中間錦雞兒兩個(gè)逆境相關(guān)R2R3-MYB基因的克隆及功能1)

柴文娟 楊杞 朱宏 張秀娟 李國(guó)婧 王瑞剛

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特，010018) (哈爾濱師范大學(xué)) (內(nèi)蒙古生物技術(shù)研究院) (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué))

轉(zhuǎn)錄因子又被稱為反式作用因子，可以識(shí)別并特異性地結(jié)合基因啟動(dòng)子上的順式作用元件。轉(zhuǎn)錄因子一般包含有DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、核定位信號(hào)區(qū)和寡聚化位點(diǎn)[1]。高等植物中的轉(zhuǎn)錄因子眾多，由于這些轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合、轉(zhuǎn)錄、翻譯等方面的不同，被分為多個(gè)家族，主要包括MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族、bZIP類轉(zhuǎn)錄因子家族、WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族、NAC轉(zhuǎn)錄因子家族以及AP2/EREBPA轉(zhuǎn)錄因子家族等。MYB類轉(zhuǎn)錄因子由于其編碼的蛋白質(zhì)含有一個(gè)或多個(gè)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域—MYB結(jié)構(gòu)域而得名。每個(gè)MYB重復(fù)序列由51或52個(gè)氨基酸組成，并形成一個(gè)螺旋螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)域，其中均勻分布的3個(gè)色氨酸殘基形成一個(gè)疏水核心[2-3]。在C端和保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活功能域，一般由大量酸性氨基酸組成，此外還有一個(gè)不完全界定的負(fù)調(diào)節(jié)域[4]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子一般依據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的重復(fù)數(shù)量在植物中被分成4個(gè)亞類：通常包含1個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的MYB-related亞類；包含2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3-MYB亞類；包含3個(gè)連續(xù)結(jié)構(gòu)域的R1R2R3-MYB亞類以及4個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的4R-MYB亞類[5-6]。擬南芥R2R3-MYB亞類有126個(gè)成員，被分為22個(gè)亞組[1]。植物中第1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子是1987年從玉米(Zeemays)中分離得到的Clorless I CI[7]，之后越來(lái)越多的植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來(lái)。

由于不能主動(dòng)躲避各種惡劣的自然環(huán)境，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中被動(dòng)適應(yīng)了干旱、鹽堿、高溫等極端的生境，同時(shí)也逐漸形成了復(fù)雜而有序的多種抗逆機(jī)制。MYB類轉(zhuǎn)錄因子參與了許多非生物及生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程。擬南芥AtMYB7負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)通路中抑制萌發(fā)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ABI5的表達(dá)，從而影響ABA和鹽脅迫下種子的萌發(fā)，與野生型相比，突變體atmyb7在種子萌發(fā)時(shí)對(duì)ABA和高鹽脅迫更敏感[8]。AtMYB73受鹽脅迫的誘導(dǎo)，敲除突變體atmyb73更耐鹽，且SOS1、SOS3的表達(dá)量升高[9]。大豆(Glycinemax)GmMYBJ1基因的表達(dá)受到干旱、冷、鹽及ABA的誘導(dǎo)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)GmMYBJ1能提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于干旱和冷的耐受力[10]。GmMYB84受干旱、鹽、過(guò)氧脅迫等的誘導(dǎo)，其過(guò)表達(dá)株系在干旱處理下的存活率高于野生型[11]。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtMYB3能直接結(jié)合到MtCBF4的啟動(dòng)子區(qū)域，在正常條件下抑制其表達(dá)，而受冷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子MtMYB61則在冷脅迫下會(huì)與MtMYB3的DNA結(jié)合區(qū)互作，解除MtMYB3對(duì)MtCBF4基因的抑制從而調(diào)控植物對(duì)于冷脅迫的應(yīng)答[12]。小麥(TriticumaestivumL.)TaPIMP1響應(yīng)多種非生物脅迫，過(guò)表達(dá)TaPIMP1基因使小麥更能抵抗小麥根腐病(Bipolarissorokiniana)的侵害并對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出更好的耐受性，而且RD22、TLP4和PR1a等與ABA、水楊酸調(diào)控有關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，TaPIMP1抑制表達(dá)株系表現(xiàn)出對(duì)脅迫更敏感的表型[13]。

