體外模擬消化維生素C和鈣軟糖的動力學研究

徐曉飛，鐘浩權(quán)，劉瑋，夏晚霞,3，楊繼國,3

（1.維樂維營養(yǎng)與健康研究中心，廣東廣州 510623）(2.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東東莞 523808)

（3.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

隨著人們對健康、營養(yǎng)的需求增加，功能性保健食品的生產(chǎn)和消費逐年增長。傳統(tǒng)的保健食品劑型多為片劑和膠囊等藥物劑型，片劑輔料較多，硬膠囊的“毒膠囊”事件帶來了不少負面影響[1]。此外，片劑、囊等藥物劑型在使用時給消費者帶來一定的心理負擔，不利于建立長期的消費習慣。而食品形態(tài)的保健食品，如軟糖、飲料、粉劑，能給消費者帶來功效利益的同時，也可以滿足口味上的需求。因此，近年來以咀嚼形態(tài)出現(xiàn)的保健食品新劑型陸續(xù)在市場上出現(xiàn)，其中具有代表性的是營養(yǎng)軟糖。營養(yǎng)軟糖是一種含糖的凝膠體[2]，含有維生素或功能因子，能夠促進人體健康，具有某種調(diào)節(jié)人體特定生理功能，對人體不會產(chǎn)生不良反應的軟糖，既能滿足人們對口味、口感的外在需求，又能滿足人們對營養(yǎng)與保健的需求，因此功能性營養(yǎng)保健軟糖的開發(fā)與研究成為科研工作者和生產(chǎn)企業(yè)研發(fā)人員的研究熱點[3]，如橙皮保健軟糖[4]，甘草保健軟糖[5]，火龍果保健軟糖[6]和青梅營養(yǎng)保健軟糖[7]等。隨著年輕一代逐漸成為營養(yǎng)保健食品的主流消費人群，他們厭倦了傳統(tǒng)藥片形態(tài)的產(chǎn)品，希望在獲得健康好處的同時，也能享受到營養(yǎng)保健食品的美味。營養(yǎng)軟糖恰恰具有這種特性，是日常保健、甚至疾病治療的一個非常好的選擇，也是一種新趨勢。

目前，研究人員對功能軟糖的研究主要關注在各種新型功能的軟糖及生產(chǎn)工藝[8,9]，而對于軟糖的消化特性和其中的功效成分在消化過程中的釋放情況卻鮮有報道。本實驗利用智能崩解儀分別對市售鈣軟糖和維生素C軟糖在體外模擬胃液的消化及功效成分的溶出特性進行研究，并以相同功效成分的片劑和硬膠囊作為參照。此外，考慮到消化過程中往往伴隨含膳食成分，因此初步探究膳食成分如淀粉、蛋白質(zhì)和油脂對軟糖中功效成分釋放的影響，為保健軟糖的消化吸收特點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胃蛋白酶（1:1000）和胰酶（1:4000），合肥博美生物有限公司；甲醇（色譜純），天津科密歐化學試劑有限公司；維生素C軟糖（維樂維健康產(chǎn)業(yè)有限公司市售產(chǎn)品）、鈣軟糖（維樂維健康產(chǎn)業(yè)有限公司市售產(chǎn)品）及含鈣、維生素C的膠囊和片劑（實驗室自制）。軟糖及其參照樣品的主要功效成分如表 1（功效成分含量依據(jù)國家標準方法進行檢測，分別獨立檢測 3次）。

實驗中所用到的其他普通試劑，如鹽酸，磷酸二氫鉀，氫氧化鈉，氧化鑭，硝酸等均為分析純，水為超純水。

表1 軟糖及其對照品的功效成分含量Table 1 Content of active ingredients in gummy and its control products

1.2 儀器與設備

LB-2D智能崩解時限測試儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；高效液相色譜儀Waters Alliance e2695、附紫外檢測器，美國Waters科技有限公司；AA700型原子吸收分光光度計，日本島津公司；Star精密型臺式pH測量儀，美國賽默飛科技有限公司；高效冷凍離心機3K15，德國Sigma公司；EVO 18掃描電子顯微鏡，德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 軟糖、片劑和膠囊崩解時限測定

