通腑化痰法對急性腦出血大鼠肝細胞凋亡的影響及對應(yīng)激性肝損害的保護作用*

王 威 馬 迪 杜泓森 侯季秋 黃樂曦 趙海濱

（北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

急性腦出血多發(fā)于老年患者，其病死率及致殘率 極高。是目前威脅人類生命和健康的首要神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有數(shù)據(jù)顯示在我國急性腦出血占腦卒中發(fā)病率21%～48%［1］，全球范圍內(nèi)急性腦出血占腦卒中發(fā)病率10%～15%［2］。急性腦出血應(yīng)激性肝損害的發(fā)生率很高，而且具有極強的隱蔽性。肝臟是嚴重應(yīng)激損傷的核心靶器官，也是引起和加重原發(fā)病并致死的至關(guān)重要的因素［3］?，F(xiàn)代研究顯示，肝臟病變機制中肝細胞凋亡起著重要的作用，因此可以認為肝細胞凋亡是造成肝臟損傷和肝臟疾病的中心環(huán)節(jié)。本試驗建立SD大鼠腦出血模型，檢測各組、各時相點大鼠肝功能水平、肝組織病理學(xué)改變及大鼠肝細胞凋亡率，遵循中醫(yī)學(xué)“急則治其標”的原則，應(yīng)用通腑化痰法，以細胞凋亡為切入點，探討通腑化痰法對急性腦出血大鼠肝細胞凋亡的影響其及對應(yīng)激性肝損害的保護作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（300±20）g，24只，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗動物中心提供。動物許可證：SCXK（京）2012-0001。室內(nèi)溫度（23±2）℃，大鼠自由飲食和攝水。

1.2 藥物與試劑 中藥星蔞承氣湯：由北京康仁堂中藥有限公司提供復(fù)方顆粒劑（藥物組成：大黃6 g，芒硝6 g，瓜蔞 12 g，枳實 8 g，膽南星 12 g，丹參 18 g）。Ⅶ型膠原酶（Sigma），TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司）。

1.3 分組與造模 大鼠腦出血模型制備：參照朱文煥等報道的方法復(fù)制腦出血模型［4-5］。取大鼠以10%水合氯醛行腹腔麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，定位參照《大鼠腦立體定位圖譜》［6］，頭頂備皮后消毒，暴露大鼠前囟并以此為中點，向右旁開4 mm，向后旁開1 mm，于顱骨表面處鉆直徑1 mm的小孔，用微量注射器抽取0.5 μL膠原酶，在立體定向儀引導(dǎo)下緩慢垂直注入腦組織5 mm，時間5 min左右，停留2 min，之后緩慢退針，縫合頭皮切口。分組與給藥：取SD大鼠24只按隨機數(shù)字表法分為4組，每組6只，即正常對照組、腦出血模型組、通腑化痰組及葡醛內(nèi)酯組。各組分別于腦出血術(shù)后3個時相點處死動物并留存標本。除正常對照組外，其余各組大鼠復(fù)制腦出血模型。各組大鼠術(shù)前2 d開始灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，術(shù)前2 h加灌1次，各組大鼠術(shù)后每天灌胃1次，3個時相點處死前2 h加灌1次。

1.4 標本采集與檢測 1）肝功能檢測：于各時相點分別腹主動脈取血，肝功能檢測由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科完成，采用日立7180全自動生化儀，試劑購自中生北控生物科技有限公司。2）肝組織病理檢測：于各時相點取血后，冰上打開腹腔，分離取材肝右后葉組織。大鼠肝組織以4%多聚甲醛溶液固定24 h以上，石蠟包埋，制備6 μm組織切片，進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理情況。3）細胞凋亡檢測：運用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，脫氧三磷酸尿嘧啶缺口末端標記法（TUNEL），具體檢測流程嚴格按照Roche公司試劑盒步驟進行操作，DAB顯色，后脫水透明，封片，鏡下觀察凋亡細胞。凋亡細胞的判定以顯微鏡下細胞核呈棕黃色著色為陽性細胞，未染成棕色為陰性細胞。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0 for windows統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間計量資料比較采用單因素方差分析檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肝功能檢測結(jié)果比較 見表1，表2。通腑化痰組、葡醛內(nèi)酯組及腦出血模型組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）水平均有不同程度的升高，與正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），但通腑化痰組及葡醛內(nèi)酯組可明顯降低大鼠血清ALT、GOT水平，與腦出血模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。葡醛內(nèi)酯組與通腑化痰組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠各時相點血清GOT、ALT水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠各時相點血清GOT、ALT水平比較（mmol/L，±s）

