免疫熒光法檢測(cè)FSHR與GnRHR在胃癌組織中的分布及其共定位研究

馬玉濤 石文娜 李曉林

摘 要：目的 研究卵泡刺激素受體與促性腺激素釋放激素受體在胃癌組織中的定位、分布及共存性。方法 選取我院胃腸外科經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)的48例胃癌患者的病理組織石蠟包塊標(biāo)本，采用免疫熒光雙標(biāo)記定位方法檢測(cè)胃癌標(biāo)本中FSHR及GnRHR的定位及分布。結(jié)果 FSHR和GnRHR在胃癌組織細(xì)胞胞漿中均有分布，免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核呈陰性反應(yīng)，二者分布模式相同。結(jié)論 FSHR與GnRHR在胃癌組織中分布具有共存性，提示其可能對(duì)胃癌的病理發(fā)生機(jī)制具有重要的影響。

關(guān)鍵詞：卵泡刺激素受體；促性腺激素釋放激素受體；免疫熒光；胃癌

中圖分類號(hào)：R329；R735.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.022

文章編號(hào)：1006-1959（2018）23-0079-03

Abstract：Objective To investigate the distribution of follicle-stimulating hormone receptor（FSHR） and gonadotropin releasing horm- one receptor （GnRHR） colocalization with at the gastric cancer. Methods Using the immunity fluorescence double mark localization method to examine in 48 example stomach cancer specimen FSHR and the GnRHR localization and the distribution.Results FSHR and GnRHR organize in the cell cytoblastema at the stomach cancer to have the distribution，the immunity fluorescence responded the masculine material distributes in the cytoplasm， the cell nucleus assumes the negative reaction，the two distributed pattern is same. Conclusion FSHR and GnRHR organize the distribution at the stomach cancer to have the coexistence，it is suggested that it may have an important effect on the pathogenesis of gastric cancer.

Key words：Follicle-stimulating hormone receptor；Gonadotropin releasing hormone receptor；Immune fluorescence；Gastric cancer

卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是由腺垂體分泌的性激素，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族的跨膜糖蛋白，通過(guò)與其受體卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）結(jié)合后具有促進(jìn)排卵和精子的生成作用。FSHR是一種跨膜糖蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，近年實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)SHR 存在于人和動(dòng)物睪丸的支持細(xì)胞或卵巢顆粒細(xì)胞中，通過(guò)與FSH 特異性結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)雄性青春期生精細(xì)胞的啟動(dòng)、成年期生精過(guò)程的維持及雌性卵細(xì)胞各階段的發(fā)育[1]。FSHR在多種腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面呈高表達(dá)，提示FSHR可能是一種潛在的腫瘤標(biāo)志物。而作為卵泡刺激素上游激素的促性腺激素釋放激素（GnRH），通過(guò)其受體（GnRHR）調(diào)控著FSH的分泌，我們近期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)FSH及其受體也存在于胃癌組織中[2]，但作為其上游激素的GnRH是否存在于胃癌組織中以及GnRH對(duì)胃癌組織中存在的FSH的分泌調(diào)節(jié)影響是自分泌還是旁分泌，目前尚未有形態(tài)學(xué)依據(jù)。為此，我們對(duì)FSHR、GnRHR在胃癌組織中的分布及其是否存在共定位關(guān)系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析研究，為探討胃癌發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料 選取2015年1月～2018年1月山東省德州市人民醫(yī)院胃腸外科經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)的48例胃癌患者的病理組織石蠟包塊標(biāo)本，年齡41～77歲，平均年齡（49.00±4.72）歲，性別不限。參考世界衛(wèi)生組織（WHO）消化系統(tǒng)腫瘤（胃癌）分類，其中高分化18例，中分化7例，低分化23例。所有患者均為第1次手術(shù)，且術(shù)前未接受任何形式的放療和化療。并選48例癌旁組織作為對(duì)照。

1.2試劑及儀器

1.2.1試劑 FITC山羊抗小鼠及TRITC山羊抗兔抗體均為北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。兔抗FSHR抗體為上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供（貨號(hào)：ML 120641；規(guī)格 0.3 mg/ml），羊抗兔GnRHR抗體為空軍軍醫(yī)大學(xué)黃威權(quán)教授提供（規(guī)格：0.5 mg/ml）。丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（BAS）及（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APES）（規(guī)格：100 ml/瓶；貨號(hào)：KH550）購(gòu)自博士德生物工程公司（分裝規(guī)格：100 ml/瓶）。選用熒光試劑原料為異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）與四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC）。

1.2.2儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9162）購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋（HWS12）購(gòu)于上海一恒科技有限公司；石蠟切片機(jī)（SYD-S2010）沈陽(yáng)譽(yù)德電子儀器有限公司；顯微鏡（BX43）、攝像裝置（Moticam Pro 252）及成像軟件系統(tǒng)（Motic Images PFSus 2.0）均購(gòu)于奧林巴斯斯公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1切片制備 載玻片采用掛膠片，由有經(jīng)驗(yàn)的同一名技師進(jìn)行完整切片，切片厚度均為5 μm。

