玉香參附湯對(duì)心臟驟停大鼠的心肌保護(hù)作用及對(duì)Nrf2、NQO1、HO-1表達(dá)的影響*

李 涵 姬廣輝 郭立杰 呂菲菲 關(guān) 杉

（中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京 100048）

心臟驟停是指由于循環(huán)衰竭導(dǎo)致心率驟停，是導(dǎo)致心臟性猝死的主要危險(xiǎn)因素。心臟驟停時(shí)，心臟由于喪失泵血功能導(dǎo)致機(jī)體處于缺血狀態(tài)，引起腦、心肌等組織器官因缺血缺氧發(fā)生病理性損傷［1］。及時(shí)有效地進(jìn)行心肺復(fù)蘇可一定程度逆轉(zhuǎn)該過(guò)程，然而臨床研究表明，復(fù)蘇成功率較低，患者遠(yuǎn)期預(yù)后效果差［2］。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激損傷、活性氧過(guò)度產(chǎn)生等可能參與缺血/再灌注所致心肌損傷的發(fā)生過(guò)程，心臟缺血缺氧可進(jìn)一步抑制心肌功能，導(dǎo)致活性氧、脂質(zhì)過(guò)氧化物等過(guò)度累積，加重?fù)p傷［3-4］。傳統(tǒng)中藥方劑玉香參附湯對(duì)心力衰竭患者有明顯的改善作用，包含其主要成分紅參和附片的參附益心顆粒可有效保護(hù)急性心梗大鼠心肌損傷，阻滯慢性心衰的發(fā)生［5］，但玉香參附湯對(duì)心臟驟停/心肺復(fù)蘇后大鼠心肌功能的作用尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建心臟驟停/心肺復(fù)蘇大鼠模型，觀察玉香參附湯對(duì)心臟驟停/心肺復(fù)蘇大鼠心肌損傷的影響并初步探討其機(jī)制，旨在探究其保護(hù)心臟驟停/心肺復(fù)蘇大鼠心肌損傷的分子機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠90只，體質(zhì)量（180～200）g，SPF級(jí)別，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）-2015-0002。所有研究用大鼠集中常規(guī)飼養(yǎng)于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，給予所有大鼠自由飲水、飲食，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有實(shí)驗(yàn)均遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 試藥與儀器 玉香參附湯（玉竹20 g，香加皮5 g，預(yù)煎紅參10 g，預(yù)煎制附子10 g，女貞子10 g，丹參15 g，桑寄生10 g，白前10 g），藥材購(gòu)于北京同仁堂藥店，每劑加入500 mL煎煮至150 mL，再次加水煎煮至150 mL，將兩次煎劑合并，熬制成膏狀（生藥含量2 g/mL），置于4℃冷藏備用。使用時(shí)采用0.9%氯化鈉注射液稀釋?zhuān)辔附o藥劑量按體表面積進(jìn)行換算得出。依拉達(dá)奉注射液（規(guī)格：20 mL，30 mg。 批號(hào) 20150133），購(gòu)自昆明積大制藥公司；蘇木素-伊紅HE染色試劑盒（貨號(hào) E607318）、蛋白定量試劑盒（貨號(hào) C600641），購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司；丙二醛（MDA）試劑盒（貨號(hào) S0131）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒（貨號(hào) S0073）、活性氧（ROS）試劑盒（貨號(hào) S0033）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒（貨號(hào) S0082）、超氧化歧化酶（SOD）試劑盒（貨號(hào)S0087），購(gòu)自碧云天公司；DAB顯色試劑盒，購(gòu)自中杉金橋公司；兔源一抗Anti-Nrf、Anti-NQO1、Anti-HO-1、Anti-GAPDH、Anti-Histone H3，羊抗兔二抗，購(gòu)自美國(guó)CST公司；石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司等。

