陽極阻滯電刺激骶神經(jīng)根對神經(jīng)源性膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)恢復作用

閆 鵬,郝少飛,崔京福,劉金輝,馬玉斐,關(guān)春雷,楊小玉,王瀟然

(1.鄭州市第一人民醫(yī)院 脊柱外科,河南 鄭州450004;2.吉林大學第二醫(yī)院 骨科,吉林 長春130041;3.吉林省人民醫(yī)院 泌尿外科,吉林 長春130021)

脊髓損傷(spinal cord injury; SCI)在我國較為常見，是可以引起極高致殘率的傷病之一，由其導致的膀胱支配神經(jīng)損害均可引起神經(jīng)原性膀胱排尿功能障礙。常表現(xiàn)為膀胱感覺及運動功能障礙，進而可引起嚴重的尿潴留、尿路感染、最終導致腎功能衰竭，成為目前脊髓損傷病人主要的死亡原因之一[1,2]。因此能否重建SCI后病人的膀胱功能，對于提高截癱患者的生活質(zhì)量，延長此類患者的生存期及降低死亡率具有十分顯著的意義。

本課題組前期研究表明[3,4]：長期陽極阻斷電刺激骶神經(jīng)前根(300 us脈寬、1.05 mA刺激電流)可以減少膀胱殘余尿量，提高排尿效率，增加膀胱體積，降低膀胱最大逼尿肌壓、靜息壓及逼尿肌漏點壓，重建膀胱順應性，緩解逼尿肌活動亢進及外括約肌病理性活動，進而可以有效的保護上尿路，從而改善膀胱-輸尿管返流等并發(fā)癥，最終達到重建SCI后膀胱的排尿功能目的。本實驗通過透射電鏡觀察逼尿肌超微結(jié)構(gòu)變化，探討其對膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組

清潔級成年健康新西蘭白兔24只，質(zhì)量2.0-2.5 kg，雌性，由吉林大學醫(yī)學部動物實驗室提供，動物許可證：SCXK-(吉)2008-0005，集中飼養(yǎng)兩周后進行實驗。實驗過程中對動物的處理原則及方法符合中華人民共和國科學技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》[5],采用隨機抽樣方法將實驗動物分為三組，A組為假手術(shù)對照組(n=8)，B組為脊髓損傷組(n=8),C組為電刺激組(n=8)。

1.2實驗儀器及設備

EM-1200EX型投射電子顯微鏡(日本)，OLYMPUS BX51電子顯微鏡(日本)，LKB-III型超薄切片機(瑞典)，多通道電生理儀( BL420 - E生物機能試驗系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司)，實驗所用骶神經(jīng)根電刺激器和刺激電極均由吉林大學提供，實驗所用速眠新 Ⅱ 、蘇醒靈4號由吉林大學農(nóng)學部提供。

1.3試驗方法

1.3.1動物模型的制備

對照組實驗兔通過假手術(shù)處理：僅切除椎板并縫合切口。脊髓損傷及電刺激組實驗兔均采用脊髓夾閉法致脊髓損傷[6]，術(shù)后所有實驗兔均單獨安置于兔籠中飼養(yǎng)，每天3次按壓腹部幫助其排二便，墊料每日更換；實驗過程中所用青霉素按每公斤體重10萬單位肌注給藥，連續(xù)用5天；手術(shù)切口每日1次消毒換藥。術(shù)后完全性SCI兔皮膚于損傷平面以下對疼痛刺激無反應,表現(xiàn)拒食，雙后肢及尾部均不能自主活動，所有實驗兔均存活。飼養(yǎng)10天后，SCI組及電刺激組經(jīng)尿動力學檢測為神經(jīng)源性膀胱，電刺激組實驗兔以骶1-骶4棘突為中心，依次切開皮膚及皮下組織并暴露椎板，咬除椎板后依次顯露骶神經(jīng)前、后根。通過顯微外科技術(shù)分離并切斷雙側(cè)骶1-骶4骶神經(jīng)后根完成去傳入，然后將實驗兔緩慢側(cè)身，改為側(cè)臥位，從而可以最大限度的減少電刺激傳入時腹壓的增加對膀胱內(nèi)壓形成的干擾。采用自制銀鉤狀電極通電刺激實驗兔骶神經(jīng)前根，依據(jù)電刺激時導致的膀胱內(nèi)壓的升高變化來判斷其支配膀胱逼尿肌的優(yōu)勢神經(jīng)根(主要為骶2和骶3神經(jīng)根),然后在雙側(cè)支配逼尿肌的優(yōu)勢神經(jīng)根處各放置一枚刺激電極，輕輕縮緊鎳環(huán)，縫合并固定刺激電極。通過術(shù)后第2天對實驗兔攝腰椎正側(cè)位X線片來確定刺激電極位置是否良好。

