輪作與連作對(duì)煙田土壤微生物區(qū)系及多樣性的影響

張笑宇,段宏群，王悶靈，李紅麗，蘆阿虔，王 巖

(1.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省洛陽(yáng)市煙草公司，河南 洛陽(yáng) 471000)

煙草是一種易產(chǎn)生連作障礙的農(nóng)業(yè)作物，隨著栽培年限的延長(zhǎng)，連作障礙愈來(lái)愈顯著，長(zhǎng)期烤煙連作對(duì)煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量都會(huì)產(chǎn)生很大影響[1-2]。輪作不僅是土壤耕作管理的重要措施，而且屬于生態(tài)防治土傳病害的范疇。在烤煙生產(chǎn)上，合理輪作既可以減輕土傳病害，又可以達(dá)到增產(chǎn)提質(zhì)的目的。

土壤中存在的大量微生物對(duì)于土壤營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)、植物的生長(zhǎng)發(fā)育和作物病蟲(chóng)害防治等方面均起著極其重要的作用，同時(shí)土壤生物學(xué)性狀可以反映土壤質(zhì)量和肥力特征，是評(píng)價(jià)土壤健康的重要生物學(xué)指標(biāo)[3]，土壤微生物群落對(duì)土傳病害的抑制能力是土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡、健康和穩(wěn)定的另一個(gè)重要指標(biāo)[4-5]。以往對(duì)于煙草不同種植模式的研究主要關(guān)注土壤養(yǎng)分、煙草農(nóng)藝性狀等變化[6-8]，對(duì)于根際土壤微生物區(qū)系的研究較少，同時(shí)對(duì)土壤微生物的研究大多采用傳統(tǒng)平板涂布分析方法，此方法僅能分離出不到1%的土壤微生物，而現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為不可培養(yǎng)微生物分析提供了有利的手段，具有檢測(cè)限低、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。因此，論文采用高通量測(cè)序技術(shù)，研究連作和輪作對(duì)煙田根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、分布特征等的影響，明確煙田根際土壤微生物群落的變化規(guī)律，為利用生物技術(shù)提高煙田土壤健康的措施提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 煙田概況與材料

在充分調(diào)研的基礎(chǔ)上，2016年在洛陽(yáng)市洛寧縣羅嶺鄉(xiāng)講理村和上戈鎮(zhèn)上坡村，選取長(zhǎng)期輪作的煙田(玉米-煙草)Ro和連續(xù)種煙5年的煙田CC5。該煙區(qū)的主要土傳病害是黑脛病、根腐病和根結(jié)線蟲(chóng)病，并且這3種病害易并發(fā)，因此，本研究過(guò)程在對(duì)煙田土傳病害進(jìn)行調(diào)研時(shí)，將這3種病害進(jìn)行合并統(tǒng)計(jì)。洛寧煙區(qū)4～9月平均溫度21.75℃，合計(jì)降水量425.56 mm，日照時(shí)間1 699.16 h，平均相對(duì)濕度75.31%，試驗(yàn)田概況和土壤基本性狀如表1和表2所示。分別于移栽前、旺長(zhǎng)期和成熟期采樣，按蛇型5點(diǎn)取樣法，取0～20 cm根際土壤，采用四分法將土壤混勻并編號(hào)[9]，將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室處理：部分風(fēng)干過(guò)篩用于土壤理化性狀測(cè)定，部分置于4℃冰箱保存，用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)微生物數(shù)量；部分裝離心管-20℃冷凍保存，委托生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)土壤微生物多樣性進(jìn)行測(cè)定和分析。

表1 試驗(yàn)田概況

表2 煙田土壤理化性狀

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定方法

用常規(guī)方法測(cè)定土壤pH值和含水率；用重鉻酸鉀-油浴法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)；用硫酸消解-凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮；用乙酸銨提取-火焰光度法測(cè)定土壤速效鉀；用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤有效磷；用堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮[10]。

1.2.2 可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測(cè)定

土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量采用稀釋平板法[11]:細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌用孟加拉紅培養(yǎng)基；放線菌用高氏1號(hào)培養(yǎng)基。

1.2.3 微生物多樣性分析測(cè)定

土壤樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行高通量多樣性測(cè)序分析。土壤樣本經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，利用試劑盒提取DNA。對(duì)提取到的DNA利用瓊脂糖電泳檢測(cè)，檢查DNA的完整度，利用檢測(cè)試劑盒精確定量基因組DNA，確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。以全部基因組DNA為模板，細(xì)菌16S rDNA引物分別為341F和805R；真菌18S rDNA引物分別為NS1和Fung，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用瓊脂糖回收試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行回收。