人工胃液按照《中國藥典》2015年版的描述方法配制。按照《中國藥典》2015年版第四部崩解時限檢查法測定軟糖、片劑和膠囊的崩解時限。

1.3.2 軟糖、片劑和膠囊在模擬胃液中的消化特性

體外模擬消化方法參考文獻[10,11]報道，具體實驗步驟如下：將軟糖剪碎成大小約5 mm×5 mm×5 mm的小塊放入50 mL離心管中，片劑和膠囊直接放入50 mL離心管中；離心管中加入 10 mL人工胃液，在37 ℃、150 r/min搖床中避光消化2 h；分別在消化5，10，15，30，45，60，90，120 min 時取樣 20 μL，然后補充相同體積相同溫度的胃液；取出的消化樣品立刻加入0.1 mL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液以終止消化,并置于沸水浴中煮沸10 min以滅酶活，4000 r/min離心10 min，上清液稀釋，后過0.45 μm濾膜，濾液供后續(xù)測試?？瞻讓φ战M為人工胃液。實驗平行進行 3次。軟糖在胃液中功效成分的累計釋放率通過（1）式計算：

式中：Cn為第n次取樣時釋放體系中的成分濃度，μg/mL；V為釋放體系的總體積，mL；Ci為第i次取樣時體系中的成分濃度，μg/mL；Vs為每次取樣的體積，mL；m 為樣品中的成分總含量。

1.3.3 功效成分測定方法

1.3.3.1 維生素C的測定

參照GB 5009.86-2016食品中抗壞血酸的測定。流動相：A：6.8 g磷酸二氫鉀和0.91 g十六烷基三甲基溴化銨，用水溶解并定容至1 L（用磷酸調(diào)pH至2.5～2.8）；B：100%甲醇。按A∶B=98∶2混合，過0.45 μm濾膜，超聲脫氣。色譜條件：流動相流速：0.7 mL/min；色譜柱溫度：25 ℃；檢測波長：265 nm；進樣體積：20 μL。標準曲線：y=0.00002x+0.2832；R2=0.9997。

1.3.3.2 鈣的測定

參照GB 5009.92食品中鈣的測定。采用AA700型原子吸收分光光度計鈣的含量。儀器條件：波長：422.7 nm；狹縫：1.3 nm；燈電流：5～15 mA；空氣流量：9 L/min；乙炔流量：2 L/min。標準曲線：y=23.002x-1.4353；R2=0.9989。

1.3.4 軟糖掃描電鏡觀察

將維生素C和鈣軟糖在胃液中消化15 min后，切1 mm薄片，置于冷凍干燥機內(nèi)凍干48 h備用。制備是將樣品固定在樣品臺上，采用離子濺射方法鍍金（15 kV、15 mA、1.5 min）。測試時將樣品置于掃描電鏡中，加速電壓20 kV，然后觀察并拍攝樣貌。

1.3.5 膳食成分對軟糖在模擬胃液中消化特性的影響

軟糖剪碎成5 mm×5 mm×5 mm的小塊，將小塊軟糖和對照品放入50 mL離心管中，加入10 mL人工胃液，分別加入5%（W/W）淀粉、5%大豆蛋白、5%大豆油，消化2 h后測定功效成分的釋放率。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1 軟糖及其對照品在胃液中的消化

崩解時限是片劑、膠囊和滴丸制劑的重要控制指標，反映了制劑在模擬胃液中樣品完整性破壞所需要的時間[12]。崩解實驗結(jié)果顯示，片劑和膠囊的崩解時限均在10 min以內(nèi)，軟糖的崩解時限比片劑和膠囊長（p＜0.001）。不同結(jié)構(gòu)組成的軟糖崩解時限差別較大，維生素C軟糖的崩解時限較長，為155 min，鈣軟糖則在22 min已崩解完全。