1.3.2免疫熒光定位及雙標(biāo)步驟 所有實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均按以下程序處理：①烤片：70 ℃恒溫培養(yǎng)箱烤片約3 h后原位放置2 h。②組織脫蠟和水化：二甲苯連續(xù)脫蠟（Ⅰa Ⅰb Ⅱa Ⅱb）各10 min；無(wú)水乙醇 、95%乙醇、 75%乙醇梯度脫二甲苯各 6 min，后分別用蒸餾水沖洗；③修復(fù)抗原：將配制好的EDTA修復(fù)液在微波爐上加熱，沸騰后將脫苯的組織切片放入高壓鍋中，上氣開(kāi)始記時(shí)2 min，關(guān)閉微波爐，冷卻至室溫；④血清封閉：取出切片蒸餾水沖洗后擦干，滴加 3%H2O2，濕盒內(nèi)常溫下靜置20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加正常羊血清，濕盒內(nèi)37 ℃ 孵育20 min；⑤一抗孵育：等體積Survivin與Ki67 工作液混合，甩去切片上清液，滴加混合一抗，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜；⑥二抗孵育：分別滴加TRITC標(biāo)記二抗工作液（FSHR/GnRHR 抗體）：次日晨8時(shí)將濕盒取出并恢復(fù)至室溫，將TRITC標(biāo)記山羊抗兔 IgG 以1∶100 稀釋，滴加至切片上，濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min；再滴加FITC標(biāo)記二抗工作液（FSHR/GnRHR 抗體）：玻片由濕盒取出拋去水滴自然晾干20 min，將FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 分別以1∶100/1∶150稀釋后滴加至標(biāo)本上，再次濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min，PBS連續(xù)沖洗3次，每次約3 min；⑦封片：自然晾干后用甘油配制的封片劑封片，4 ℃ 避光保存。

1.3.3激光掃描共聚焦顯微技術(shù) 利用激光掃描共聚焦顯微鏡分別觀察免疫標(biāo)記/雙標(biāo)記熒光染色結(jié)果并采集圖片，具體選擇參數(shù)參考如下：Laser Power：15 MW；Scanning Strength：30%；Stage Speed：2.0 mm/s；Iris：5.1；Gain：1083；Blev：-1；Z step：0.2；FITC的激光激發(fā)波長(zhǎng)在 480～495 nm之間，TRITC 的激光激發(fā)波長(zhǎng)在543～575 nm之間，保持上述信號(hào)在最佳實(shí)驗(yàn)條件下使雙標(biāo)圖像在同一平面上準(zhǔn)確排列。每張切片選取3個(gè)有代表性的區(qū)域，分別采集到紅色、綠色、紅/綠色疊加（或黃色）熒光照片。

2結(jié)果

FSHR、GnRHR在胃癌組織中的表達(dá)主要定位于胞漿、細(xì)胞核均未見(jiàn)免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)存在。綠色免疫熒光反應(yīng)物質(zhì)表示存在FSHR （見(jiàn)圖A、圖B）；紅色免疫熒光反應(yīng)物質(zhì)表示存在GnRHR （見(jiàn)圖C、圖D）；一些癌組織細(xì)胞漿既呈綠色熒光反應(yīng)（FSHR陽(yáng)性）又呈紅色熒光反應(yīng)（GnRHR陽(yáng)性），呈黃色或紅綠相間熒光表示同時(shí)存在FSHR和GnRHR（見(jiàn)圖E、圖F）。

3討論

20世紀(jì)70年代美國(guó)學(xué)者Folkman提出腫瘤生長(zhǎng)是血管依賴性的觀點(diǎn)后，人們對(duì)下丘腦-垂體-靶腺軸激素的分布及功能進(jìn)行了多學(xué)科寬領(lǐng)域的研究，尤其是GnRH及GnRHR、FSH及FSHR、黃體生成素（LH）及其受體（LHR）等。研究顯示FSHR不僅存在于卵巢癌細(xì)胞中，而且在肺癌、前列腺癌、胃癌等腫瘤中亦有分布表達(dá)，并可能參與了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等因子介導(dǎo)的腫瘤血管生成過(guò)程[4]。Radu A等[3]分別采用免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡法和原位雜交等方法檢測(cè)了FSHR在11種類型 1336 例人腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌、膀胱癌和腎癌等多種腫瘤均表達(dá)陽(yáng)性。并且檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FSHR主要表達(dá)于距腫瘤邊界約10 mm內(nèi)的新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中，而此范圍外的正常組織和細(xì)胞上均不表達(dá)FSHR。此外，良性病變組織如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性胰腺炎、普通外傷和克羅恩病等病變中均未檢測(cè)到FSHR的表達(dá)[4]。以上結(jié)論提示臨床上FSHR的分布可作為腫瘤界定范圍的依據(jù)[5]。同時(shí)可以看出FSHR 能有效區(qū)分腫瘤組織和正常組織包括炎癥組織的特性，顯示出其作為腫瘤體內(nèi)顯像劑和靶向腫瘤新生血管的潛在治療價(jià)值。FSHR由胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)及跨膜區(qū)三部分構(gòu)成， FSH與FSHR的胞外區(qū)相結(jié)合從而發(fā)揮作用。研究表明，F(xiàn)SH可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖侵襲及轉(zhuǎn)移，抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)卵巢上皮癌移植瘤生長(zhǎng)，并且FSH與腫瘤血管的生成密切相關(guān)[6]。FSHR與腫瘤血管生成的相關(guān)性，使其成為抗腫瘤血管生成治療及腫瘤診斷的潛在的新靶點(diǎn)。