OTU數(shù)表示煙田根際土壤中檢測(cè)到的物種數(shù)量。香濃指數(shù)衡量群落之間的差異性， Chao1指數(shù)是計(jì)算得到的土壤微生物物種總數(shù)[8]。

在本試驗(yàn)分析中，屬水平和門水平群落結(jié)構(gòu)分布圖只顯示了物種豐度占比的前10位。

聚類樹(shù)狀圖通過(guò)樹(shù)枝結(jié)構(gòu)直觀地反應(yīng)多個(gè)樣本間的相似度和差異關(guān)系。

1.2.4 煙株發(fā)病情況調(diào)查

在煙株成熟期，按照GB/T 23222—2008煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法調(diào)查各小區(qū)煙株(每個(gè)小區(qū)調(diào)查100株)的病害發(fā)生情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2013和SPSS 21軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多樣性基因測(cè)序由公司相應(yīng)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪作和連作煙田根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的變化

在煙株生長(zhǎng)的過(guò)程中，輪作和連作煙田根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量結(jié)果如表3所示。由表3可知，煙田根際土壤中細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量移栽前均較少，旺長(zhǎng)期明顯增多，且放線菌的增幅遠(yuǎn)高于細(xì)菌和真菌，到成熟期可培養(yǎng)微生物數(shù)量又有不同程度的下降。這主要是由于旺長(zhǎng)期溫度適宜，煙株根系生長(zhǎng)旺盛,根系分泌物增加，從而導(dǎo)致可培養(yǎng)微生物數(shù)量顯著增長(zhǎng)[12]；成熟期煙株根系活力下降,根系分泌物減少，甚至分泌一些有毒物質(zhì)[13-14]，不利于微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致成熟期微生物數(shù)量下降。從表3還可知，在煙株生長(zhǎng)過(guò)程中，輪作煙田根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌的數(shù)量均高于連作煙田，且在旺長(zhǎng)期細(xì)菌呈現(xiàn)顯著性差異。細(xì)菌是土壤中優(yōu)勢(shì)微生物，在土壤環(huán)境中對(duì)物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化起主要作用，放線菌則可改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，代謝產(chǎn)物中含有生長(zhǎng)激素，且放線菌產(chǎn)生的抗生素能抑制病原菌，控制病蟲(chóng)害發(fā)生[15]。因此，輪作煙田根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量的提高對(duì)抑制土傳病害具有重要的意義。該輪作和連作煙田之間可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌的變化趨勢(shì)與李鑫等[16]的研究一致。輪作煙田根際土壤中可培養(yǎng)真菌在移栽前高于連作煙田，但未達(dá)到顯著性差異，到旺長(zhǎng)期和成熟期則低于連作煙田，說(shuō)明連作煙田根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)從細(xì)菌型逐漸向真菌型轉(zhuǎn)化，與張仕祥等[17]研究結(jié)果相同。

表3 煙田根際土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量 (104cfu/g干土)

注：不同的小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同煙田根際土壤微生物Alpha多樣性分析

Alpha多樣性也稱為生境內(nèi)物種多樣性，關(guān)注均勻生境下的物種數(shù)目[18]。利用Alpha多樣性分析中的OTU數(shù)、香濃指數(shù)和Chao1指數(shù)分析煙田根際土壤中微生物的多樣性。輪作煙田和連作煙田根際土壤微生物Alpha多樣性的結(jié)果如表4所示。

表4 煙田根際土壤微生物Alpha多樣性分析

由表4可知，在煙株生長(zhǎng)過(guò)程中，輪作煙田根際土壤細(xì)菌的OTU數(shù)、香濃指數(shù)和Chao1指數(shù)均高于連作煙田。輪作煙田在移栽前真菌群落OTU數(shù)、香濃指數(shù)和Chao1指數(shù)均高于連作煙田；旺長(zhǎng)期輪作煙田真菌群落OTU數(shù)高于連作煙田，香濃指數(shù)和Chao1指數(shù)則低于連作煙田；成熟期輪作煙田真菌群落OTU數(shù)、香濃指數(shù)高于連作煙田，而Chao1指數(shù)低于連作煙田。對(duì)Alpha多樣性分析可知，相較于煙草連作，輪作能夠提高微生物群落多樣性，與之前賈志紅等[19]的研究一致。