1.3 分組與造模 按照隨機(jī)數(shù)字表法將90只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組，玉香參附湯低、中、高劑量組，依拉達(dá)奉組，每組15只。對(duì)除對(duì)照組外大鼠，按照文獻(xiàn)［6］采用交流電經(jīng)食管刺激誘導(dǎo)心室顫動(dòng)法復(fù)制心臟驟停模型，心臟驟停5 min后，開(kāi)始心肺復(fù)蘇，1 min時(shí)給予各大鼠靜脈注射腎上腺素（0.02 mg/kg），若無(wú)效則于4 min時(shí)重復(fù)心肺復(fù)蘇，5 min內(nèi)未成功復(fù)蘇大鼠為造模失敗，從備用大鼠中根據(jù)隨機(jī)原則補(bǔ)足各組例數(shù)。對(duì)照大鼠僅給予氣管插管，不誘導(dǎo)心臟驟停。術(shù)后正常給予常規(guī)飼養(yǎng)，記錄各組大鼠生存情況，持續(xù)觀察72 h。玉香參附湯低、中、高劑量組大鼠于術(shù)后當(dāng)日起，每日分別予玉香參附湯［5 mg/（kg·d）］、［10 mg/（kg·d）］、［20 mg/（kg·d）］灌胃治療，灌胃容積為 10 mL/500 g；依拉達(dá)奉組大鼠于術(shù)后當(dāng)天起，每日給予依拉達(dá)奉［5 mg/（kg·d）］灌胃治療，灌胃容積為 10 mL/500 g；對(duì)照組及模型組于術(shù)后當(dāng)天起，每日給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃，持續(xù)72 h后，給予各大鼠處分麻醉處死，立即取出大鼠心臟，洗凈后對(duì)稱(chēng)切半，一半切成1 cm大小3小塊后分成2份，一份用于ROS水平檢測(cè)，一份置于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片；一半切碎后分為2份，一份制備組織勻漿液，一份采用液氮速凍，轉(zhuǎn)至-80℃保存。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）HE法觀察心肌組織結(jié)構(gòu)：大鼠心肌組織切片進(jìn)行脫蠟、水化操作。采用蘇木素-伊紅（HE）試劑盒對(duì)切片染色，完成后以中性膠封閉玻片，采用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。2）心肌組織ROS水平測(cè)定：采用ROS試劑盒檢測(cè)大鼠心肌組織中ROS水平，以DCFH-DA標(biāo)記活性氧，陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光，以DAPI試劑標(biāo)記細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞呈藍(lán)色熒光，以紅色熒光細(xì)胞占藍(lán)色熒光細(xì)胞的比例評(píng)估心肌細(xì)胞中ROS水平。3）心肌組織MDA含量、CAT活性及SOD活性、GSH含量的測(cè)定：將大鼠心肌組織勻漿液取出，嚴(yán)格按照MDA檢測(cè)試劑盒、GSH檢測(cè)試劑盒、CAT檢測(cè)試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組大鼠心肌組織中MDA含量、GSH含量及CAT活性、SOD活性。 4）蛋白印記（WB）法檢測(cè) Nrf2、NQO1、HO-1 蛋白表達(dá)：將大鼠心肌冷凍組織充分研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒提取各組大鼠心肌組織中細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核總蛋白，采用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白總量后，煮樣，進(jìn)行SDS-凝膠電泳。電泳后采用半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉常溫封閉1 h；分別加入兔源一抗Anti-Nrf、Anti-NQO1、Anti-HO-1、Anti-GAPDH、Anti-Histone H3（1∶500），4℃孵育 6h；加入羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育30 min。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒處理后進(jìn)行檢測(cè)，Tanon軟件拍攝目的條帶圖像并進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)均以（±s）表示，多重比較行單因素方差分析，兩兩比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用“率”表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生存情況比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，模型組大鼠總存活時(shí)間顯著縮短、30 d存活率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，玉香參附湯低、中、高劑量組及依拉達(dá)奉組大鼠總存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）、30 d存活率明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠生存情況比較

2.2 各組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)比較 見(jiàn)圖1。對(duì)照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)規(guī)則、心肌細(xì)胞緊致排列、心肌纖維完整、排列規(guī)則。心臟驟停大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌纖維斷裂、排列紊亂，出現(xiàn)大量破碎、壞死和炎性細(xì)胞，呈現(xiàn)出病理?yè)p傷。玉香參附湯低、中、高劑量組及依拉達(dá)奉組大鼠心肌組織中病變細(xì)胞減少，心肌纖維趨于完整，損傷情況均有改善。

圖1 HE染色觀察玉香參附湯對(duì)心肌組織結(jié)構(gòu)的影響（HE 染色，20倍）

2.3 各組大鼠心肌組織ROS水平的比較 見(jiàn)圖2。與對(duì)照組比較，心臟驟停大鼠心肌組織中ROS陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量玉香參附湯組大鼠心肌組織中ROS陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌組織中ROS表達(dá)（DHE熒光，200倍）

2.4 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平的比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，其他各組心臟驟停大鼠心肌組織中MDA含量升高、GSH含量降低、CAT和SOD酶活減弱（P＜0.05）；與模型組比較，玉香參附湯低、中、高劑量組及依拉達(dá)奉組大鼠心肌組織MDA含量降低、GSH含量上升、CAT和SOD酶活增強(qiáng)（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠心肌組織中Nrf2、NQO1、HO-1表達(dá)的比較 見(jiàn)圖3，表3。與對(duì)照組比較，心臟驟停大鼠心肌組織NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞質(zhì)Nrf-2蛋白表達(dá)量顯著增高，細(xì)胞核Nrf-2蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，玉香參附湯低、中、高劑量組及依拉達(dá)奉組大鼠心肌組織NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量明顯增高（P＜0.05），細(xì)胞質(zhì)Nrf-2蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），細(xì)胞核Nrf-2蛋白表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織中MDA含量、GSH含量、CAT活性及SOD 活性比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織中MDA含量、GSH含量、CAT活性及SOD 活性比較（±s）

