密切相關(guān)，目前其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PHC發(fā)病率較高，在世界惡性腫瘤中處于第5位，死亡率為第2位[1]。在我國(guó)，PHC高發(fā)于東南沿海地區(qū)，是危害人們身心健康的一大殺手。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)PHC病人的中位年齡為40～50歲，男性多于女性，其死亡率約為98%，略高于PHC全球死亡率，且死亡人數(shù)占到肝癌全球死亡人數(shù)的一半以上[2]。由于PHC早期癥狀不顯著，患者被確診時(shí)已是中晚期，因而錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)期，即使獲得根治性治療，5年內(nèi)仍有60%～70%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3]。PHC病情發(fā)展加快會(huì)導(dǎo)致患者肝功能衰竭，晚期癌細(xì)胞大量增殖，擴(kuò)散至周圍組織及遠(yuǎn)處器官，如門靜脈、肺部、腦部等，惡化程度加劇。及早發(fā)現(xiàn)并治療可提高PHC患者的生存率，改善生存質(zhì)量。本研究通過(guò)檢測(cè)肝癌患者血清中微小RNA-202（micro RNA-202,miR-202）、甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）、分泌性蛋白 Dikkopf-1（secreted protein,DKK1）的水平，運(yùn)用ROC曲線分析3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的價(jià)值，探究提高臨床診斷PHC準(zhǔn)確性的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年6月—2014年12月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝病科收治的43例PHC患者（PHC組）、37例良性肝病患者（良性肝病組）及51例同期健康體檢人員（健康對(duì)照組）。根據(jù)原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南（2015年版）[4]對(duì)PHC進(jìn)行診斷，并經(jīng)病理檢查確診為PHC。PHC組男性25例，女性18例，年齡29～76歲，平均年齡（54.2±4.9）歲；良性肝病患者男性22例，女性15例，年齡32～77歲，平均年齡（53.9±6.1）歲，其中肝囊腫18例，肝血管瘤19例；健康對(duì)照組男性29例，女性22例，年齡30～81 歲，平均年齡（56.2±8.3）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者初次確診；（2）之前未接受任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并神經(jīng)性疾病或語(yǔ)言交流障礙者；（2）妊娠或哺乳期婦女；（3）有其他惡性腫瘤疾病患者；（4）有自身免疫性疾病患者；（5）藥物性肝病或病毒性肝病患者；（6）臨床依從性較差患者。3組受試對(duì)象在性別（χ2=0.060，P=0.971）、年齡（F=1.590，P=0.207）上比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P＞0.05）。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知曉本次研究并簽署知情同意書。

1.2 方法 分別采集3組受試對(duì)象清晨空腹靜脈血 10mL，3500r/min 離心 10min，分離血清，于-80℃保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qPCR法）檢測(cè)3組受試者血清miR-202含量，先提取血清總RNA，加入引物后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別在95℃、95℃、60℃預(yù)變性30 s、3 s、30 s，共40個(gè)循環(huán)，miR-202的相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct表示。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增定量，用PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)；采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中AFP水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中DKK1水平。所有操作均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑盒 總miRNA提取試劑盒、miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miR-202引物（5′-GCTGGAG AGGTATAGGGCA-3′，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′）、內(nèi)參（5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′） 及探針和miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（賽默飛世爾）；滅酶EP管（上海俊晟生物科技有限公司）；干浴鍋（上海汗諾儀器有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（達(dá)安基因）；紫外可見(jiàn)分光光度儀（菲勒儀器有限公司）；AFP試劑盒、DKK1試劑盒（武漢明德生物）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理本實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則用中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（Q1，Q3）表示，3組間數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；運(yùn)用受試者工作特征曲線（ROC 曲線）分析 miR-202、AFP、DKK1及聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的診斷效能；采用Pearson相關(guān)分析研究miR-202、AFP及DKK1的相關(guān)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-202、AFP及DKK1在PHC組、良性肝病組及健康對(duì)照組血清中的表達(dá) PHC組患者血清中miR-202水平低于良性肝病組和健康對(duì)照組，有顯著性差異（P＜0.05）；AFP和DKK1水平均高于良性肝病組和健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組受試對(duì)象血清中miR-202、AFP和DKK1表達(dá)水平比較（x±s）Tab 1 Comparison of the levels of miR-202,AFP and DKK1 expression in the serum of the three groups（x±s）

2.2 血清miR-202、AFP及DKK1診斷PHC的效能 聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的效能高于miR-202、AFP及DKK1單獨(dú)檢測(cè)，且聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積最大，為0.917。ROC曲線下面積比較，AUC聯(lián)合檢測(cè)＞AUCmiR-202（Z=2.075，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AUC聯(lián)合檢測(cè)＞AUCAFP，AUC聯(lián)合檢測(cè)＞AUCDKK1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z值分別為 1.812，1.202，P均＞0.05）；AUCmiR-202＜AUCAFP，AUCmiR-202＜AUCDKK1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Z值分別為-0.743，-1.261，P均＞0.05）；AUCAFP＜ AUCDKK1，P＞0.05。詳見(jiàn)圖 1、表 2 和表 3。

圖1 miR-202、AFP、DKK1及聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的ROC曲線Fig 1 Thereceiveroperatingcharacteristiccurves(ROC)formiR-202,AFP,DKK1 and combined detection for the diagnosis of PHC