中間錦雞兒(Caraganaintermedia)俗稱“檸條”，是豆科錦雞兒屬(Caragana)植物，多年生灌木[14]。檸條根系發(fā)達(dá)，能適應(yīng)干旱、鹽堿等環(huán)境，在降水稀少、土壤貧瘠的惡劣條件容易存活，對(duì)維持良好的生態(tài)環(huán)境起到重要的作用[15]。檸條作為飼用料用、造紙和板材原料、防風(fēng)固沙、綠化環(huán)境、保持水土、改善西部地區(qū)荒漠化現(xiàn)狀的優(yōu)良候選樹(shù)種，在我國(guó)干旱及半干旱地區(qū)被廣泛種植[16]。本研究從中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆了兩個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，并分析了逆境脅迫下基因的表達(dá)水平，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥以探究基因功能，推測(cè)其與中間錦雞兒響應(yīng)非生物脅迫的機(jī)制有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥Columbia生態(tài)型(Col-0)由本實(shí)驗(yàn)室提供，中間錦雞兒種子采自于內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗。利用70%、100%乙醇對(duì)擬南芥種子進(jìn)行滅菌，晾干后加入無(wú)菌水。4 ℃避光放置3 d，種于營(yíng)養(yǎng)土和蛭石(m(營(yíng)養(yǎng)土)∶m(蛭石)=1∶3)的培養(yǎng)缽中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，中間錦雞兒種子可不經(jīng)滅菌、低溫處理，直接播種。植物培養(yǎng)條件為22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、7 000～8 000 lx光照強(qiáng)度。

向正常生長(zhǎng)25 d左右的中間錦雞兒幼苗培養(yǎng)盤中澆入300 mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫。在處理0、0.5、1、3、6、9、12、24、48 h時(shí)取樣。取生長(zhǎng)20 d的幼苗進(jìn)行干旱處理，取樣時(shí)間為0、4、8、9、10、11、12 d，復(fù)水3 d后最后1次取樣。

1.2 總RNA和DNA提取

采用TRIzol(Invitrogen)法提取總RNA；CTAB法進(jìn)行DNA的提取[17]。利用Quawell公司的超微量紫外分光光度計(jì)Q5000對(duì)DNA和總RNA進(jìn)行定量。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量的檢測(cè)。

1.3 反轉(zhuǎn)錄與基因克隆

取1 000 ng經(jīng)過(guò)純化的中間錦雞兒總RNA或500 ng擬南芥總RNA，利用TaKaRa公司的RTase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，依照反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。

根據(jù)中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中查找的CiMYB74和CiMYB116基因序列，利用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以cDNA第一條鏈進(jìn)行cDNA的克隆，中間錦雞兒基因組DNA為模板進(jìn)行g(shù)DNA的克隆?；驍U(kuò)增所用的Primer STAR高保真酶、LATaq酶、rTaq酶及電泳所用Marker DL5000、1 kb DNA ladder購(gòu)自于TaKaRa(大連寶生物工程有限公司)。PCR反應(yīng)體系：5×Primer STAR buffer(+Mg2+)10 μL，上游(CiMYB74-5′或CiMYB116-5′)和下游(CiMYB74-3′或CiMYB116-3′)引物各2 μL(10 μmol/L)，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，模板1 μL，Primer STAR酶0.5 μL，無(wú)菌水30.5 μL。反應(yīng)程序參照Primer STAR說(shuō)明書(TaKaRa，Cat#DR010S)，CiMYB74和CiMYB116引物退火溫度分別為61 ℃和59 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，試驗(yàn)所用引物均合成于此公司。

1.4 CiMYB74基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增及元件分析

通過(guò)染色體步移的方法獲取基因的啟動(dòng)子序列。根據(jù)CiMYB74和CiMYB116基因gDNA序列，設(shè)計(jì)3條同向(Anti-sense)且退火溫度較高(65～70 ℃)的特異性引物，分別為SP1、SP2、SP3(表1)，與試劑盒中經(jīng)過(guò)獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低的4種簡(jiǎn)并引物(AP1、AP2、AP3、AP4)進(jìn)行熱不對(duì)稱性PCR反應(yīng)，經(jīng)過(guò)3輪巢式PCR即可獲得已知序列的側(cè)翼序列。具體反應(yīng)依照Genome Walking Kit試劑盒(TaKaRa，Cat#6108)說(shuō)明書[18]。