2.3 不同煙田根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似度分析

聚類樹(shù)狀圖反應(yīng)多個(gè)樣本間的相似度和差異性，輪作和連作煙田根際土壤微生物在屬水平上的群落聚類樹(shù)狀圖如圖1所示。

圖1不同煙田根際土壤微生物群落在屬水平上的聚類樹(shù)狀圖

從圖1a可以看出，移栽前輪作和連作煙田根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似，旺長(zhǎng)期和成熟期不同土壤之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)則存在較大的差異性。隨著煙株生長(zhǎng)，輪作和連作煙田根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨于相似，而與移栽前差異較大。圖1b真菌群落結(jié)構(gòu)相似度的變化趨勢(shì)與細(xì)菌一致。

2.4 不同煙田根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分布規(guī)律

微生物在門水平上不同種植模式煙田根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布如圖2。輪作和連作煙田根際土壤優(yōu)勢(shì)菌門是Proteobacteria(變形菌門)，相對(duì)豐度在30.98%～54.84%，其次為Acidobacteria(酸桿菌門)相對(duì)豐度在10.35%～23.24%、Actinobacteria(放線菌門)相對(duì)豐度4.52%～10.51%。輪作煙田中Proteobacteria相對(duì)豐度在煙株生長(zhǎng)過(guò)程中的變化趨勢(shì)與可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)一致，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，旺長(zhǎng)期達(dá)到最高。

根據(jù)多樣性測(cè)序結(jié)果可知，移栽前輪作煙田與連作煙田根際土壤微生物在屬水平上分別檢測(cè)出細(xì)菌543類和429類，旺長(zhǎng)期分別為421類和350類，成熟期分別為359類和369類。

不同種植模式煙田根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布如圖3所示，煙株生長(zhǎng)發(fā)育的3個(gè)時(shí)期中Gp6、Gemmatimonas(芽單胞菌屬)、Sphingomonas(鞘脂單胞菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)、Citrobacter(檸檬酸細(xì)菌屬)均為優(yōu)勢(shì)菌屬。輪作和連作煙田上述6種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬在移栽前的相對(duì)豐度分別占19.66%和21.85%，旺長(zhǎng)期分別占30.95%和26.53%，成熟期分別占33.55%和26.01%，表明輪作和連作根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在屬水平上的差異較小，但在旺長(zhǎng)期和成熟期土壤優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度要高于移栽前。

圖2 不同種植模式煙田根際土壤細(xì)菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

圖3 不同種植模式煙田根際土壤細(xì)菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

從圖3中還可知，在旺長(zhǎng)期輪作煙田根際土壤中相對(duì)豐度為14.22%的Citrobacter，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于連作煙田(相對(duì)豐度為3.01%)。有文獻(xiàn)表明Citrobacter作為益生菌能夠抑制番茄青枯病的發(fā)生[20]。因此，推斷Citrobacter對(duì)煙草土傳病害的發(fā)生也存在一定的抑制作用。Sphingomonas是土壤主要有益菌之一，可促進(jìn)煙株根際吸收營(yíng)養(yǎng)，抵抗多種病原菌，還有研究表明，鞘脂單胞菌屬中某些菌株具有固氮和脫氫特性，在維持土壤氮平衡方面起著重要作用[21]。輪作煙田根際土壤中Sphingomonas的相對(duì)豐度隨著煙株生長(zhǎng)逐漸增加，并且高于連作煙田。旺長(zhǎng)期和成熟期輪作煙田根際土壤中Pseudomonas(假單胞菌屬)豐度也高于連作煙田，Pseudomonas可抑制煙草黑脛病病原菌[22]，Serratia(沙雷氏菌屬)作為有益菌屬[23]也只存在于輪作煙田土壤中。

兩種不同種植模式煙田根際土壤真菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布如圖4所示。煙田根際土壤優(yōu)勢(shì)菌門有Ascomycota(子囊菌門)，相對(duì)豐度為15.40%～77.80%，其次是Basidiomycota(擔(dān)子菌門)，相對(duì)豐度為6.53%～33.28%，Cercozoa(絲足蟲(chóng)類)相對(duì)豐度為1.85%～45.06%。移栽前煙田根際土壤中Ascomycota相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于旺長(zhǎng)期和成熟期，這也解釋了真菌群落聚類樹(shù)狀圖移栽前與旺長(zhǎng)期和成熟期真菌群落結(jié)構(gòu)差異性較大的原因。另外，輪作煙田旺長(zhǎng)期和成熟期根際土壤中Ascomycota和Basidiomycota的相對(duì)豐度均高于連作煙田。

