低分子肝素鈣對小鼠胚胎著床的干預(yù)作用及機(jī)制研究

楊 文，楊 艷，吳曉燕，王 芳，孫 倩，高 原，張歡歡，馮 文*，馬 寧

(1. 江蘇省連云港第一人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222000; 2.海南省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，?？?570206)

胚胎著床是胎生哺乳動(dòng)物生殖過程中決定妊娠是否成功的關(guān)鍵所在。胚胎著床主要包括定位、黏著、侵入3個(gè)步驟，囊胚在一定位置靠近內(nèi)膜，并被安置在子宮角腔中某個(gè)適當(dāng)?shù)奈恢茫又遗咦甜B(yǎng)層細(xì)胞黏著能力增強(qiáng)，使囊胚進(jìn)一步貼緊子宮內(nèi)膜，最后囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞通過分泌某種物質(zhì)使之侵入內(nèi)膜基質(zhì)。該過程是由細(xì)胞因子、黏著分子、性激素等多種分子通路所介導(dǎo)[1-2]。臨床上，低分子肝素鈣(low molecular weight heparin calcium, LMWHC)常用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)以及反復(fù)著床失敗患者的治療，并認(rèn)為與LMWHC抗血栓抗凝作用有關(guān)[3-4]。本研究通過構(gòu)建妊娠小鼠模型，探討LMWHC對小鼠胚胎著床的影響，并從細(xì)胞分子水平上分析LMWHC的可能作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只8～10周齡成熟未育的清潔級雌性昆明小鼠購于蘇州新藥研究中心有限公司[SCXK(蘇)2013-0003]，體重30-35 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于蘇州市立醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK(蘇)2017-0043]，室溫環(huán)境恒定溫度為25℃，每12 h 黑暗光照條件循環(huán)交替，動(dòng)物攝食和飲水自由，福利倫理審查證號201711A。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12 液體培養(yǎng)基購自Hyclone公司(美國)；胎牛血清、青鏈霉素混合液購自于Life Technologies公司(美國)；胰蛋白酶購自于Sigma公司(美國)；鼠抗人細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK7)、波形蛋白(Vimentin,V9)單克隆抗體以及免疫組織化學(xué)試劑盒購自于北京中杉生物試劑公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinases-2, MMP-2)和金屬蛋白酶抑制因子-2(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2，TIMP-2)ELISA試劑盒購自于ADL公司(美國)；Transwell小室購自于Corning公司(美國)；Matrigel購自于BD公司(美國)；二氧化碳培養(yǎng)箱購自于FORMA公司(美國)；OLYMPUS BX50 生物顯微鏡購自于OLYMPUS 公司(日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立與材料收集

按2∶1的比例與成年雄性小鼠合籠交配，次日對雌性小鼠陰道進(jìn)行檢查，將檢出陰栓的小鼠視作妊娠D1。將妊娠小鼠隨機(jī)分為對照組和LMWHC組，每組各12只，LMWHC組小鼠按1000 U/kg腹腔注射LMWHC，對照組腹腔注射等量生理鹽水。妊娠D6時(shí)(6只孕鼠)，尾靜脈注射1%臺(tái)盼藍(lán) 100 μL，5 min 后處死孕鼠(頸椎脫臼法)，取出子宮，觀察子宮形態(tài)，記錄小鼠子宮藍(lán)色著床位點(diǎn)數(shù)。妊娠D9時(shí)(6只孕鼠)，著床點(diǎn)肉眼可見，直接處死，記錄小鼠子宮著床位點(diǎn)數(shù)。統(tǒng)計(jì)著床位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算每組小鼠著床位點(diǎn)平均數(shù)。

1.3.2 滋養(yǎng)層細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

另外選取妊娠D14的小鼠，頸椎脫臼法處死后分離胎盤組織，無菌鹽水清洗后將其剪碎，采用Zhou WH改良法[5]分離純化滋養(yǎng)層細(xì)胞。將滋養(yǎng)層細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至每孔3×108個(gè)接種于放置有載玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和雙抗(鏈霉素、青霉素)的DMEM/F12。待細(xì)胞生長至80%時(shí)，取出載玻片，PBS清洗3次后固定10 min，再次清洗3次，然后用3% H2O2去離子水孵育10 min，清洗后室溫封閉30 min。加入一抗(CK-7抗體、V9抗體以及PBS代替一抗作為陰性對照)低溫孵育過夜，PBS清洗3次后，加入二抗，室溫孵育60 min，PBS清洗3次后，經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水、透明等步驟后封片，并觀察拍照，計(jì)算陽性細(xì)胞率和陰性細(xì)胞率。