表1 試驗(yàn)所用到的引物

注：引物序列中的小寫字母表示與線性化載體互補(bǔ)的接頭序列。

1.5 CiMYB74過(guò)表達(dá)重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植物純合體篩選鑒定

根據(jù)CiMYB74基因的ORF序列設(shè)計(jì)特異性引物CiMYB74-HA5′和CiMYB74-HA3′，利用Primer STAR高保真酶擴(kuò)增ORF區(qū)域，反應(yīng)體系同前面擴(kuò)增gDNA一樣。通過(guò)In-Fusion(TaKaRa)連接酶將擴(kuò)增片段連入線性化的pCanG-HA表達(dá)載體中，重組載體中目的基因的兩端分別有SalI、SacI酶切位點(diǎn)，SalI、SacI雙酶切后，如果得到單一的符合預(yù)期大小的目的基因條帶，則證明過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。在pCanG-HA載體上有3個(gè)PstI位點(diǎn)，如果PstI單酶切后得到3條符合預(yù)期大小的條帶，則證明實(shí)驗(yàn)所用載體不存在問(wèn)題。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中。通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥并篩選純合體植株，具體操作參考于[15]等的方法。通過(guò)RT-PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中CiMYB74基因表達(dá)情況。

1.6 萌發(fā)率試驗(yàn)

將CiMYB74過(guò)表達(dá)株系和野生型擬南芥種子分別點(diǎn)種在含有100、150、200 mmol/L NaCl以及不含NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，以胚根突破種皮為萌發(fā)標(biāo)志，每天統(tǒng)計(jì)各平板的萌發(fā)情況。由于100 mmol/L平板上種子萌發(fā)整體較快，在第4天進(jìn)行拍照；150、200 mmol/L的NaCl平板在萌發(fā)第8天拍照。

1.7 基因數(shù)據(jù)分析

在NCBI BLAST網(wǎng)站中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行基因相近序列搜索，應(yīng)用Vector NTI Advance@ 11.5進(jìn)行序列拼接，ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用DNAMAN多序列比對(duì)查找內(nèi)含子與外顯子，ExPASy網(wǎng)站ProParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)推導(dǎo)氨基酸序列理論等電點(diǎn)與分子量，ProtScale工具(http://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性分析。通過(guò)NPS@網(wǎng)站HNN工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)PlantCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行在線分析，尋找可能的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 CiMYB74和CiMYB116基因克隆和序列分析

利用特異性引物擴(kuò)增CiMYB74和CiMYB116的包含編碼區(qū)的cDNA及gDNA序列。CiMYB74基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳得到約1 000和2 000 bp的條帶(圖1A，B)，CiMYB116檢測(cè)到約1 000和1 200 bp的條帶(圖1C，D)。

序列分析表明CiMYB74基因gDNA序列長(zhǎng)度為1 976 bp，包含3個(gè)外顯子區(qū)(1～140，250～367，1 266～1 976 bp)和2個(gè)內(nèi)含子區(qū)(141～249，368～1 265 bp)；ORF長(zhǎng)度為978 bp，編碼326個(gè)氨基酸，起始密碼子ATG，終止密碼子TAA(圖2)。CiMYB116基因ORF長(zhǎng)900 bp，編碼300個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA；gDNA長(zhǎng)為1 270 bp，包含3個(gè)外顯子(144、129、624 bp)和兩個(gè)內(nèi)含子(96、277 bp)(圖3)。

1.CiMYB74基因cDNA擴(kuò)增結(jié)果；2.CiMYB74基因gDNA擴(kuò)增結(jié)果；3.CiMYB116基因cDNA擴(kuò)增結(jié)果；4.CiMYB116基因gDNA擴(kuò)增結(jié)果；M為DL5000。