圖4 同種植模式煙田根際土壤真菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

根據(jù)多樣性測(cè)序結(jié)果，移栽前輪作煙田與連作煙田根際土壤真菌在屬水平上分別檢測(cè)出250類和246類，旺長(zhǎng)期分別為226類和199類，成熟期分別為235類和209類。

不同種植模式煙田根際土壤真菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布如圖5所示，移栽前輪作和連作煙田根際土壤的優(yōu)勢(shì)真菌屬是Penidiella、Gibberella、Setomelanomma、Protostelium，總相對(duì)豐度分別占54.88%和64.25%。旺長(zhǎng)期輪作煙田根際土壤優(yōu)勢(shì)真菌屬是Conocybe、Cryptococcu、Aspergillus、Penidiella、Gibberella、Pleospora，相對(duì)豐度占52.78%，連作煙田優(yōu)勢(shì)真菌屬為Rhogostoma、Pythium、Spizellomyces、Cystofilobasidium、Setomelanomma、Amb-18S-1092、Sterigmatomyces、Vermamoeba，相對(duì)豐度共占69.43%。成熟期輪作煙田根際土壤優(yōu)勢(shì)真菌屬為Conocybe、Penicillium、Turbinellus、Penidiella、Thielavia、Microascus、Brachyconidiellopsis，相對(duì)豐度共占40.39%，連作煙田優(yōu)勢(shì)真菌屬為Amb-18S-1092、Zoophagus、Sterigmatomyces、Vermamoeba、Pythium、Pseudogymnoascus、Absidia、Cystofilobasidium、Thielavia，相對(duì)豐度共占62.64%。由此可見(jiàn)，煙株移栽前輪作和連作煙田之間優(yōu)勢(shì)真菌屬的種類和相對(duì)豐度差異較小，但進(jìn)入旺長(zhǎng)期和成熟期后優(yōu)勢(shì)真菌屬則出現(xiàn)較大差異。

從圖5中還可以看出，輪作煙田根際土壤中有益菌Conocybe[24-25]在旺長(zhǎng)期和成熟期的相對(duì)豐度分別為19.09%、14.28%，遠(yuǎn)高于連作煙田，有研究表明，對(duì)青枯病病原菌有拮抗效果的真菌屬Aspergillus在旺長(zhǎng)期相對(duì)豐度也高于連作煙田[26]。而Pythium作為根腐病的病原菌所在屬[27-28]，只存在于連作煙田中。

圖5 不同種植模式煙田根際土壤真菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布圖

3 結(jié)論與討論

本文測(cè)定分析了玉米-煙草輪作煙田與煙草連作煙田根際土壤微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在煙株生長(zhǎng)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量均呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，并在旺長(zhǎng)期達(dá)到最大。輪作煙田根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌數(shù)量高于連作煙田。輪作煙田根際土壤可培養(yǎng)真菌的數(shù)量低于連作煙田，表明煙草連作導(dǎo)致了土壤微生物結(jié)構(gòu)從細(xì)菌型向真菌型的轉(zhuǎn)化。利用分子生物學(xué)方法研究輪作與連作煙田根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，輪作煙田根際土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性均高于連作煙田，煙草連作使得土壤微生物的群落趨向單一化。通過(guò)對(duì)微生物聚類樹(shù)狀圖分析發(fā)現(xiàn)，輪作和連作煙田在旺長(zhǎng)期和成熟期微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，進(jìn)一步對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析發(fā)現(xiàn)，輪作煙田根際土壤中有益細(xì)菌如Citrobacter、Sphingomonas、Pseudomonas、Serratia等相對(duì)豐度均高于連作煙田。旺長(zhǎng)期和成熟期輪作煙田真菌在門水平上Ascomycota和Basidiomycota相對(duì)豐度高于連作煙田，在屬水平上Conocybe(錐蓋傘屬)、Aspergillus(曲霉屬)等拮抗菌相對(duì)豐度也高于連作煙田，而在連作煙田根際土壤中出現(xiàn)Pythium(腐霉屬)病原菌屬，該菌屬在輪作煙田中并未出現(xiàn)。