1.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)

預(yù)先將Matrigel包被在Transwell板濾膜表面，上室中加入濃度為每孔2×105個(gè)的滋養(yǎng)層細(xì)胞，分別采用1×102IU/L、1×103IU/L和1×104IU/L 濃度的LMWHC干預(yù)，不加LMWHC的細(xì)胞作為對照，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基800 μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置24 h，然后取出，將上室濾膜內(nèi)表面的細(xì)胞擦拭干凈，將濾膜下表面的細(xì)胞固定，經(jīng)瑞士染色后，在高倍鏡(×200)下觀察，每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每次不同LMWHC干預(yù)濃度以及對照設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 上清液中MMP-2和TIMP-2濃度檢測

將濃度為每孔3×108個(gè)的滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置30 min后，分別采用1×102IU/L、1×103IU/L和1×104IU/L 濃度的LMWHC干預(yù)，不加LMWHC的細(xì)胞作為對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置24 h后收集上清，采用ELISA法檢測上清中MMP-2和TIMP-2水平。

注：A:子宮形態(tài)圖；B:胚胎著床點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)。與對照組比較，*P<0.05。圖1 小鼠胚胎著床點(diǎn)數(shù)Note. A:Uterine morphogram; B:Embryo implantation count. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 1 Number of mouse embryo implantation sites

1.3.5 Western blot實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞蛋白提取后按配方配制SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)接近電泳槽底部時(shí)停止電泳，在電壓15 V，時(shí)間1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，孵育一抗、孵育二抗，0.1% TBST漂洗PVDF膜，按1∶1等比例去ECL發(fā)光液A液和B液混合，在Alpha FluorChem Q 凝膠成像系統(tǒng)下曝光并成像，保留圖片后用于統(tǒng)計(jì)分析。蛋白條帶灰度值半定量分析：用Image J軟件對拍照下的蛋白條帶進(jìn)行灰度值測定。以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來校正上樣量的偏差，用二者灰度比值的高低表示各樣本目的蛋白表達(dá)量的多少。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)

采用Trizol法并利用TIANGEN? RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒，提取總RNA，按照StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用GenStar 2×Taq PCR Mix with Loading Dye 試劑盒加入引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束用2.1% 凝膠電泳。MMP-2引物序列，F(xiàn)orward primer：5’-CGCTCAGATCCGTGGTGAGAT-3’；Reverse primer：5’-CGGGAGCTCAGGCCAG AATG-3’，擴(kuò)增片段310 bp；TIMP-2引物序列，F(xiàn)orward primer：5’-CTCGCTGGACGTTGGAGGAAAG AA-3’，Reverse primer：5’-AGCCCATCTGGTACC TGTGTTCA-3’，擴(kuò)增片段150 bp；內(nèi)參β-actin引物序列：Forward primer：5’-ATATCGCTGCCGCTGGTC GTC-3’；Reverse primer：5’-AGGATGGCGTGAG GGAGACC-3’，擴(kuò)增片段517 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，4℃ 延伸，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用2.1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 LMWHC對小鼠胚胎著床的影響

取妊娠D6和D9的小鼠子宮，記錄各小鼠胚胎著床位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果顯示，LMWHC組妊娠D6和D9的著床位點(diǎn)數(shù)均多于對照組，差異有顯著性(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 兩組胚胎著床位點(diǎn)數(shù)比較Table 1 Comparison of embryo implantation sites in two groups

2.2 小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞鑒定

經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)DAB實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)貼壁生長的細(xì)胞為CK7陽性，細(xì)胞CK7陽性率為(94.83±3.15)%，大多數(shù)細(xì)胞為V9陰性，細(xì)胞V9陰性率為(91.18±2.87)%，見圖2。

2.3 LMWHC對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的影響

用1×102IU/L、1×103IU/L和1×104IU/L 濃度的LMWHC干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(84.83±14.15)個(gè)、(162.48±25.49)個(gè)、(98.73±12.77)個(gè)，與未用LMWHC干預(yù)細(xì)胞的(65.27±13.92)個(gè)比較，差異有顯著性(P<0.05)，見圖3。

圖2 小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果(×200)Figure 2 Morphology of the mouse trophoblast cells.Immunohgistochemical staining.