電刺激組實驗兔植入刺激電極完成后第二天開始每日進行6次陽極阻滯電刺激促進排尿、排便，刺激參數(shù)為刺激脈寬300 us，刺激電流達到1.05 mA[7]，每次15-30 min，電刺激組兔電刺激時間累計達到120 h后取材。

1.3.2取材

所有的實驗圖實驗過程中均使用速眠新進行靜脈麻醉，取準備取材實驗兔進行備皮、消毒，術(shù)者帶一次性無菌手套，取恥骨上下腹正中切口，依次切開皮膚及皮下組織，游離腹膜及腸管后進入盆腔，顯露膀胱后采用組織剪沿膀胱頸部橫行間斷，截取少量逼尿肌組織放置于預冷的戊二醛溶液中固定以備行透射電鏡觀察。

1.3.3透射電子顯微鏡檢查

樣品制作過程詳見文獻[4]，觀測指標：

逼尿肌細胞形態(tài)、大小、排列及邊界是否規(guī)則，染色質(zhì)是否均勻，細胞核形態(tài)及染色深度。細胞間間距、連接方式及數(shù)量是否存在變化，細胞膜表面是否規(guī)整光滑，胞內(nèi)肌質(zhì)膜下胞飲小泡數(shù)量是否變化，胞漿內(nèi)肌絲數(shù)量有無增減，排列有無變化。胞內(nèi)各種細胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等結(jié)構(gòu)是否變化，胞脊排列規(guī)則程度，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等形態(tài)學表現(xiàn),致密體分布是否均勻，核周間隙有無空間改變及空泡是否形成，細胞間隙有無縮窄，有無膠原纖維和無定形成分等。

2 結(jié)果

2.1大體組織標本觀察脊髓損傷(SCI)組膀胱可見大體標本體積減小，顏色偏向暗黃，組織表面血管網(wǎng)明顯減少，膀胱壁與周圍組織粘連較重，膀胱內(nèi)尿液混濁且粘稠，偶可見肉眼血尿，切片取材時切面可見部分纖維化及壞死；對照組與電刺激組實驗兔膀胱體積與脊髓損傷組相比明顯增大，顏色粉紅，表面可見大量血管組成的血管網(wǎng)，膀胱壁與周圍組織界限清晰，膀胱內(nèi)尿液較清亮，取材切面未見明顯異常。

2.2超微結(jié)構(gòu)對照組膀胱逼尿肌細胞呈梭形，細胞飽滿且排列整齊有序，走向均勻；細胞間距較小且致密，細胞間充斥著大量的中間連接，偶可見膠原及彈性纖維，細胞基質(zhì)內(nèi)可見線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體等細胞器且胞內(nèi)未見空泡狀改變。細胞核呈橢圓形或球形，核膜下可見異染色質(zhì)，核仁大而清晰(圖1)；脊髓損傷組表現(xiàn)為逼尿肌細胞外形不規(guī)則，大小不一且排列混亂無序，細胞間距增寬且細胞間可見大量的膠原纖維，胞突連接、橋粒連接及縫隙連接明顯增多，細胞內(nèi)細胞器增多且大多呈腫脹、空泡化及脫顆粒狀改變，肌細胞內(nèi)肌絲明顯減少且走行排序紊亂，細胞膜周圍可見高電子密度物質(zhì)堆積，凋亡細胞增多，細胞內(nèi)染色質(zhì)濃縮，核膜表面凹凸不平，出現(xiàn)核固縮和核溶解(圖2)；與上述脊髓損傷組細胞的超微結(jié)構(gòu)相比，電刺激組肌細胞形狀較為規(guī)則，大小相對均勻，凋亡細胞明顯減少，染色質(zhì)著色較淺，核固縮及核溶解消失，細胞基質(zhì)內(nèi)細胞器腫脹緩解，肌細胞間間隙減小，僅見少量的膠原纖維，中間連接較多而胞突連接及縫隙連接較少(圖3)。

