南充產(chǎn)半夏的蛋白質(zhì)提取與鑒定研究

彭煜策 趙梅 吳淑菲 江玲 楊俊寶

摘 要：該文以南充產(chǎn)半夏的干燥塊莖為研究對(duì)象，采用植物活性蛋白質(zhì)提取試劑盒提取其總蛋白，通過(guò)用考馬斯亮藍(lán)快速染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，然后用12%的SDS-PAGE變性膠分析南充產(chǎn)半夏的蛋白質(zhì)組分，再用蛋白質(zhì)質(zhì)譜儀測(cè)定半夏蛋白質(zhì)的類型和分子量， 結(jié)果得到南充產(chǎn)半夏特有的兩種約22kD和15kD的含量較高的蛋白質(zhì)組分，且發(fā)現(xiàn)暫未被相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。這為南充產(chǎn)半夏組分的類型與功效的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：半夏 總蛋白 蛋白質(zhì)譜鑒定

中圖分類號(hào)：R282.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2018）06（c）-0223-03

半夏Pinellia ternata（Thunb）Breit具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效，有報(bào)道其蛋白質(zhì)有誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Bel-7402凋亡的作用[1]，半夏蛋白的種類和含量的差異可能是半夏品質(zhì)的一個(gè)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。南充是川產(chǎn)道地藥材川半夏的主產(chǎn)區(qū)，南充產(chǎn)半夏的藥用歷史悠久，國(guó)內(nèi)外馳名，商品成類球形、個(gè)大、粉性足[2]。本研究擬用試劑盒提取南充產(chǎn)半夏塊莖的總蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)快速染色法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，然后用12%的SDS-PAGE變性膠分析半夏蛋白質(zhì)的組分，同時(shí)用蛋白質(zhì)譜儀測(cè)定蛋白質(zhì)的類型和分子量，為南充產(chǎn)半夏組分的類型與功效的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

半夏鮮品采自四川南充， 洗凈后經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室鑒定為正品，然后烘干備用。

1.2 試劑

過(guò)硫酸銨（APS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、溴酚藍(lán)、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、一步法植物活性蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)于生工生物工程（上海）有限公司；蛋白Marker、考馬斯亮藍(lán)快速染色液購(gòu)于北京天根公司；實(shí)驗(yàn)用化學(xué)藥品均為分析純。

蛋白質(zhì)譜鑒定委托杭州景杰生物科技有限公司進(jìn)行，所用試劑由該公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 半夏總蛋白的提取

利用上海生工的“一步法植物活性蛋白質(zhì)提取試劑盒”提取半夏總蛋白。稱取20mg干燥的半夏塊莖，用研磨棒研磨成粉末，然后將粉末全部轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中。加入1mL的蛋白提取混合液，用研磨棒進(jìn)行研磨，直到看不見(jiàn)明顯的塊莖團(tuán)塊。然后將混合液渦旋震蕩2min，再4℃，8000rpm離心5min，使有機(jī)相和水相分層。最后將槍頭小心伸入到下層水相中，將含有半夏蛋白的下層水相吸出，轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL的離心管中，此下層水相中即含有半夏的可溶性蛋白，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 半夏蛋白的SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色

取10μL提取的半夏總蛋白液，加入2l 5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液緩慢混勻，金屬浴加熱5min，冰浴備用。將準(zhǔn)備好的蛋白樣品上樣到12% SDS-PAGE變性膠的加樣孔內(nèi)，先50V電泳25min，等樣品全部進(jìn)入分離膠以后80V 電泳60min。電泳結(jié)束后，將PAGE膠取下放入合適的容器中，加入50mL雙蒸水沒(méi)過(guò)膠面，加熱至沸騰后停止，在脫色搖床上搖動(dòng)5min，棄去水溶液。加入25mL考馬斯亮藍(lán)快速染色液，以浸沒(méi)膠面為準(zhǔn)，加熱至沸騰后保持沸騰狀態(tài)60sec，停止加熱，在脫色搖床上繼續(xù)搖動(dòng)5min，棄去染色液。然后加入約50mL雙蒸水，加熱至沸騰后保持沸騰狀態(tài)30sec，停止加熱后繼續(xù)在脫色搖床上搖動(dòng)8min，換水即完成脫色，觀察結(jié)果。

2.3 半夏蛋白的質(zhì)譜儀測(cè)定

另將半夏總蛋白按上述SDS-PAGE電泳方法，待樣品全部進(jìn)入濃縮膠即停止電泳，切下含半夏總蛋白的膠塊送杭州景杰生物科技有限公司進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定，操作方法如下所述。