圖1CiMYB74和CiMYB116基因克隆

下劃線標(biāo)注部分表示內(nèi)含子區(qū)域。

下劃線標(biāo)注部分表示內(nèi)含子區(qū)域。

2.2 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

CiMYB74和CiMYB116基因編碼蛋白的理論等電點(diǎn)分別是6.1和6.72，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為36.65和34.48 ku。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析，其中：CiMYB74蛋白第301位的谷氨酸(Glu)親水性最強(qiáng)(具最低分值-2.7)，第174和175位的丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)疏水性最強(qiáng)(同時(shí)具有最高分值1.622)；CiMYB116第137位的丙氨酸(Ala)疏水性最強(qiáng)(具最高分值1.144)，154位的絲氨酸(Ser)親水性最強(qiáng)(具最低分值，-2.467)。兩條多肽鏈中親水性氨基酸分布較多，表明這兩個(gè)蛋白整體上是親水的。預(yù)測(cè)了CiMYB74和CiMYB116蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋與β折疊這3種主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)均存在于這兩個(gè)蛋白中，而且均以無(wú)規(guī)則卷曲最多，CiMYB74蛋白質(zhì)中的β折疊(9.51%)所占比例要高于CiMYB116蛋白(6.33%)，而α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲比例低于CiMYB116蛋白(表2)。

表2 CiMYB74和CiMYB116蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 CiMYB74和CiMYB116基因的同源性及進(jìn)化分析

根據(jù)CiMYB74和CiMYB116推導(dǎo)的氨基酸序列，在NCBI Blast中檢索與其最相近的序列并進(jìn)行多序列比對(duì)分析。結(jié)果顯示CiMYB74和CiMYB116都是典型的R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子，CiMYB74第16位到第64位氨基酸為R2結(jié)構(gòu)域，第67到第115位氨基酸為R3結(jié)構(gòu)域(圖4)。CiMYB116第18位到第68位氨基酸為R2結(jié)構(gòu)域，第71到第119位氨基酸為R3結(jié)構(gòu)域；與野生大豆(Glycinesoja)GsMYB21(KHN11407.1)和大豆GmMYB340(XP_003555909.1)的相似度均為77%(圖4)。

從Genebank中下載與CiMYB74、CiMYB116氨基酸序列相似的其他物種的序列，經(jīng)ClustalW比對(duì)，利用MEGA5軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。聚類結(jié)果表明CiMYB74與豆科植物的一些MYB轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系都很近，與鷹嘴豆(Cicerarietinum)CaMYB308-like、大豆GmMYB330-like等相似度都達(dá)到70%以上，而與非豆科植物，如葡萄VvMYB39等親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖5)。擬南芥AtMYB41、AtMYB74及AtMYB102屬于R2R3-MYB家族第11亞組，該亞組成員在R3結(jié)構(gòu)域后通常包含PRLLLD基序，CiMYB74也含有PRLLLD序列(圖4和圖5)[1]。

黑色實(shí)線和虛線分別代表R2和MYB R3結(jié)構(gòu)域，黑色方框圈出了同一亞組的保守基序。

采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；Bootstrap設(shè)置為1 000次。

CiMYB116與擬南芥MYB家族中的AtMYB116的親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)到48%。AtMYB116屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子第20亞組，該亞組成員在R3結(jié)構(gòu)域后所共有的保守序列是WxPRL，CiMYB116同樣含有這一序列(圖4和圖5)。與第11亞組其他成員相比，CiMYB74與擬南芥R2R3-MYB的其他亞組成員距離相對(duì)更遠(yuǎn)；CiMYB116則與除第20亞組外的成員親緣關(guān)系更遠(yuǎn)(圖6)。

1，5.第一輪延伸的擴(kuò)增產(chǎn)物；2，6.第二輪延伸的擴(kuò)增產(chǎn)物；3、4和7、8.第三輪延伸的擴(kuò)增產(chǎn)物；M1.DL5000，M2.1kb分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 NaCl和干旱脅迫下基因的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CiMYB74和CiMYB116基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)都受到干旱和NaCl脅迫的誘導(dǎo)(表3)。CiMYB74在干旱脅迫第11天時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值，約為處理前的230倍；CiMYB116基因的表達(dá)水平受干旱脅迫誘導(dǎo)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，并在復(fù)水后下降，說(shuō)明該基因的表達(dá)確實(shí)受到干旱脅迫的誘導(dǎo)。

表3 干旱與NaCl脅迫下CiMYB74和CiMYB116的基因表達(dá)