注：A：不同濃度LMWHC干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后Transwell實(shí)驗(yàn)(×200)。B：不同濃度LMWHC干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后侵襲細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)。與對照組比較，*P<0.05。圖3 LMWHC對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的影響Note. A: Transwell assay after 24 h of different concentrations of LMWHC on trophoblast cells(×200). B: Statistics of invading cells in trophoblast cells after 24 h of different concentrations of LMWHC. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 3 Effects of LMWHC on the invasiveness of mouse trophoblast cells

2.4 LMWHC對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞中細(xì)胞因子的影響

用1×102IU/L、1×103IU/L和1×104IU/L 濃度的LMWHC干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后，滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中MMP-2表達(dá)水平較未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞均升高，差異有顯著性(P<0.05)，當(dāng)LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L時(shí)，MMP-2表達(dá)水平最高。滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中TIMP-2表達(dá)水平隨著LMWHC干預(yù)濃度的升高而降低，LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L和1×104IU/L時(shí)，與未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞比較，差異有顯著性(P<0.05)，見圖4。

注：A：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中MMP-2的表達(dá)水平。B：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中TIMP的表達(dá)水平。與對照組比較，*P<0.05。圖4 LMWHC對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基上清中MMP-2和TIMP的影響Note. A: Expression level of MMP-2 in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells. B: Expression level of TIMP in supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells. Compared with control group, *P<0.05.Figure 4 Effects of LMWHC on MMP-2 and TIMP in the supernatant of culture medium of mouse trophoblast cells

2.5 LMWHC對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP-2和TIMP-2蛋白水平表達(dá)的影響

LMWHC不同濃度干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后，滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中MMP-2表達(dá)水平較未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞均升高(P<0.05)，當(dāng)LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L時(shí)，MMP-2表達(dá)水平最高。滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中TIMP-2表達(dá)水平隨著LMWHC干預(yù)濃度的升高而降低，LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L和1×104IU/L時(shí)，與未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞比較，差異有顯著性(P<0.05)，見圖5。

注：A：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中MMP-2的表達(dá)水平。B：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中TIMP的表達(dá)水平。與對照組比較，*P<0.05。圖5 LMWHC對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基上清中MMP-2和TIMP的影響Note. A: Expression level of MMP-2 in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells.B: Expression level of TIMP in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 5 Effects of LMWHC on MMP-2 and TIMP in supernatant of culture medium of mouse trophoblast cells

2.6 LMWHC對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP-2和TIMP-2 mRNA水平表達(dá)的影響

注：A：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中MMP-2 mRNA表達(dá)水平。B：不同濃度LMWHC干預(yù)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞后，培養(yǎng)基上清中TIMP mRNA表達(dá)水平。與對照組比較，*P<0.05。圖6 LMWHC對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基上清中MMP-2和TIMP的影響Note. A: MMP-2 mRNA expression level in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblast cells. B: TIMP mRNA expression level in the supernatant of culture medium after different concentrations of LMWHC on mouse trophoblastic cells. Compared with the control group, *P<0.05.Figure 6 Effects of LMWHC on MMP-2 and TIMP in supernatant of culture medium of mouse trophoblast cells

LMWHC不同濃度干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞24 h后，滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中MMP-2 mRNA表達(dá)水平較未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞均升高(P<0.05)，且當(dāng)LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L時(shí)，MMP-2表達(dá)水平最高。滋養(yǎng)層細(xì)胞上清液中TIMP-2表達(dá)水平隨著LMWHC干預(yù)濃度的升高而降低，LMWHC干預(yù)濃度為1×103IU/L和1×104IU/L時(shí)，與未用LMWHC干預(yù)的細(xì)胞比較，差異有顯著性(P<0.05)，見圖6。