圖2 miR-202、AFP及DKK1的相關(guān)性Fig 2 Correlation between miR-202,AFP and DKK1

2.3 miR-202、AFP及DKK1的相關(guān)性分析 miR-202與 AFP 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.314，P=0.005）；miR-202與 DKK1 呈負(fù)相關(guān) （r=-0.319，P=0.004）；AFP 與DKK1 呈正相關(guān)（r=0.556，P＜0.001）。

表2 聯(lián)合檢測(cè)miR-202、AFP及DKK1對(duì)PHC的診斷價(jià)值（%）Tab 2 The diagnostic value of combined detection of mir-202,AFP and DKK1 for PHC(%)

表3 miR-202、AFP、DKK1及聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的ROC曲線下面積Tab 3 Area under the receiver operating characteristic curves(ROC)for miR-202,AFP,DKK1 and combined detection for the diagnosis of PHC

3 討論

PHC的發(fā)生發(fā)展是多種因素參與、分階段進(jìn)行的過(guò)程，早期不易發(fā)現(xiàn)，僅有少部分患者經(jīng)確診后可以治療，因而造成PHC患者預(yù)后不良。目前，臨床診斷PHC仍以影像學(xué)檢查和肝組織活檢病理檢查為主，然而兩者均有不足之處。CT、MRI聯(lián)合檢測(cè)及B超篩查對(duì)患者無(wú)創(chuàng)傷，但其判斷誤差較大，需具備良好生理解剖知識(shí)及豐富影像學(xué)鑒定經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師來(lái)完成[5]；肝組織活檢的準(zhǔn)確性相對(duì)較高，但易給患者帶來(lái)創(chuàng)傷、出血風(fēng)險(xiǎn)，臨床上應(yīng)用受到限制[6]。可見(jiàn)，PHC傳統(tǒng)的診斷方法存在局限，尋找腫瘤細(xì)胞篩查的新途徑顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)標(biāo)志物水平檢測(cè)近年應(yīng)用較為廣泛[7]。

有研究報(bào)道，多種miRNAs在肝癌組織中存在異常表達(dá)，在眾多miRNAs中，miR-202位于10q26的脆性位點(diǎn)，與大腦腫瘤、子宮內(nèi)膜存在密切關(guān)聯(lián)[8-9]。報(bào)道指出，miR-202在多種疾病中表達(dá)存在異常（如食管癌、胃癌），但關(guān)于其在肝癌中表達(dá)的報(bào)道較少[10]。本研究中，PHC患者血清中miR-202水平顯著低于良性肝病組和健康對(duì)照組，這與Zhang等[10]的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明miR-202在肝癌發(fā)展過(guò)程中起到抑制癌基因的作用。Fu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，血清中的miRNA穩(wěn)定性較好，難以被降解，且其具備一定的組織特異性，因此miRNA-202可以作為潛在的生物標(biāo)記物對(duì)PHC進(jìn)行診斷。本研究結(jié)果顯示，miRNA-202單項(xiàng)診斷PHC的準(zhǔn)確性為73.75%，說(shuō)明僅憑miRNA-202診斷PHC易造成誤診和漏診。

AFP為臨床上常用的肝癌標(biāo)志物，AFP在正常成人血清中含量極微，但有報(bào)道指出，約有50%～60%的PHC患者AFP表達(dá)升高，且AFP在肝炎及肝硬化患者中也有不同程度的升高[12]。本研究中PHC患者AFP水平高于良性肝病患者健康受試者，此結(jié)果與上述研究一致。血清AFP診斷PHC的敏感度為69.77%，特異性為70.27%，結(jié)果與Sakr等[13]研究結(jié)果類似。另外，AFP診斷PHC的ROC曲線下面積相比較而言不是很高，可能原因是癌變時(shí)的肝細(xì)胞受到低甲基化干擾，從而使其合成的AFP表達(dá)處于開(kāi)放化狀態(tài)，提示單獨(dú)應(yīng)用AFP診斷PHC存在一定的誤診及漏診率。

DKK1是由266個(gè)氨基酸組成的一種分泌型糖蛋白，其能與相應(yīng)的受體結(jié)合并調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、凋亡及遷移，在腫瘤發(fā)生方面具有重要作用。研究指出，DKK1在乳腺癌、胃癌等中表達(dá)水平降低，而在肝癌、肺癌中的表達(dá)升高。本研究發(fā)現(xiàn)，與良性肝病組和健康對(duì)照組相比，PHC組患者血清中DKK1水平升高，提示DKK1可用于PHC的診斷。DKK1對(duì)PHC診斷的敏感度為83.72%，特異性83.78%，結(jié)果與既往研究存在差異[14]。由于單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物診斷PHC的敏感度及特異性均難滿足臨床早期診斷及預(yù)后評(píng)估的要求，所以在實(shí)際工作中推薦應(yīng)用聯(lián)合檢測(cè)。AFP、miRNA-202、DKK1 3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)診斷PHC的AUC提升至0.917，高于AFP、miRNA-202、DKK1單獨(dú)檢測(cè)。因此認(rèn)為三者聯(lián)合檢測(cè)在PHC診斷方面更具優(yōu)勢(shì)[15]。此外，3個(gè)指標(biāo)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-202與AFP、DKK1均呈正相關(guān)，AFP與DKK1呈正相關(guān)，提示三者血清水平存在聯(lián)系。

綜上所述，miR-202、AFP及DKK1聯(lián)合檢測(cè)可以提高PHC診斷的準(zhǔn)確性，為臨床診治PHC提供參考依據(jù)。然而本研究樣本量小，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量并進(jìn)一步探究3個(gè)指標(biāo)在PHC中的作用機(jī)制。