GnRH最重要的生理功能是作為生殖系統(tǒng)的一種關(guān)鍵性神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，它由下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞合成，以脈沖方式分泌，經(jīng)下丘腦-垂體-門脈循環(huán)進(jìn)入垂體前葉，并特異地與垂體促性腺細(xì)胞膜上的高親和力受體結(jié)合，刺激FSH和LH的合成與釋放，進(jìn)而通過(guò)血液循環(huán)調(diào)節(jié)性腺類固醇激素的產(chǎn)生和配子發(fā)生。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)GnRH及GnRHR不僅僅局限于下丘腦-垂體-靶腺軸之內(nèi)，而且還廣泛存在于下丘腦-垂體-靶腺軸之外的一些器官組織，如胎盤、乳腺、前列腺等，并對(duì)其生理功能具有調(diào)節(jié)作用。在乳腺、前列腺、卵巢、胰腺[7]和肝發(fā)生的腫瘤細(xì)胞上也有GnRHR存在，并證明GnRH在某些腫瘤細(xì)胞能夠作為自分泌調(diào)節(jié)因子，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，如肝細(xì)胞癌具有自分泌GnRH的功能[8]。GnRH及GnRHR在多種腫瘤細(xì)胞系均有表達(dá)，并且調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的功能，而且很可能是通過(guò)自分泌機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞分化，其機(jī)制可能是GnRHR數(shù)目的調(diào)節(jié)可使之與不同的G蛋白耦聯(lián)，從而誘發(fā)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑繼而產(chǎn)生多種生理功能。萬(wàn)美珍[9]等通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)胃腺癌細(xì)胞表達(dá)GnRHR 說(shuō)明胃腺癌細(xì)胞能分泌GnRH及其受體，并且隨著腫瘤分化程度的升高GnRHR表達(dá)率明顯增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高、中分化程度的胃癌細(xì)胞GnRHR的染色強(qiáng)度明顯高于低分化胃癌細(xì)胞，這表明GnRHR主要參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增生與分化，高表達(dá)的GnRHR能抑制腫瘤細(xì)胞增生，促進(jìn)其凋亡，這為腫瘤治療提供了新的思路。以上觀點(diǎn)說(shuō)明GnRH能以旁分泌/自分泌的機(jī)制局部調(diào)節(jié)多膚類激素的分泌和類固醇激素的產(chǎn)生，并且多種內(nèi)源性因素如GnRH自身、類固醇激素、激活素和抑制素等影著GnRHR的轉(zhuǎn)錄水平和受體數(shù)量。GnRHR 在胃癌組織中表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、TNM分期及患者預(yù)后有關(guān)。不同分化程度的胃癌組織中GnRHR及EGFR 表達(dá)成一定的負(fù)相關(guān)，GnRHR通過(guò)調(diào)控EGFR 在胃癌的發(fā)生發(fā)展、分化及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)中我們觀察到GnRHR的免疫熒光信號(hào)分布不同，表明其在不同病理類型的胃癌組種種分布表達(dá)有差異的，形態(tài)學(xué)的證據(jù)說(shuō)明GnRHR對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展、分化及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中是有影響的。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光化學(xué)雙標(biāo)記定位方法首次發(fā)現(xiàn)胃癌組織GnRHR免疫反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞同樣呈FSHR免疫反應(yīng)陽(yáng)性。但是有少量細(xì)胞GnRHR免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性的呈FSHR免疫反應(yīng)陰性。此我們推測(cè)，由胃癌組織細(xì)胞產(chǎn)生的GnRH也可能通過(guò)自分泌和旁分泌途徑調(diào)節(jié)FSH的分泌，進(jìn)而調(diào)控胃癌組織細(xì)胞的病理生理功能。這個(gè)問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)的GnRHR免疫反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞中只有部分細(xì)胞呈FSHR免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性的現(xiàn)象可能是由于第一抗體敏感性不同，或可能胃癌組織本身存在FSHR和GnRHR表達(dá)部位上的差異，以及癌組織病理類型有關(guān)。

綜上所述，胃癌的發(fā)生發(fā)展與FSH及GnRH 有一定的聯(lián)系，且FSH可能是在GnRH與其受體結(jié)合后發(fā)揮作用的，胃癌組織中FSH的合成和釋放可能也受GnRH以自分泌和旁分泌的方式進(jìn)行調(diào)節(jié)。但目前尚不能得出肯定結(jié)論。至于機(jī)理或其傳導(dǎo)途經(jīng)如何需進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

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收稿日期：2018-9-1；修回日期：2018-9-12

編輯/肖婷婷