組 別 n對(duì)照組 1 5模型組 1 5依拉達(dá)奉組 1 5 M D A（m m o l/g） G S H（m m o l/g） C A T（U/m g） S O D（U/m g）2.6 5±0.4 4 1 5.4 6±3.0 5 2 6 9.1 7±2 1.1 5 1 6 9.4 3±2 4.3 5 6.9 7±1.2 9* 5.6 3±1.1 7* 1 7 8.7 5±1 8.3 2* 7 9.5 4±1 4.7 3*3.5 4±0.6 9*△ 1 1.4 9±2.1 2*△ 2 3 1.3 8±2 3.4 7*△ 1 2 3.3 6±2 2.3 8*△玉香參附湯低劑量組 1 5 5.2 7±1.0 3*△ 7.2 4±1.3 5*△ 1 8 9.2 3±2 2.5 6*△ 1 5 7.7 4±2 3.5 9*△玉香參附湯中劑量組 1 5 4.0 4±0.8 1*△※ 9.9 5±1.8 9*△※ 2 1 6.7 6±2 1.4 5*△※ 1 4 0.9 2±2 3.1 1*△※玉香參附湯高劑量組 1 5 3.1 2±0.6 2*△※◇ 1 2.4 8±2.5 3*△※◇ 2 4 5.2 7±2 3.3 5*△※◇ 1 2 1.4 5±2 3.3 2*△※◇

圖3 各組大鼠心肌組織Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠心肌組織中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量比較（±s）

組 別 n對(duì)照組 1 5模型組 1 5依拉達(dá)奉組 1 5 N Q O 1/G A P D H H O-1/G A P D H質(zhì)N r f/G A P D H 核N r f/H 3 1.0 8±0.1 9 1.1 7±0.0 9 0.5 1±0.1 1 1.5 4±0.2 5 0.4 9±0.0 9* 0.1 9±0.0 3* 1.4 7±0.3 1* 0.6 7±0.1 2*1.1 1±0.2 1*△ 1.2 3±0.1 3*△ 0.3 9±0.0 6*△ 1.2 3±0.2 4*△玉香參附湯低劑量組 1 5 0.6 5±0.1 1*△ 0.7 6±0.1 3*△ 0.6 9±0.1 3*△ 1.0 4±0.1 3*△玉香參附湯中劑量組 1 5 0.8 7±0.1 4*△※ 1.2 7±0.1 9*△※ 0.4 8±0.0 7*△※ 1.2 1±0.1 4*△※玉香參附湯高劑量組 1 5 1.1 6±0.2 2*△※◇ 1.3 5±0.2 1*△※◇ 0.2 0±0.0 5*△※◇ 1.6 1±0.3 6*△※◇

3 討 論

心臟驟停是臨床上一種非常危險(xiǎn)的急癥，具有高致死率、高致殘率的特點(diǎn)。心肺復(fù)蘇是臨床上針對(duì)心臟驟停的主要搶救措施。隨著醫(yī)療條件的提高和醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，心肺復(fù)蘇技術(shù)有了很快進(jìn)步，但復(fù)蘇成功率仍然很低，且后期易出現(xiàn)不同程度器官障礙等并發(fā)癥。其中心臟驟停時(shí)導(dǎo)致組織器官處于缺血缺氧狀態(tài)的時(shí)間長(zhǎng)短和心肺復(fù)蘇恢復(fù)機(jī)體自主循環(huán)時(shí)對(duì)組織器官造成的缺血/再灌注損傷程度密切相關(guān)［7］。心臟是人體的供血器官，心肌組織作為其重要組成部分，對(duì)缺血和缺血再灌注損傷十分敏感。本研究采用交流電經(jīng)食管刺激誘導(dǎo)心室顫動(dòng)法復(fù)制心臟驟停模型［6］。結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌細(xì)胞、心肌纖維排列紊亂，心肌纖維斷裂，出現(xiàn)大量破碎、壞死和炎性細(xì)胞，呈現(xiàn)出病理?yè)p傷，表明心臟驟停模型大鼠心肺復(fù)蘇后心肌表現(xiàn)出一定損傷癥狀。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠平均生存時(shí)間和30 d生存率均顯著低于對(duì)照組，提示心臟驟停/心肺復(fù)蘇大鼠復(fù)蘇存活率較低。