圖1對照組圖2脊髓損傷組圖3電刺激組

3 討論

臨床疾病中由于各種原因如脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)、周圍神經(jīng)病變等導致的膀胱支配神經(jīng)受損均可產(chǎn)生神經(jīng)原性膀胱進而引起排尿功能障礙。部分患者常表現(xiàn)為殘余尿量增加,嚴重者則在出現(xiàn)腎功能損害后才進行治療,此時膀胱逼尿肌已經(jīng)發(fā)生較為嚴重的損害,功能已產(chǎn)生嚴重下降，給后續(xù)的治療帶來很大的困難，脊髓圓錐以上層面損傷時,膀胱的脊髓反射弧結(jié)構(gòu)完整，在脊髓休克緩解后，多進展成高張力、高反射的痙攣性膀胱，臨床上常表現(xiàn)為神經(jīng)原性逼尿肌病理性活動和逼尿肌和括約肌協(xié)同運動失調(diào),病人貯尿與排尿功能雙重障礙，而這種長期膀胱功能紊亂會致膀胱逼尿肌結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變，本課題組前期研究結(jié)果表明，應用陽極阻滯電刺激骶神經(jīng)根可以可以完全重建膀胱排尿功能(300 us脈寬、1.05 mA刺激電流)[3]，本研究旨在通過透射電鏡觀察逼尿肌超微結(jié)構(gòu)變化，探討其對膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)的保護作用。

膀胱逼尿肌功能上屬于平滑肌，其收縮功能與其正常的組織結(jié)構(gòu)、肌細胞內(nèi)鈣離子水平和線粒體的功能等密切相關(guān)，正常逼尿肌組織鏡下由以下三種顯微結(jié)構(gòu)組成:平滑肌細胞、細胞間質(zhì)和壁內(nèi)神經(jīng)。上述任一種結(jié)構(gòu)發(fā)生改變即可影響逼尿肌的功能，并可根據(jù)膀胱壁組織活檢以及逼尿肌切片電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)結(jié)果來判斷逼尿肌功能[8-10]。

正常的平滑肌細胞形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)基本相似,分布較為均勻,走行基本一致。細胞間可見大量的中間連接和散在的橋連接及縫隙連接， 細胞間距較小且均勻致密，致密區(qū)與胞飲小泡沿肌質(zhì)膜分布均勻，細胞內(nèi)可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等各種細胞器,肌絲數(shù)量較多，且與致密體平行排列，而脊髓損傷后除失神經(jīng)支配外，膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)也會出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的改變：例如肌細胞體積增大、胞內(nèi)細胞核體積增大,線粒體減少，核內(nèi)顆粒增多,肌絲數(shù)量減少且走行紊亂，與肌絲活動有關(guān)的密區(qū)和致密體排列混亂且不規(guī)則,胞飲小泡減少，細胞間隙增寬、分布不規(guī)則且走行不均勻，細胞間可見大量鋸齒狀的胞突連接以及較多緊密連接，細胞間質(zhì)大量膠原纖維和彈性纖維浸潤，中間連接較少,正常肌束結(jié)構(gòu)消失，這些改變均可導致肌細胞喪失正常的收縮功能，減弱了相互間的耦聯(lián)作用,進而導致逼尿肌收縮無力或無收縮[11]。

本實驗研究結(jié)果顯示：電刺激組相對于脊髓損傷組平滑肌較規(guī)則，形態(tài)及細胞體積明顯更接近于正常對照組，凋亡細胞減少，染色質(zhì)著色較輕，核固縮消失，肌胞內(nèi)細胞器腫脹緩解，細胞間間隙縮短，膠原纖維及彈性纖維減少，中間連接增多，胞突連接及縫隙連接減少，其上述改變與對照組逼尿肌超微結(jié)構(gòu)基本相近，并沒有發(fā)生病理改變，結(jié)果表明通過陽極阻滯電刺激骶神經(jīng)根可以重新建立膀胱逼尿肌失神經(jīng)支配，也解釋了陽極阻滯電刺激骶神經(jīng)根時膀胱內(nèi)壓可以接近正常組膀胱內(nèi)壓，排尿時逼尿肌收縮有力。

在本研究中，我們通過采用透射電鏡方法，發(fā)現(xiàn)長期陽極阻斷電刺激骶神經(jīng)根具有促進神經(jīng)原性膀胱逼尿肌超微結(jié)構(gòu)恢復的作用，穩(wěn)定膀胱內(nèi)壞境，改善膀胱排尿功能，但此過程中是否有逼尿肌神經(jīng)營養(yǎng)成分的參與,例如提供生長因子，改善細胞外內(nèi)環(huán)境成分等,有待進一步的實驗深入研究。