與正常對照組同時間點比較，△P＜0.05，▲P＜0.05，*P＜0.01；與腦出血模型組同時間點比較，△▲P＜0.05，▲P＜0.05；與通腑化痰組同時間點比較，▲P>0.05

組別 時間 G O T A L T正常對照組 2 4 h 7 1.5 3±6.9 8 3 6.1 5±1 1.7 2（n＝5） 4 8 h 7 6.3 1±6.9 2 2 7.5 2±4.5 5 7 2 h 7 6.4 2±7.5 6 3 8.2 9±6.5 2腦出血模型組 2 4 h 1 3 4.2 4±4.1 2* 1 1 9.7 1±4 0.1 1*（n＝5） 4 8 h 1 3 3.0 5±4.5 6* 6 0.3 8±7.8 8*7 2 h 1 3 1.7 4±4.3 5* 5 6.5 7±1 0.2 3*通腑化痰組 2 4 h 8 4.8 7±2.7 5#△ 4 1.7 8±1 1.1 9#△（n＝5） 4 8 h 8 6.4 6±4.3 9#△ 3 8.9 2±7.2 7#△7 2 h 8 1.8 5±1.4 1#△ 4 2.7 6±1 0.1 2#△葡醛內(nèi)酯組 2 4 h 8 1.7 3±3.2 6#△▲ 4 3.2 6±6.3 5#△▲（n＝5） 4 8 h 8 3.2 6±4.3 2#△▲ 4 1.2 1±1 0.3 9#△▲7 2 h 7 7.7 9±4.2 8#△▲ 4 4.2 7±7.4 2#△▲

表2 各組大鼠各時相點肝組織每視野細胞AI比較（±s）

表2 各組大鼠各時相點肝組織每視野細胞AI比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.01，#P＜0.01；與腦出血模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.05

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2.2 各組肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果比較 見圖1。肝組織病理檢測顯示，正常對照組大鼠肝組織表面光滑肝且邊緣整齊，肝細胞組織結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則有序，無變性壞死等情況出現(xiàn)。腦出血模型組見肝臟組織結(jié)構(gòu)不完整，肝細胞出現(xiàn)水腫變性、壞死，炎性細胞浸潤。通腑化痰組和葡醛內(nèi)酯組較腦出血模型組病變明顯減輕，肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，炎性細胞浸潤現(xiàn)象出現(xiàn)較少。

圖1 各組鼠肝組織病理學(xué)的影響（HE染色，100倍）

2.3 各組TUNEL檢測肝組織凋亡指數(shù)比較 見表2,圖2。經(jīng)TUNEL檢測后，正常對照組大鼠肝組織僅見少量細胞凋亡，腦出血模型組各時相點均可見較多凋亡細胞，48 h可見凋亡細胞達到高峰，經(jīng)通腑化痰法干預(yù)后，各時相點TUNEL陽性細胞明顯減少，肝細胞凋亡數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；葡醛內(nèi)酯組肝細胞凋亡數(shù)與通腑化痰組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 各組大鼠肝組織細胞凋亡（20倍）

3 討 論

急性腦出血是臨床上最常見的一種腦血管疾病，其國內(nèi)發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升之勢，具有較高的致殘率、致死率及復(fù)發(fā)率［7］。病情發(fā)展過程較快，臨床上易出現(xiàn)缺血性腦損傷情況并遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙。隨著我國社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展，人口老齡化水平不斷增加，腦出血疾病的患者人數(shù)也呈逐年增長趨勢，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，給社會及廣大患者家庭帶來沉重的負擔(dān)［8］。急性腦出血的發(fā)生機理多為腦組織損傷、全身炎癥反應(yīng)等，因此應(yīng)以緩解炎癥反應(yīng)、降低顱內(nèi)壓、減輕腦水腫及預(yù)防繼續(xù)出血為主要治療原則［9］。當(dāng)急性腦出血出現(xiàn)應(yīng)激狀況時，機體受到外源性或感染毒性物質(zhì)損傷，引起初期炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機體產(chǎn)生內(nèi)源性免疫炎性因子形成“瀑布效應(yīng)”，創(chuàng)傷后腸道菌群易位和內(nèi)毒素入血循環(huán)至肝臟，可損害肝細胞［10］。肝臟是人體內(nèi)各種營養(yǎng)代謝和儲存的總樞紐，也是機體調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的核心場所，最易受到炎性反應(yīng)侵襲，并且在應(yīng)激反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。肝細胞凋亡是各種病因?qū)е赂螕p傷后，引起的肝臟疾病的早期病變，是基因控制下的肝細胞自主而有序地凋亡［11］。肝細胞凋亡是調(diào)節(jié)肝組織正常細胞更新、增殖及再生的重要機制，如果肝細胞過度凋亡會引起肝功能的衰竭，與此同時也是造成肝臟損傷以及肝臟疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由此可見，肝細胞凋亡是肝臟實質(zhì)發(fā)生損傷的最直接的證據(jù)，抑制肝細胞凋亡是防治急性腦出血后應(yīng)激性肝損害的有效途徑，因此本試驗中將其作為觀察指標，探討通腑化痰法對調(diào)節(jié)肝細胞凋亡的作用及對腦出血肝損害的保護機制。