中藥玉竹、香加皮、紅參、制附子、丹參、白前等是玉香參附湯的主要藥效成分，具有活血通經(jīng)、散瘀通脈的功效［8］。玉香參附湯是在參附注射液的基礎(chǔ)上加以中藥玉竹、香加皮等配制而成。研究表明，參附注射液可有效改善心力衰竭患者心臟功能，增強(qiáng)常規(guī)西藥的治療效果［9］。顧偉等研究提示，參附注射液可通過(guò)調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的平衡改善心臟驟停/心肺復(fù)蘇豬的心室收縮功能，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，縮短心肺復(fù)蘇時(shí)長(zhǎng)，減輕心肌組織損傷，提示參附注射液具有一定的心肌保護(hù)作用［10］。本研究采用玉香參附湯作用心臟驟停/心肺復(fù)蘇大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉香參附湯治療可顯著改善大鼠心肌組織損傷程度，提示玉香參附湯具有改善心臟驟停大鼠心肌損傷的作用，但其作用機(jī)制尚不明確。

心肌組織中氧自由基等活性氧水平的升高是缺血/再灌注引起心肌損傷的主要原因之一，在心臟驟停損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［11］。正常情況下，機(jī)體內(nèi)環(huán)境中有少量ROS存在，參與正常生理代謝過(guò)程［12］。然而，當(dāng)心臟驟停發(fā)生時(shí)，心臟失去基本泵血功能，機(jī)體處于缺血缺氧的環(huán)境，機(jī)體可產(chǎn)生并積累大量氧自由基，同時(shí)，心肌損傷狀態(tài)下，心肌組織清除氧自由基的能力減弱，進(jìn)一步導(dǎo)致氧自由基等累積，過(guò)量活性氧可能與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、死亡，進(jìn)而導(dǎo)致組織器官功能障礙［13］。Abraham等發(fā)現(xiàn)，抑制心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白-相互作用激酶可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激抑制缺血性心臟病引起的心肌損傷和心室不良重構(gòu)［14］。Wang等發(fā)現(xiàn)，黃芩可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制心肌細(xì)胞缺血/再灌注所致細(xì)胞凋亡，保護(hù)機(jī)體損傷［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，心臟驟停大鼠心肌組織ROS陽(yáng)性細(xì)胞比例增加、MDA含量升高、GSH含量降低、CAT和SOD酶活減弱；玉香參附湯治療后，與模型組比較，低、中、高劑量玉香參附湯組大鼠心肌組織中ROS陽(yáng)性細(xì)胞比例減少、MDA含量降低、GSH含量升高、CAT和SOD酶活增強(qiáng)，表明玉香參附湯治療可增強(qiáng)心臟驟停大鼠對(duì)活性氧的清除能力，降低機(jī)體中ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，提示玉香參附湯可能通過(guò)減輕氧化損傷程度保護(hù)心臟驟停/心肺復(fù)蘇所致大鼠心肌損傷。

研究表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷與核轉(zhuǎn)錄因子（Nrf2）/血紅素氧合酶 1（HO-1）信號(hào)通路密切相關(guān)［16］。研究發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白以與Keap1蛋白結(jié)合的無(wú)活性形式存在，受到活性氧等刺激時(shí)，Nrf2發(fā)生磷酸化后與Keap1脫離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，活化后的Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)NADH脫氫酶1（NQO1）、HO-1等抗氧化酶的基因表達(dá)，提高機(jī)體抗氧化損傷的能力［17-18］。Liu等發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素可通過(guò)抑制Nrf2等蛋白表達(dá)，抑制活性氧所致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡和壞死［19］。Zhang等發(fā)現(xiàn)，黃連素可能通過(guò)抑制Nrf2通路激活，減輕活性氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎組織損傷［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，心臟驟停/心肺復(fù)蘇后，大鼠心肌組織NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量降低，Nrf-2蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)移量減少；玉香參附湯治療后，與模型組比較，低、中、高劑量玉香參附湯組大鼠心肌組織NQO1、HO-1蛋白表達(dá)量升高，Nrf-2蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)移量增多，表明玉香參附湯可能通過(guò)促進(jìn)Nrf-2蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)移進(jìn)而促進(jìn)其下游NQO1、HO-1等蛋白表達(dá)保護(hù)心臟驟停/心肺復(fù)蘇所致大鼠心肌損傷。

綜上所述，玉香參附湯可能通過(guò)促進(jìn)Nrf-2、NQO1、HO-1蛋白表達(dá)，減輕心肌組織氧化應(yīng)激，實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟驟停/心肺復(fù)蘇所致心肌損傷的保護(hù)作用。