崩解時限代表在模擬胃液中樣品完整性破壞所需要的時間。軟糖在崩解的過程中，其包裹的功效成分逐步釋放。本研究采用體外模擬消化法分別對鈣軟糖和維生素C軟糖功效成分的釋放特性進行研究，并與的片劑和膠囊劑進行對比。考慮到胃排空時間為2 h，因此考察功效成分2 h內(nèi)在模擬胃液中的釋放特性。

圖2，3分別為維生素C軟糖和鈣軟糖及其對照品在模擬胃液中的消化濃度和釋放率，結(jié)果顯示，片劑在10 min內(nèi)功效成分釋放完全，結(jié)合崩解實驗結(jié)果，表明片劑在10 min結(jié)構(gòu)完全崩解，功效成分完全釋出。而膠囊在前5 min膠殼尚未崩解，不釋放成分，在5～10 min內(nèi)膠殼崩解，其內(nèi)功效成分快速溶出至釋放完全。

圖1 維生素C軟糖(a)和鈣軟糖(b)及其對照品的崩解時限Fig.1 Release time of calcium gummy (a), vitamin C gummy (b)and control products

圖2 維生素C軟糖及其對照品在胃液中的消化濃度（a）和累積釋放率（b）Fig.2 Digestive concentration (a) and cumulative release rate (b)of vitamin C gummy and its control in gastric juice

軟糖體外模擬消化實驗結(jié)果顯示，維生素C軟糖功效成分在2 h內(nèi)逐步釋放，2 h內(nèi)維生素C的釋放率為93.6%。鈣軟糖功效成分釋放相對較快，在30 min釋放率達100%。可見，鈣軟糖的釋放速度比維生素C軟糖快。研究結(jié)果表明，軟糖的釋放比片劑和膠囊緩慢，并且軟糖結(jié)構(gòu)不同，釋放速度差別較大。維生素C軟糖的崩解時限和在模擬胃液中的完全釋放時間超過了2 h，表明其在模擬胃液中具有一定的緩釋特性。

圖3 鈣軟糖及其對照品在胃液中的消化濃度（a）和釋放率（b）Fig.3 Digestive concentration (a) and cumulative release rate (b)of calcium gummy and its control in gastric juice

2.2 軟糖微觀結(jié)構(gòu)表征和功效成分的釋放動力學擬合方程

圖4 維生素C（a）軟糖和鈣軟糖（b）的掃描電鏡圖Fig.4 SEM image of vitamin C gummy (a) and calcium gummy(b)

為了更深入研究軟糖在胃液中的釋放原理，本研究對軟糖在消化中的微觀結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果如圖 4所示，兩種軟糖膠體都呈現(xiàn)基本的膠體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的形態(tài)并不相同，維生素C軟糖膠體的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)比較致密、網(wǎng)架粗、交聯(lián)點多，而鈣軟糖膠體的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)比較疏松、網(wǎng)架細、交聯(lián)點少。在消化過程中，功效成分從膠體網(wǎng)絡骨架中釋出。兩種軟糖的骨架材料不同，其中維生素C軟糖為明膠和瓊脂交聯(lián)而成，而鈣軟糖由純明膠制成，由此形成了不同的膠體網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，因此認為兩種軟糖骨架結(jié)構(gòu)上的不同影響了功效成分的消化釋放速度。軟糖膠體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以包裹活性成分，保持功效成分的穩(wěn)定性，通過膠基的恰當選擇，可以減緩溶出速度，達到緩釋的目的。緩釋制劑克服了片劑和膠囊劑功效成分進入體內(nèi)后濃度波動較大，出現(xiàn)“峰谷”現(xiàn)象的缺點，能夠維持功效成分平緩的吸收，避免濃度波動較大而帶來的不良反應[13,14]。理想的控釋制劑體外釋放速率應符合零級動力學過程，即恒速釋放，但在實際控釋制劑的研制中，由于制劑的緩釋性能受多種因素的影響，能夠達到零級釋放的卻很少見。

