初次治療未治愈丙型肝炎患者遠期預(yù)后的影響因素及預(yù)測指標探討

皇甫彤,王偉紅，何瑩，陸長春，藺永梅，朱麗娜

(1 漢中市三二〇一醫(yī)院，陜西漢中 723000；2山東省聊城市人民醫(yī)院；3河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院)

研究發(fā)現(xiàn)，免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)水平與肝炎轉(zhuǎn)歸有緊密聯(lián)系[1～3]。白細胞介素10(IL-10)能調(diào)控CD8+T細胞的分化，而后者分化不足常引起T細胞衰竭，導(dǎo)致病毒持續(xù)高水平表達。Da等[4]發(fā)現(xiàn)，白細胞介素12(IL-12)可誘導(dǎo)Th1細胞分化，進而開啟免疫應(yīng)答，參與抗病毒過程。在Komolmit等[5]的研究中，干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)作為CXC類趨化因子，亦可介導(dǎo)Th1型炎癥反應(yīng)，提高機體免疫功能。以上指標均可反映丙型肝炎患者病情變化，具有潛在預(yù)測價值，但目前關(guān)于IL、IP-10與丙型肝炎患者抗病毒治療后預(yù)后轉(zhuǎn)歸的研究并不多見。因此，本文預(yù)納入IL-10、IL-6、IP-10等預(yù)后相關(guān)指標，探究初次未治愈丙型肝炎患者遠期預(yù)后的影響因素，為臨床決策及干預(yù)提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2014年12月漢中市三二〇一醫(yī)院因慢性丙型肝炎入院治療的患者210例，其診斷標準為患者抗-HCV、HCV RNA定性檢測均呈陽性，ALT增高(>40 U/L)且時間持續(xù)超過6個月。其中男131例、女79例，年齡(46.13±11.19)歲。Metavir F0、F1、F2、F3級患者分別為72、56、45、37例；病程(6.72±3.54)年；合并有糖尿病12例、高血壓26例、冠心病8例；ALT、AST、ALB、PTA、ALP、TBil分別為(114.6±8.3)U/L、(52.6±9.4)U/L、(43.2±0.5) U/L、46.0%±18.0%、(92.7±54.5) U/L、(52.1±38.3) U/L；病毒載量為(3.8±0.19)×107copies/mL；基因1型患者77例，2/3型133例。納入標準：患者入院前均未接受干擾素及免疫調(diào)節(jié)劑治療；無干擾素、利巴韋林應(yīng)用禁忌證。排除標準：合并甲型肝炎、乙型肝炎等其他肝炎病毒感染者；患有藥物性肝炎、酒精性肝炎、代謝性肝炎等其他類型肝炎者；參與者均簽署有關(guān)知情同意書，并獲本院倫理委員會批準。

1.2 治療方法 163例丙型肝炎患者采用聚乙二醇干擾素α-2a治療， 180 μg，皮下注射，每周1次；利巴韋林(病毒基因2/3型患者800 mg，基因1型患者1 000～1200 mg)，口服，每周1次；持續(xù)24～48周。47例丙型肝炎患者采用普通干擾素α-2b治療，3～5 MU，皮下或肌肉注射，每周3次；利巴韋林800～1 000 mg/d，口服，每周1次；持續(xù)24～48周。治療后，再觀察24周。療效評價：治療24～48周的療效評價包括以下指標：病毒學(xué)應(yīng)答：①早期病毒學(xué)應(yīng)答(EVR)：治療12周時，HCV RNA陰轉(zhuǎn)或定量檢測后，降低2個Log以上；②治療應(yīng)答(ETR)：治療結(jié)束時，HCV RNA檢測陰性；③無應(yīng)答(NR)：治療12周HCR RNA較治療前下降不足2個Log；④持續(xù)病毒應(yīng)答(SVR)：治療結(jié)束后24周，敏感PCR檢測HCV RNA為陰性；⑤復(fù)發(fā)：停止治療后半年，HCV RNA檢測又出現(xiàn)陽性。生化應(yīng)答：ALT復(fù)常，低于正常上限值。

1.3 肝纖維化程度的測定 在B超、CT引導(dǎo)下進行肝穿刺活檢，16 G穿刺針由日本八光公司提供，穿刺組織長度>1.5 cm?；顧z組織由本院病理科3位醫(yī)師單盲法讀片進行評定，同時參考2000年西安會議修訂的丙型肝炎防治指南，運用Metavir分級分析肝纖維化程度。

1.4 丙型肝炎血清學(xué)相關(guān)指標的檢測 患者入院后1周內(nèi)于清晨(禁食8 h以上)抽取肘靜脈血5 μL，靜置20 min，4 000 r/min分離，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用美國貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀測定患者常規(guī)生化指標；雙抗體夾心ELISA法(上海恒遠生物科技有限公司)檢測血清抗-HCV、IP-10水平；采用放射免疫法測定肝纖維化四項，包括血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、IV型膠原(Ⅳ-C)，試劑盒來自武漢華美生物工程有限公司；采用美國ACL7000全自動血凝儀檢測血清凝血酶原活動度(PTA)；采用定量ELISA法(美國Grenier公司)檢測血清IL-10、IL-12水平，ELX800全自動酶標儀讀取其吸光值并計算其濃度，而后嚴格按照說明書進行操作。熒光定量PCR法檢測HCV RNA載量，試劑盒為上?？迫A生物有限公司產(chǎn)品。HCV RNA檢測過程：分離患者血清，加入等量TRIzol試劑裂，反復(fù)振蕩混勻，13 000 r/min離心，靜置10 min；加入等量異丙醇，離心，分層后棄上清，用75%乙醇(DEPC溶解)清洗，稀釋重懸后取15 μL總RNA溶解液進行反應(yīng)。HCV RNA反應(yīng)條件：42 ℃ 30 min；95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s(5個循環(huán))；95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min(35個循環(huán))。以GAPDH為內(nèi)參基因，以雙標準曲線法進行定量。