脅迫CiMYB74處理時(shí)間/h基因表達(dá)倍數(shù)誤差CiMYB116處理時(shí)間/h基因表達(dá)倍數(shù)誤差NaCl01.0000 1.0000.51.1010.2410.50.8000.2341.01.6870.5041.03.0390.4883.01.6280.3673.029.7202.8706.03.2470.6559.037.0402.1479.012.2502.36524.035.6304.17024.028.3605.43548.0138.70020.690

NaCl誘導(dǎo)24 h時(shí)，CiMYB74基因的表達(dá)量是未處理時(shí)的36倍多；CiMYB116基因在鹽脅迫48 h后，表達(dá)量上調(diào)至處理前的12倍左右。

2.5 CiMYB74和CiMYB116基因啟動(dòng)子的克隆與序列分析

利用染色體步移試劑盒，以中間錦雞兒gDNA為模板，克隆基因啟動(dòng)子。測(cè)序結(jié)果表明，特異性引物分別與AP3、AP2配對(duì)，成功克隆到CiMYB74和CiMYB116基因起始密碼子上游516和1 040 bp的啟動(dòng)子序列(圖7)。

將獲得的序列輸入到啟動(dòng)子分析網(wǎng)站PlantCARE中，尋找可能存在的順式作用元件。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CiMYB74基因啟動(dòng)子序列中除了具有啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄基本核心元件CAAT-box和TATA-box外，還含有多個(gè)光應(yīng)答元件，如G-box(CACGTC)、Gap-box(AAATGGAGA)、MNF1(GTGCCCA/T)等；此外，CiMYB74啟動(dòng)子還包含生長(zhǎng)素響應(yīng)元件AuxRR-core(GGTCCAT)和TGA-element(AACGAC)、茉莉酸響應(yīng)基序CGTCA-motif和TGACG-motif、ABA及病毒應(yīng)答元件CE3(GACGCGTGTC)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE(TGGTTT)以及響應(yīng)晝夜節(jié)律振蕩元件Circadian(CAANNNNATC)等(表4)。啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果初步表明，CiMYB74基因可能參與非生物脅迫應(yīng)答及調(diào)控植物的某些生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

表4 CiMYB74啟動(dòng)子分析預(yù)測(cè)

CiMYB116啟動(dòng)子序列中包含有與非生物脅迫有關(guān)的順式作用元件，如熱激應(yīng)答元件(HSE，heat shock element)、水楊酸應(yīng)答元件(TCA-element)、參與防衛(wèi)反應(yīng)與脅迫應(yīng)答基序(TC-rich repeat)以及響應(yīng)節(jié)律振蕩元件(Circadian)(表5)。除此之外，與光應(yīng)答有關(guān)的元件也較多出現(xiàn)在CiMYB116啟動(dòng)子序列中，如Box-4，MRE(MYB binding site involved in light)，LAMP-element以及ATC-motif。

A.pCanG-CiMYB74表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證：1.對(duì)照質(zhì)粒；2.SalI、SacI酶切鑒定；3.PstI酶切鑒定；B.CiMYB74過(guò)表達(dá)株系的RT-PCR鑒定：Control+.檸條cDNA做模板的陽(yáng)性對(duì)照；Control-.擬南芥cDNA做模板的陰性對(duì)照；其他數(shù)字表示過(guò)表達(dá)株系)；C.CiMYB74過(guò)表達(dá)株系的qRT-PCR鑒定(選擇AtEF1α作為內(nèi)參基因。結(jié)果計(jì)算采用2-ΔCT法?？v軸用對(duì)數(shù)軸表示)；M1.1kb分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2.DL5000 Marker。

圖7 pCanG-CiMYB74重組質(zhì)粒的構(gòu)建及過(guò)表達(dá)植物的鑒定

2.6 pCanG-CiMYB74重組表達(dá)載體的構(gòu)建及純合體植株的鑒定

利用In-Fusion酶將CiMYB74基因ORF區(qū)連入pCanG載體中，使用SalI、SacI進(jìn)行雙酶切，PstI單酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒(圖8A)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植物中CiMYB74的表達(dá)情況，由圖可知，在10個(gè)轉(zhuǎn)CiMYB74基因的純合體株系和陽(yáng)性對(duì)照(C+)中均擴(kuò)增出目的基因，而陰性對(duì)照(C-)中并未有目的條帶出現(xiàn)(圖8B)。過(guò)表達(dá)植物生長(zhǎng)過(guò)程中呈現(xiàn)的形態(tài)與野生型沒(méi)有明顯區(qū)別，根據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，選取表達(dá)量最高、最低以及居中的3個(gè)過(guò)表達(dá)株系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，即OE-1、OE-2和OE-6(圖8)。