2.3.1 膠內(nèi)酶解

將含有半夏總蛋白的膠條切碎，使用含50mmol/L碳酸氫銨（NH4HCO3）的50%乙腈（acetonitrile）進(jìn)行脫色。然后用100%的乙腈共同孵育5min以便將膠塊進(jìn)行脫水，然后棄去體系中的液相，再加入終濃度為10mmol/L的二硫蘇糖醇（dithiothreitol）溶液，37℃孵育60min。再次使用100%乙腈孵育脫水，移去液相后加入終濃度為55mmol/L的碘代乙酰胺（iodoacetamide），室溫避光孵育45min。之后使用終濃度為50mmol/L的碳酸氫銨清洗，再次使用100%乙腈孵育脫水。最后使用含有10ng/μL胰蛋白酶的50mmol/L碳酸氫銨重懸膠塊，冰上孵育1h。除去樣品中多余的溶液后，將膠塊在37℃酶解過(guò)夜。酶解后的肽段依次使用50%乙腈/5%甲酸和100%乙腈提取出膠塊，肽段溶液冷凍旋干后備用。

2.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析參數(shù)設(shè)置

肽段用含0.1%甲酸和2%乙腈的流動(dòng)相A溶解后，經(jīng)EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相B為含0.1%甲酸和98%乙腈的水溶液。液相梯度設(shè)置：15min25% B相；23min70%B相；28min80%B相，流速維持在800nL/min。

通過(guò)超高效液相系統(tǒng)分離后的肽段被注入到NSI離子源中進(jìn)行電離，然后用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus質(zhì)譜對(duì)肽段進(jìn)行分析。離子源的電壓設(shè)置為2.0kV，肽段母離子及其二級(jí)碎片都使用高分辨的Orbitrap進(jìn)行檢測(cè)和分析。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為350～1800m/z，掃描分辨率設(shè)置為70，000；Orbitrap掃描分辨率設(shè)置為17，500。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描（DDA）程序，即在一級(jí)掃描后選擇信號(hào)強(qiáng)度最高的前20個(gè)肽段母離子依次進(jìn)入HCD碰撞池使用28%的破碎能量進(jìn)行碎裂，同樣依次進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。為了提高質(zhì)譜的有效利用率，自動(dòng)增益控制（AGC）設(shè)置為5E4，信號(hào)閾值設(shè)置為5000ions/s，最大注入時(shí)間設(shè)置為200ms，串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為15秒以減少母離子的重復(fù)掃描。

2.4 數(shù)據(jù)搜庫(kù)

將得到的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 1.3進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置如下：數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置為UniProt Pinellia ternata （180條序列）；酶切方式設(shè)置為Trypsin/P；漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)置為2；一級(jí)母離子質(zhì)量誤差容忍度設(shè)置為10ppm；二級(jí)碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度設(shè)置為0.02Da；固定修飾設(shè)置為半胱氨酸烷基化；可變修飾設(shè)置為甲硫氨酸的氧化和蛋白N端的乙?；?；肽段離子打分要求高于20，鑒定結(jié)果peptide confidence設(shè)置為High。

3 結(jié)果與討論

3.1 半夏總蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果

將南充產(chǎn)半夏的總蛋白用12%SDS-PAGE電泳，并經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白質(zhì)組分，得到兩種約22kD和15kD的含量較高的蛋白質(zhì)組分（見(jiàn)圖1）。

3.2 半夏總蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合膠內(nèi)酶解和高分辨生物質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)膠條樣品中的蛋白混合物進(jìn)行分析，對(duì)半夏總蛋白樣品共鑒定到30個(gè)肽段，最終鑒定到7個(gè)蛋白，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 討論

半夏的干燥塊莖具有非常高的藥用價(jià)值，其主要含有生物堿、半夏蛋白、β-谷甾醇、氨基酸、多糖、揮發(fā)油及無(wú)機(jī)元素等多種成分，在這些化學(xué)成分中，半夏蛋白是抑菌、抗腫瘤和抗早孕等藥理作用的主要有效成分[3]。已有研究證實(shí)半夏凝集素是半夏蛋白的主要成分之一，其基因已被克隆，蛋白大小為29KD[4]。但是在半夏蛋白的提取過(guò)程中，鮮、干材料對(duì)半夏蛋白提取的質(zhì)量濃度有不同的影響[3]，這也是在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行染色時(shí)一些蛋白條帶濃度很低的原因。

本研究利用一步法植物蛋白提取試劑盒成功地提取了南充產(chǎn)半夏的總蛋白質(zhì)，通過(guò)用考馬斯亮藍(lán)快速染色法測(cè)定了半夏蛋白質(zhì)的濃度，然后用12%的SDS-PAGE變性膠分析蛋白質(zhì)組分大小和純度，最后委托杭州景杰生物公司用蛋白質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜數(shù)據(jù)根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索結(jié)果顯示，共鑒定出其中的7種已知蛋白，但含量豐富的約22kD和15kD的兩種蛋白質(zhì)組分沒(méi)有被鑒定出來(lái)。有研究證實(shí)，產(chǎn)于不同地方的半夏及半夏的混偽品中各自總蛋白的含量有比較明顯的差異[5]，這提示本研究中未鑒定出的這兩種組分可能是南充半夏具有的特異蛋白質(zhì)，亦或是序列結(jié)構(gòu)不清楚的兩種新蛋白，其性質(zhì)與功效有待進(jìn)一步深入地研究。

參考文獻(xiàn)

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