氟康唑聯(lián)合鹽酸氨溴索對白色念珠菌影響與機制分析

孫相民 高華榮

[摘要] 目的 分析氟康唑聯(lián)合鹽酸氨溴索對白色念珠菌影響及相關(guān)可能機制。 方法 依據(jù)藥物敏感檢測方案，使用微量稀釋法來檢測鹽酸氨溴索與氟康唑單獨使用和聯(lián)合使用對耐藥白色念珠菌與敏感白色念珠菌體外抗真菌影響，使用抑菌濃度指數(shù)與生長差異百分比模型對兩種藥物聯(lián)合抗真菌影響要過進(jìn)行評價;使用羅丹明6G當(dāng)做氟康唑熒光代替物，流式細(xì)胞儀檢測鹽酸氨溴索對耐藥白色念珠菌的藥物轉(zhuǎn)運泵影響情況。 結(jié)果 FICI評價聯(lián)合用藥抗白色念珠菌時，對CA8和CA4表征是無關(guān)，對CA16和CA10表征為協(xié)同;△E評價聯(lián)合用藥抗白色念珠菌時，對CA8和CA4表征是拮抗，對CA16和CA10表征是協(xié)同;在Rh6G吸收和Rh6G外排實驗實驗中，隨著時間增加，鹽酸氨溴索組熒光強度均高于對照組，且鹽酸氨溴索外排量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 氟康唑聯(lián)合鹽酸氨溴索對抵抗耐藥白色念珠菌體外影響顯著，其影響機制可能為鹽酸氨溴索對抗真菌藥物轉(zhuǎn)運泵活性抑制有聯(lián)系。

[關(guān)鍵詞] 耐藥白色念珠菌;氟康唑;鹽酸氨溴索;協(xié)同作用

[中圖分類號] R96? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2018）08（c）-0125-03

Effect of Fluconazole and Ambroxol Hydrochloride on Candida Albicans

SUN Xiang-min， GAO Hua-rong

Department of Pharmacy， Peking University Medical Hospital， Zibo， Shandong Province， 255400 China

[Abstract] Objective To analyze the effects of fluconazole and ambroxol hydrochloride on Candida albicans and its possible mechanisms. Methods According to the drug sensitivity testing program， the microdilution method was used to detect the antifungal effects of ambroxol hydrochloride and fluconazole alone and in combination on resistant Candida albicans and Candida albicans in vitro. The antibacterial concentration index was used. The percentage of growth difference model evaluated the effect of the two drugs combined with antifungal; Rhodamine 6G was used as a substitute for fluconazole fluorescence， and the effect of ambroxol hydrochloride on the drug delivery pump of resistant Candida albicans was detected by flow cytometry . Results FICI evaluation of the combination of anti-Candida albicans against CA8 and CA4 characterization is irrelevant， CA16 and CA10 characterization of synergy; △ E evaluation of the combination of anti-Candida albicans against CA8 and CA4 antagonism， CA16 and CA10 characterization was synergistic; in the Rh6G uptake and Rh6G efflux experiments， the fluorescence intensity of the ambroxol hydrochloride group was higher than that of the control group over time， and the abundance of ambroxol hydrochloride was lower than that of the control group， with statistical significance （P<0.05）. Conclusion Fluconazole combined with ambroxol hydrochloride has a significant effect on resistance to Candida albicans in vitro. The mechanism may be related to the inhibition of antifungal drug transport pump activity by ambroxol hydrochloride.

[Key words] Resistance to Candida albicans; Fluconazole; Ambroxol hydrochloride; Synergy effect

近些年來，伴隨著器官移植、惡性腫瘤及獲得性免疫缺陷綜合征患者逐年增多，免疫抑制劑與廣譜抗菌藥物廣泛使用及患者機體內(nèi)留置導(dǎo)管等技術(shù)快速發(fā)展，造成臨床侵襲性真菌感染對患者發(fā)病與死亡率激增，尤其是念珠菌屬與曲霉菌屬所引發(fā)感染[1-4]。因此，該文通過分析氟康唑聯(lián)合鹽酸氨溴索對白色念珠菌影響，為臨床真菌感染患者治療提供一些借鑒。

1? 資料與方法

1.1? 實驗材料

菌株為CA4、CA16、CA10及CA8（該院臨床分離菌株），菌株都經(jīng)過分離純化，生理生化法鑒別，在﹣70℃冰箱內(nèi)保存。

1.2? 主要試劑與儀器

試劑、藥品：磷酸鹽緩沖液、鹽酸氨溴索、碳酸氫鈉、氟康唑、瓊脂粉、酵母膏、葡萄糖。儀器：Spectra Max190酶標(biāo)儀、取菌環(huán)、可調(diào)式移液器、SC-329常溫冰箱、G-560E旋渦混合器、AB-204-N電子天平、超凈工作臺、手提電熱消毒器。

1.3? 制備藥物母液和培養(yǎng)基

YPD瓊脂培養(yǎng)基：8.0 g蛋白胨粉末、8.0 g瓊脂粉末、8.0 g葡萄糖粉末和4.0 g固體酵母膏，蒸餾水400 mL，置入500 mL錐形瓶內(nèi)，加熱融合，備用;氟康唑母液：0.064 g氟康唑粉末，放入25 mL瓶內(nèi)，加水溶解，配制為2560 g/mL濃度氟康唑母液，保存于4℃冰箱內(nèi);鹽酸氨溴索母液：0.256 g鹽酸氨溴索粉末，放入50 mL瓶內(nèi)，加入溶解，配制為5120 g/mL濃度母液，保存于4℃冰箱內(nèi)。

