IL-21對(duì)慢性丙肝患者分泌IL-17和IFN-γ的調(diào)節(jié)作用

朱兵帥，朱明武

(1.漯河市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 漯河462000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 衛(wèi)輝453100)

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎，是導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因素[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約為3%，約2億人感染了HCV，每年新發(fā)病例約3.5萬例，嚴(yán)重危害著患者的生命健康，已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問題。據(jù)報(bào)道，宿主對(duì)HCV感染的免疫反應(yīng)異常是HCV感染的重要發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞因子在丙型肝炎免疫調(diào)控和免疫損傷中的作用越來越引起人們的重視[2-4]。Th1細(xì)胞分泌TNF-β、IFN-γ、IL-12等細(xì)胞因子，可以激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，增強(qiáng)機(jī)體清除病毒及感染的能力。Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的Th亞群，能分泌重要的炎癥介質(zhì)，如IL-27、IL-22等。本課題組擬先觀察慢性丙肝患者血清中的IL-12、IL-17、IFN-γ等的表達(dá)情況，然后再提取慢性丙肝患者PBMCs，進(jìn)行IL-21體外刺激，檢測(cè)IFN-γ、IL-17蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討IL-21對(duì)慢性丙肝患者的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象

2016年10月-2017年12月本院就診的HCV-IgG、HCV-RNA均陽(yáng)性的慢性丙肝患者58例，為病例組，其中男27例，女31例，年齡28-47歲，所有的入圍患者均符合慢性丙肝診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組：無償獻(xiàn)血者50例，其中男25例，女25例，年齡20-54歲，肝炎標(biāo)記物均為陰性，肝功能正常。隨機(jī)從病例組和對(duì)照組的研究對(duì)象中各選取20例，其中男女各10例，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。所有研究對(duì)象均知情同意，不同分組間的年齡、性別均無顯著性差異。

1.2研究方法

1.2.1血清細(xì)胞因子的檢測(cè) 所有入圍者空腹采集血液標(biāo)本3 ml，分離血清，-80℃保存，通過酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)集中檢測(cè)IL-12(試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技公司)、IL-17(試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司)、IL-18和IFN-γ(試劑盒購(gòu)自上海森雄科技實(shí)業(yè)公司)，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.2.2PBMCs的提取與培養(yǎng) 采集5 ml肝素抗凝靜脈血，2 h內(nèi)使用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque試劑購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)通過密度梯度離心法分離PBMCs，PBS洗滌2次，以RPMI1640(含有10%小牛血清)調(diào)配成2×106/ml的細(xì)胞懸液，接種于24 孔培養(yǎng)板，每份標(biāo)本接種6個(gè)孔，每孔1 ml，每孔含有PBMC 1×106個(gè)。

1.2.3PBMCs的分組培養(yǎng) 具體的分組情況：①無償獻(xiàn)血者的PBMCs組(正常組)；②IL-21與無償獻(xiàn)血者的PBMCs共培養(yǎng)組(正常+IL-21組)；③慢性丙肝患者的PBMCs組(丙肝組)；④IL-21與慢性丙肝患者的PBMCs共培養(yǎng)組(丙肝+IL-21組)。先在③組和④組的24孔板中加入25 mg/L絲裂霉素，處理1 h后，再把10 μg/L 的IL-21加入到②組和④組的24孔板中。每孔均加入1 mg/L的植物血凝素(PHA)，混勻后于37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后收集24孔板中的上清液，通過ELISA法集中檢測(cè)IL-17和IFN-γ水平。

2 結(jié)果

2.1慢性HCV感染者血液中的Th1/Th17類細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況

與健康獻(xiàn)血者相比，慢性HCV感染者血清IL-12和IFN-γ表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，IL-17明顯增高(P<0.01)，IL-18無顯著的變化,見表1。

表1 慢性HCV感染者與對(duì)照組血清IL-12、IL-17、IL-18和IFN-γ的比較

注：組間比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.2IL-21對(duì)慢性丙肝患者PBMCs分泌IL-17、IFN-γ的調(diào)節(jié)情況

IL-21可以調(diào)節(jié)PBMCs分泌IL-17、IFN-γ，但影響慢性丙肝患者分泌IL-17效果更明顯，促進(jìn)PBMCs分泌IL-17水平(約3.5倍)明顯優(yōu)于IFN-γ(約2倍)，見表2。

表2 IL-21誘導(dǎo)不同人群PBMCs分泌IL-17和IFN-γ的情況(pg/mL)

注：與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01。

3 討論

HCV 感染后，多數(shù)患者可以發(fā)展為慢性丙型肝炎。在HCV慢性化過程中，HCV 可以引發(fā)機(jī)體免疫損傷，Th細(xì)胞亞群(如Th1/Th2的平衡調(diào)節(jié))和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡對(duì)慢性丙型肝炎的進(jìn)展起著重要的作用[5,6]。Th17細(xì)胞是不同于Th1/Th2的另一個(gè)Th細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17等細(xì)胞因子，可與IL-6、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，調(diào)節(jié)固有免疫和細(xì)胞免疫，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[3,7]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎IL-17水平水平明顯高于正常對(duì)照組，說明IL-17在慢性丙型肝炎致病中起著重要作用。對(duì)于HCV的免疫治療，既要有效調(diào)動(dòng)體內(nèi)免疫殺滅病毒，同時(shí)也要避免過度免疫反應(yīng)而損傷自身的正常細(xì)胞。

IL-21是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的I型細(xì)胞因子，主要由CD4+T和活化的NKT細(xì)胞分泌，與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后可以分泌細(xì)胞因子、炎癥因子和趨化因子等，在病毒免疫和治療中可發(fā)揮重要作用[8]。Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HCV、HIV感染者CD8+T細(xì)胞殺傷作用減弱，IL-21可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，促進(jìn)Tfh細(xì)胞、Th17細(xì)胞增殖，負(fù)調(diào)Treg細(xì)胞的免疫抑制作用。Attridge等[10]發(fā)現(xiàn)，IL-21通過激活STAT-3信號(hào)通路，上調(diào)RORγt的表達(dá)，從而使記憶性CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞活化后分泌IL-17等細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-21刺激正常人群和慢性丙肝患者的PBMCs后，分泌IL-17、IFN-γ水平均增高，但慢性丙肝患者IL-17的增速(約3.5倍)遠(yuǎn)高于IFN-γ(約2倍)。IFN-γ主要由活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)產(chǎn)生，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤特性。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙肝患者血清IFN-γ水平降低，IL-21刺激PBMCs后，IFN-γ分泌的增速遠(yuǎn)不及IL-17。由于IFN-γ主要來源于Th1細(xì)胞，IL-17主要來源于Th17細(xì)胞，推測(cè)IL-21可能也參與了Th1/Th17的平衡調(diào)節(jié)，有待于從細(xì)胞水平繼續(xù)研究?？傊琁L-21的存在有助于控制HCV病毒的發(fā)展，降低肝細(xì)胞損傷。