中風(fēng)總屬本虛標實，急性期以標實為主，主要誘因為卒然臥倒，氣機壅滯；情志不遂，氣機不暢；多食油膩、飲食不節(jié)等，多由痰熱閉竅、痰熱瘀阻等證轉(zhuǎn)變而來，痰、瘀、風(fēng)、火互結(jié)為主要病機，氣血逆亂，而致臟腑功能異常，邪實蘊而發(fā)熱阻滯于中腑，故以血瘀痰熱腑實證者多見，所以治療上適宜用通腑化痰法?！督饏T要略·中風(fēng)歷病脈證并治篇》中云“風(fēng)引湯，除熱癱癇”［12］，方中大黃為其主藥，意在通腑。《中藏經(jīng)》有記載“人病中風(fēng)偏枯，其脈數(shù)，而面干黑黧，手足不遂，語言謇澀，治之奈何？在上則吐之，在中則瀉之……瀉謂通其塞也，補謂益其不足也”［13］，明確提出通瀉之法可治療中風(fēng)病?，F(xiàn)代研究證實，通腑化痰法應(yīng)用于中風(fēng)急性期，通過腦腸軸機制而抑制炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)血液流變學(xué)，改善新陳代謝，避免機體在應(yīng)激的狀態(tài)下遭受全身性炎性反應(yīng)侵害［14］。本研究遵循了中醫(yī)學(xué)“急則治其標”的原則，抓住“痰熱腑實”，以細胞凋亡為切入點，應(yīng)用通腑化痰法，選用星蔞承氣湯，探討中醫(yī)藥對急性腦出血應(yīng)急性肝損害的干預(yù)機制及保護作用，為防治腦出血應(yīng)激性肝損害提供重要途徑。

本實驗結(jié)果顯示，通腑化痰組血清ALT、GOT水平與腦出血模型組相比顯著降低。ALT和GOT主要分布于肝臟中，當(dāng)肝細胞損害嚴重時ALT和GOT釋放入血［15］，血清轉(zhuǎn)氨酶活性是肝細胞損傷的敏感指標之一。星蔞承氣湯可有效降低大鼠血清中ALT、GOT水平，明顯減輕肝組織結(jié)構(gòu)改變，減少炎性細胞浸潤現(xiàn)象，表明通腑化痰法對急性腦出血大鼠應(yīng)激性肝損害具有一定的保護作用。肝細胞凋亡廣泛存在于各種原因?qū)е碌母螕p傷的病理過程中，是細胞死亡的主要表現(xiàn)形式之一。在本實驗中，通過各組大鼠TUNEL陽性細胞比較可見，腦出血模型組各時相點均可見較多凋亡細胞，48 h可見凋亡細胞達到高峰，經(jīng)通腑化痰法干預(yù)后，各時相點TUNEL陽性細胞明顯減少，肝細胞凋亡數(shù)比較有明顯差異?，F(xiàn)代研究證實，運用中醫(yī)藥治療急性肝損害能夠調(diào)節(jié)機體的免疫功能、保護肝臟細胞、改善腸道菌群失調(diào)、調(diào)節(jié)機體微循環(huán)［16］，還能夠抑制全身炎癥反應(yīng)，對抗內(nèi)毒素血癥，最終可以改善患者的臨床癥狀，提高疾病的生存率［17］。本研究結(jié)果顯示，通腑化痰法能夠明顯降低急性腦出血大鼠肝損害細胞凋亡數(shù)，實驗取得了較好的效果，由此可推測中藥可能通過清除內(nèi)環(huán)境中毒素、免疫復(fù)合物及炎性物質(zhì)等作用，可以有效抑制炎癥因子的釋放及肝細胞凋亡，改善肝組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)，減輕急性腦出血肝臟損傷的程度，提高肝功能水平，對急性腦出血應(yīng)激性肝損害具有保護作用。本實驗為通腑化痰法中藥治療急性腦出血應(yīng)急性肝損害提供有效的理論依據(jù)及新的治療思路。