1.4? 抗真菌作用評測和評價方法

（1）抗真菌評測：微量稀釋法;

（2）評價方法：①FICI模型：以LA理論作為基礎(chǔ)，使用96孔無菌微孔板，在培養(yǎng)以后，對80%以上真菌生長抑制最低藥物的濃度作為MIC，經(jīng)過部分抑菌濃度指數(shù)（FIC）判別互相影響;②△E模型以△E（每孔內(nèi)真菌的生長率）作為數(shù)據(jù)、BI理論作為基礎(chǔ)綜合分析，△E=E1×E2-E聯(lián)用，E1和E2為兩種藥物單獨使用真菌生長率，E聯(lián)用是兩種藥物聯(lián)合使用真菌生長率。若SYN與ANT加是正值，兩種藥物有協(xié)同影響，加是負(fù)值，兩種藥物有拮抗影響。

1.5? 實驗方法

①菌株傳代：將菌種由冰箱內(nèi)取出解凍，并接種至TPD瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，35℃養(yǎng)育24 h，選取狀態(tài)較好菌落再次傳菌兩次，養(yǎng)育24 h;配置濃度是4.5×106 CFU/mL菌液母液。YPD液體培養(yǎng)基將菌液稀釋10倍，培養(yǎng)對數(shù)生長期細(xì)胞，3 500 rmp離心10 min后采集真菌細(xì)胞，PBS洗滌3次，菌液濃度調(diào)整成1×107 CFU/mL，搖床內(nèi)震蕩1 h，耗竭細(xì)胞能量，用于外排與Rh6G吸收實驗。

②氟康唑和鹽酸氨溴索分別進(jìn)行濃度稀釋;

③測定Rh6G吸收：藥物和Rh6G分別加入到1號管（30LRh6G母液+PBS緩沖液5975l）和2號管（30LRh6G母液+PBS緩沖液59 75L+濃度為5125 g/mL鹽酸氨溴索150l），上機檢測;

④測定Rh6G外排：采集菌種內(nèi)加入30LRh6G和無糖PBS59 75l，Rh6G最終濃度是10M;EP管在搖床下震蕩培養(yǎng)至Rh6G平衡吸收，然后冰浴10? min。細(xì)菌懸液3 500 rmp離心10 min后采集菌細(xì)胞，無糖PBS洗滌三次，胞外Rh6G洗掉。

1.6? 統(tǒng)計方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料（x±s）表示，獨立樣本t檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 鹽酸氨溴索和氟康唑?qū)w外抗白色念珠菌影響狀況

FICI評價聯(lián)合用藥抗白色念珠菌時，對CA8和CA4表征是無關(guān)，對CA16和CA10表征為協(xié)同;△E評價聯(lián)合用藥抗白色念珠菌時，對CA8和CA4表征是拮抗，對CA16和CA10表征是協(xié)同，見表1。

2.2? Rh6G外排和吸收受鹽酸氨溴索影響狀況

在Rh6G吸收和Rh6G外排實驗實驗中，隨著時間增加，鹽酸氨溴索組熒光強度均高于對照組，且鹽酸氨溴索外排量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3? 討論

近些年來，白色念珠菌對臨床上抗真菌藥品都表征出了耐藥性，對臨床醫(yī)生和患者治療一大難題，現(xiàn)在相關(guān)研究逐漸傾向于尋求抗真菌藥物曾敏機或者新抗菌治療靶點[5-6]。該文通過對白色念珠菌藥敏體外實驗研究顯示，體外聯(lián)合使用鹽酸氨溴索和氟康唑時，對耐藥白色念珠菌發(fā)生顯著協(xié)同影響，說明鹽酸氨溴索可在體外使白色念珠菌對于氟康唑的敏感性增大，對目前臨床克服白色念珠菌耐藥有重大含義。但對鹽酸氨溴索與氟康唑協(xié)同抵抗白色念珠菌作用機制還需更進(jìn)一步研究。

藥物轉(zhuǎn)運泵表達(dá)不正常為白色念珠菌形成耐藥性主要機制，藥物轉(zhuǎn)運泵過量表達(dá)會導(dǎo)致真菌細(xì)胞內(nèi)抗真菌藥品濃度降低[7-8]。當(dāng)前和白色念珠菌耐藥性相關(guān)藥物轉(zhuǎn)運泵有兩類，一是ATP能量依賴型的ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族，研究比較多的是Cdr2p與Cdrlp功能為把抗真菌藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出，Cdrp和編碼基因CDR與白色念珠菌耐藥性有聯(lián)系;二是易化擴散載體家族，和白色念珠菌耐藥相關(guān)的為多藥耐藥蛋白（Mdrlp），其功能主要為對抗真菌藥物吸收產(chǎn)生抑制作用。該文研究顯示， 鹽酸氨溴索可加速Rh6G吸收同時使Rh6G外排下降，說明鹽酸氨溴索可使CA10藥物轉(zhuǎn)運泵活性抑制，致使進(jìn)入細(xì)胞氟康唑含量升高，排除量下降，進(jìn)而使CA10細(xì)胞內(nèi)氟康唑含量升高，逆轉(zhuǎn)CA10耐藥性。

綜上所述，氟康唑聯(lián)合鹽酸氨溴索對抵抗耐藥白色念珠菌體外影響顯著，其影響機制可能為鹽酸氨溴索對抗真菌藥物轉(zhuǎn)運泵活性抑制有聯(lián)系。

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