3 討論

生殖是物種繁衍的重要生理過程，而相對低效率的妊娠對生殖造成嚴(yán)重影響。正常育齡期女性每個(gè)排卵周期妊娠成功的幾率僅在30%左右，妊娠失敗的原因主要為胚胎著床失敗[6]。盡管現(xiàn)代的體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)為不孕患者提供了妊娠機(jī)會(huì)，但I(xiàn)VF-ET的著床率也僅20%～30%，胚胎著床失敗仍是當(dāng)前生殖醫(yī)學(xué)的難題之一[7]。胚胎著床是否成功主要與影響配子或胚胎發(fā)育的因素、影響子宮內(nèi)膜容受性的因素、影響子宮的全身因素有關(guān)[8]。

LMWHC是肝素經(jīng)化學(xué)解聚或在酶的作用下產(chǎn)生的小分子片段，可通過抑制凝血因子Ⅱa和凝血酶Ⅹa活性發(fā)揮抗凝作用，同時(shí)對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，使血液粘稠度降低，從而增加胎盤血液供應(yīng)，改善胎盤微循環(huán)，有利于胚胎生長發(fā)育[9-10]。在產(chǎn)科中多用于妊娠合并癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療，且應(yīng)用于IVF-ET多次失敗患者，可有效改善妊娠結(jié)局[11-13]。

為探討LMWHC對胚胎著床的影響及其作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了妊娠小鼠模型，給予LMWHC干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LMWHC組妊娠D6和D9小鼠的著床位點(diǎn)數(shù)均多于對照組，差異有顯著性(P<0.05)，提示LMWHC對胚胎著床具有促進(jìn)作用。滋養(yǎng)細(xì)胞源于胚胎外的滋養(yǎng)層，可分化為胎盤和胎膜。滋養(yǎng)細(xì)胞在胎盤著床過程中分化為2個(gè)不同亞群，即絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞。其中絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞能通過母體蛻膜和子宮血管的侵入降解并重建子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)。滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜不足會(huì)影響胚胎著床以及胎盤血管重塑，導(dǎo)致各種妊娠期并發(fā)癥以及胎兒發(fā)育遲緩、流產(chǎn)、死胎發(fā)生[14-15]。Chen[16]等人發(fā)現(xiàn)LMWH對孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力具有調(diào)節(jié)作用，2.5×102IU/L和2.5×103IU/L組滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，2.5×104IU/L和2.5×105IU/L組滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力則受到抑制。但Quenby[17]等人研究結(jié)果顯示，無論是2.5×102IU/L還是2.5×103IU/L的LMWH對滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力均無明顯作用。鑒于此，本研究對小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并采用不同濃度LMWHC處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不同濃度LMWHC處理后，滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲力均明顯增強(qiáng)，且在LMWHC濃度為1×103IU/L時(shí)最強(qiáng)，提示一定濃度范圍內(nèi)的LMWHC可通過增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力而促進(jìn)胚胎著床。不同研究結(jié)果存在差異，可能與選取樣本、實(shí)驗(yàn)方法或取樣部位不同有關(guān)。

滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲力主要受其分泌的MMPs調(diào)節(jié)，MMP-2是妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的最主要蛋白酶，可將子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)中的IV型膠原降解，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵入。TIMP是MMP的抑制物，兩者的相互制約對于滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的控制起到重要作用[18-19]。Chen[16]等人雖指出LMWHC可調(diào)節(jié)孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力，但未對其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)一步探索，本研究采用不同濃度LMWHC處理小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞，通過ELISA法、Western blot和RT-PCR檢測細(xì)胞上清液中MMP-2和TIMP-2的蛋白和mRNA水平表達(dá)情況，結(jié)果顯示采用LMWHC處理的細(xì)胞上清中MMP-2表達(dá)水平較未處理細(xì)胞明顯上升，而TIMP-2表達(dá)水平較未處理細(xì)胞明顯下降，以上結(jié)果提示LMWHC可能是通過上調(diào)MMP-2表達(dá)同時(shí)下調(diào)TIMP-2表達(dá)而增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力。

綜上所述，LMWHC對小鼠胚胎著床具有積極作用，其機(jī)制可能與LMWHC調(diào)控MMP-2和TIMP-2表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力有關(guān)。當(dāng)然，影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的因素眾多，LMWHC是否與其他細(xì)胞因子的表達(dá)以及信號通路有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。