2.7 CiMYB74負(fù)調(diào)控種子萌發(fā)時(shí)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

脅迫表達(dá)分析結(jié)果表明，CiMYB74基因的表達(dá)受到NaCl的誘導(dǎo)，而且很多MYB轉(zhuǎn)錄因子也參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程。為了進(jìn)一步了解在擬南芥中過(guò)表達(dá)中間錦雞兒CiMYB74是否能改變擬南芥對(duì)NaCl的敏感性，分別檢測(cè)了在含有100、150和200 mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上野生型和轉(zhuǎn)基因株系種子的萌發(fā)情況。萌發(fā)實(shí)驗(yàn)顯示，在含有NaCl的培養(yǎng)基上，過(guò)表達(dá)株系的萌發(fā)表現(xiàn)出對(duì)NaCl更不耐受的表型。其中，在含有200 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上，CiMYB74轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)被強(qiáng)烈地抑制(圖8)。這些結(jié)果說(shuō)明，CiMYB74負(fù)調(diào)控種子萌發(fā)時(shí)期對(duì)于鹽脅迫的應(yīng)答過(guò)程。

3 結(jié)論和討論

本研究從中間錦雞兒干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆了兩個(gè)R2R3-MYB基因，分別命名為CiMYB74和CiMYB116。CiMYB74和CiMYB116基因gDNA長(zhǎng)度分別為1 976和1 270 bp，均包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子；開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度分別為978和900 bp，分別編碼326和300個(gè)氨基酸。CiMYB74和CiMYB116基因的表達(dá)都受到鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)。此外，克隆得到516 bp的CiMYB74啟動(dòng)子序列，主要包含茉莉酸響應(yīng)基序(CGTCA-motif和TGACG-motif)、ABA及病毒應(yīng)答元件(CE3)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件(ARE)以及響應(yīng)節(jié)律振蕩元件(Circadian)等；克隆得到1040bp的CiMYB116啟動(dòng)子序列，主要包含熱應(yīng)答元件、水楊酸應(yīng)答元件、防衛(wèi)反應(yīng)及脅迫應(yīng)答元件。最后，在擬南芥中過(guò)表達(dá)CiMYB74，轉(zhuǎn)基因株系種子在萌發(fā)時(shí)期對(duì)鹽脅迫更加敏感，表明該基因負(fù)調(diào)控種子萌發(fā)時(shí)期對(duì)于鹽脅迫的耐受能力。

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)CiMYB74基因與R2R3-MYB第11亞組的AtMYB74、AtMYB102和AtMYB41的親緣關(guān)系較近。已有研究表明，擬南芥第11亞組成員之間功能差異較大，成員所共有的PRLLLD序列和基因功能間沒(méi)有明確的關(guān)聯(lián)[19]。擬南芥AtMYB74受鹽脅迫誘導(dǎo)且通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的方式負(fù)調(diào)控植物響應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程；與野生型相比，AtMYB74過(guò)表達(dá)株系種子在萌發(fā)時(shí)期表現(xiàn)出對(duì)鹽更敏感的表型，但是在含有NaCl的土壤中野生型和過(guò)表達(dá)的幼苗沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差別[19]。與AtMYB74不同，擬南芥AtMYB102受生物脅迫的誘導(dǎo)，在菜粉蝶(Pierisrapae)咬食的組織中AtMYB102表達(dá)量明顯上調(diào)[20]。其突變體myb102比野生型更加不抗蟲且相關(guān)防御基因表達(dá)降低，而過(guò)表達(dá)株系則更加抗蟲[20]。第11亞組另一個(gè)成員AtMYB41同樣也響應(yīng)各種非生物脅迫，對(duì)AtMYB41過(guò)表達(dá)植物進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析數(shù)據(jù)表明，AtMYB41通過(guò)控制初級(jí)代謝及負(fù)調(diào)控植物對(duì)于滲透脅迫的短期轉(zhuǎn)錄水平上的響應(yīng)來(lái)參與多種細(xì)胞進(jìn)程[21]。此外，另有研究表明AtMYB41可起始擬南芥木栓質(zhì)合成過(guò)程中的必須步驟，AtMYB41過(guò)表達(dá)后可促進(jìn)木栓質(zhì)合成相關(guān)基因CYP86A1和CYP86B1的表達(dá)而增加植物體內(nèi)木栓質(zhì)的積累[22]。我們的研究表明CiMYB74的表達(dá)受NaCl和干旱的誘導(dǎo)，而且在擬南芥中過(guò)表達(dá)CiMYB74會(huì)增強(qiáng)植物在種子萌發(fā)時(shí)期對(duì)鹽的敏感性，這一結(jié)果與AtMYB74過(guò)表達(dá)后產(chǎn)生的表型基本一致[19]。分析CiMYB74啟動(dòng)子序列后發(fā)現(xiàn)，有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、茉莉酸響應(yīng)元件等順式作用元件出現(xiàn)，這預(yù)示著CiMYB74除了響應(yīng)鹽脅迫外，可能還參與了植物體內(nèi)其他的一些生理生化過(guò)程。