圖5 維生素C軟糖（a）和鈣軟糖(b)在模擬胃液中的釋放動力模型擬合Fig.5 Release dynamics model fitting of vitamin C gummy (a)and calcium gummy (b) in gastric juice

對溶出擴散或骨架擴散體外釋放通常用零級動力學模型(Q=a+bx)，一級動力學模(ln(1-Q)=a+bx)，Higuchi模型(Q=a+bx1/2)擬合[15,16]，本研究中利用origin對軟糖的功效成分釋放進行零級動力學、一級動力學和Higuchi三種模型擬合，來建立軟糖中有效成分在模擬胃液中釋放動力學方程，結(jié)果如圖5及表2所示。相關系數(shù)R2數(shù)值顯示（表2），維生素C軟糖的模擬釋放動力以Higuchi的擬合效果最好，符合骨架型緩釋制劑規(guī)律，而鈣軟糖的釋放動力則以一級動力擬合最佳，這可能是因為鈣軟糖的膠體為明膠及其用量所決定。由此推測軟糖在模擬胃液中有效成分的釋放過程中，即軟糖消化時，首先在固液界面之間形成一功效成分飽和層，擴散層的物質(zhì)因濃度差擴散進入溶媒，形成溶液，消化過程表現(xiàn)在固液界面進行溶解作用和隨后功效成分的擴散，模擬胃液的釋放過程如圖6所示。

表2 軟糖功效成分釋放動力學模型擬合Table 2 The kinetic model fitting of the release active components of gummy

2.4 膳食成分對軟糖消化特性的的影響

軟糖在食用消化過程中，往往會與其他膳食成分一起被消化，因此考察了膳食成分淀粉、蛋白質(zhì)、油脂在消化過程中對軟糖中功效成分釋放的影響。圖7a，c顯示，當模擬胃液中含有5%淀粉時，維生素C軟糖的崩解時限增加（p＜0.01），模擬胃液中含有5%蛋白質(zhì)、5%油脂時，維生素 C軟糖的崩解時限與純胃液相比沒有顯著性差異。

此外，消化2 h后，維生素C軟糖在含5%淀粉的胃液中維生素 C的釋放率比純胃液中明顯降低（p＜0.001）。這可能是因為淀粉在模擬胃液中可形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從而減緩了軟糖的消化速度。從圖7b，d中可以看出，含5%淀粉、5%蛋白質(zhì)和 5%油脂的胃液對鈣軟糖的消化特性均沒有顯著影響，這可能是鈣軟糖在模擬胃液中崩解速率比較快。

圖7 膳食成分對維生素C軟糖（a）和鈣軟糖（b）崩解時限的影響；膳食成分對維生素C軟糖（c）和鈣軟糖（d）釋放度的影響Fig.7 Effects of dietary components on release time of vitamin C gummy (a) and calcium gummy (b); effects of dietary components on release rate of vitamin C gummy (a) and calcium gummy (b)

3 結(jié)論

本實驗采用體外模擬消化法分別對鈣軟糖和維生素C軟糖、片劑和膠囊的消化釋放特性進行研究。與片劑、膠囊相比（10 min），軟糖崩解時限明顯延長，特別是維生素C軟糖，其崩解時限達到155 min，鈣軟糖的崩解時限為22 min。軟糖的功效成分在模擬胃液中釋放特性也不同于傳統(tǒng)的片劑與膠囊劑，維生素C軟糖功效成分在2 h內(nèi)逐步釋放，2 h內(nèi)維生素C的釋放率為93.6%。鈣軟糖功效成分釋放相對較快，在30 min內(nèi)完全釋放。兩種軟糖的釋放動力學模型擬合結(jié)果表明，維生素C軟糖的釋放動力以Higuchi的擬合效果最好，符合骨架緩釋制劑釋放規(guī)律，而鈣軟糖的釋放動力則以一級動力擬合最佳。模擬胃液中含5%淀粉時會減緩維生素C軟糖成分的釋放，其它膳食成分對其釋放沒有顯著影響。鈣軟糖在模擬胃液中的消化釋放特性不受膳食成分的影響。