此外，系統(tǒng)進(jìn)化分析還表明擬南芥中與CiMYB116親緣關(guān)系較近的有AtMYB116、AtMYB21、AtMYB112、AtMYB78和AtMYB108，其中AtMYB21屬于第19亞組，其他幾個(gè)成員屬于第20亞組[6]。Mengiste等對(duì)擬南芥幾乎所有MYB做了響應(yīng)CdCl2、NaCl及各種激素處理的表達(dá)檢測(cè)，其中AtMYB116、AtMYB21、AtMYB112、AtMYB78和AtMYB108基因?qū)@些處理都有不同程度的響應(yīng)[23]。AtMYB108對(duì)于擬南芥響應(yīng)非生物脅迫是必須的，其突變體植株比野生型更不耐鹽，干旱處理下突變體株系的存活率低于野生型[23]。Cheng等的研究表明，赤霉素和茉莉酸共同作用能影響AtMYB21、AtMYB24和AtMYB57的表達(dá)，從而促進(jìn)植物雄蕊敗育[24]。AtMYB112在鹽脅迫和強(qiáng)光照下促進(jìn)花青素的合成，AtMYB112基因受NaCl脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)量上升[25]。棉花GhMYB108通過(guò)和類鈣調(diào)素蛋白GhCML11互作使植物應(yīng)對(duì)真菌脅迫，GhMYB108基因敲除突變體對(duì)輪枝菌敏感性增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)株系則表現(xiàn)出對(duì)該菌種更耐受的表型[26]。本研究中的CiMYB116基因在干旱及鹽脅迫后，表達(dá)量都有不同程度的上調(diào)。此外，通過(guò)對(duì)克隆得到的CiMYB116基因啟動(dòng)子序列分析表明，該基因啟動(dòng)子區(qū)域包含一些非生物脅迫和生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，如熱激應(yīng)答元件(HSE)、水楊酸應(yīng)答元件(TCA-element)、參與防衛(wèi)反應(yīng)與脅迫應(yīng)答基序(TC-rich repeat)，說(shuō)明CiMYB116基因可能參與了中間錦雞兒抵御環(huán)境脅迫和病原菌的信號(hào)調(diào)控。與CiMYB116親緣關(guān)系相近的擬南芥MYB的功能集中在抵抗非生物或生物脅迫及植物發(fā)育調(diào)控，但是R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中功能差別很大。CiMYB116的功能可能與擬南芥AtMYB21、AtMYB116或AtMYB108有所不同，具體的生物學(xué)功能還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。植物存在于自然界中，不能像動(dòng)物一樣主動(dòng)躲避各種極端環(huán)境及生物脅迫，但是在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，也具備了響應(yīng)各種非生物脅迫的應(yīng)答機(jī)制。中間錦雞兒作為西北部干旱、半干旱地區(qū)優(yōu)秀的造林樹(shù)種，在多種逆境脅迫下均能生存。從中間錦雞兒中尋找植物響應(yīng)干旱、鹽堿及冷凍害等非生物脅迫的基因及其調(diào)控機(jī)制，有助于深入了解植物應(yīng)答逆境脅迫的分子機(jī)理。