1.5 隨訪 評價療效后，選取初次治療未治愈的患者作為研究對象，進行為其2年的隨訪，首次隨訪為療效評價后1個月，常規(guī)檢測并記錄其生化指標的變化，以后每2個月隨訪一次，記錄患者體征及醫(yī)生診斷報告。終點事件：復(fù)發(fā)：Metavir分級下降小于1期。根據(jù)隨訪結(jié)果，將出現(xiàn)終點事件的患者定義為預(yù)后不良，其余患者定義為預(yù)后良好。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效 210例患者中，SVR為56%(117/210)，復(fù)發(fā)率及NR獲得率分別為3%(4/210)、21%(450/210)。治療過程中，少部分患者出現(xiàn)流感樣癥狀及血小板降低，未放棄治療。納入隨訪的86例患者，經(jīng)過臨床治療后，24周復(fù)查結(jié)果:普通干擾素治療者SVR、EVR、ETR、NR、生化應(yīng)答、復(fù)發(fā)分別為26、32、28、19、22、2例，SVR、EVR、ETR、NR、生化應(yīng)答、復(fù)發(fā)者年齡分別為(38.4±12.4)、(41.6±14.3)、(40.5±16.8)、(46.0±13.6)、(42.1±15.0)、(44.4±10.2)歲，HCV基因型1型分別為17、24、20、13、15、1例，治療前病毒載量分別為8.2×105、5.8×106、5.6×106、7.1×106、5.0×106、6.3×106copies/mL。長效干擾素治療者SVR、EVR、ETR、NR、生化應(yīng)答、復(fù)發(fā)分別為91、133、105、26、98、2例，SVR、EVR、ETR、NR、生化應(yīng)答、復(fù)發(fā)者年齡分別為(40.1±10.8)、(42.3±11.9)、(39.7±17.4)、(47.1±15.0)、(41.5±13.6)、(42.7±11.3)歲，HCV基因型1型分別為13、24、21、10、18、1例，治療前病毒載量分別為9.4×105、4.4×106、5.1×106、6.3×106、4.5×106、6.8×106copies/mL。

2.2 隨訪結(jié)果 86例患者中，失訪6例；再次治療后痊愈或好轉(zhuǎn)59例(預(yù)后良好組)，預(yù)后不良患者21例(預(yù)后不良組)，其中復(fù)發(fā)患者4例、肝纖維化程度加重患者17例。

2.3 兩組臨床資料分析 兩組干擾素類型、基因型、Metavir分級，血清IL-12、IL-10、IP-10水平及HCV RNA載量，血清HA、Ⅳ-C水平比較，P均<0.05。見表1、2。

表1 兩組干擾素類型、Metavir分級及基因型比較[例(%)]

表2 兩組血清學(xué)檢測指標比較

2.4 初次治療未治愈丙型肝炎患者預(yù)后的多因素分析結(jié)果 多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，HCV基因型，Metavir分級，血清IL-10、IL-12、IP-10水平及HCV RNA載量是初次治療未治愈丙型肝炎患者預(yù)后的獨立影響因素(P均<0.05)。見表3。

2.5 各指標對患者預(yù)后的評估價值 血清IL-10、IL-12、IP-10、HCV RNA的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.675、0.772、0.785、0.724。IL-10最佳診斷點46.25，敏感性74.3%，特異性69.1%；IL-12最佳診斷點209.66 pg/mL，敏感性80.8%，特異性74.6%；IP-10最佳診斷點337.10 pg/mL，敏感性78.2%，特異性83.9%；HCV RNA最佳診斷點8.6×105copies/mL，敏感性79.0%，特異性72.7%。IL-12與IP-10的AUC較高，運用Logisitc生成概率分布，IL-12聯(lián)合IP-10的AUC為0.872，高于各指標單獨診斷(P均<0.05)，其敏感性81.6%、特異性85.2%。見圖1、2。

表3 初次治療未治愈丙型肝炎患者預(yù)后的多因素Cox分析

3 討論

目前，干擾素聯(lián)合利巴韋林是治療丙型肝炎患者的主要方案，除有較好的治愈率外亦能延緩病情進展，改善預(yù)后[6]。Squadrito等[7]研究提示，長效干擾素聯(lián)合利巴韋林的應(yīng)用使SVR應(yīng)答率明顯提高，可達80%。但在實際臨床應(yīng)用中，受患者年齡、病毒基因型等因素的影響，SVR應(yīng)答率在50%左右。未能取得SVR的患者需延長治療周期或直接改用抗病毒藥物，對這類患者來說，其遠期復(fù)發(fā)率較高，值得臨床關(guān)注。與Pariente等[8]的研究不同，筆者未在治療后24～48周定義終點事件，而選擇48周復(fù)查后尚未SVR應(yīng)答的患者進行隨訪跟蹤，主要觀察其再治愈及遠期隨訪過程中，導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)及肝纖維化程度加重的危險因素及早期預(yù)測指標。

圖1 各指標評估患者術(shù)后預(yù)后的ROC曲線

臨床資料顯示，初次治療即達SVR的患者，復(fù)發(fā)率較低。但初次治療未愈者，尤其是無應(yīng)答患者，再治療的SVR有30%～40%[9]，其復(fù)發(fā)率及纖維化程度較初次即治愈患者更高，遠期預(yù)后亦不理想。

圖2 IL-12聯(lián)合IP-10評估患者預(yù)后的ROC曲線

本研究120例患者經(jīng)臨床治療后，SVR獲得率為55.7%，與多數(shù)報道一致。本研究發(fā)現(xiàn)，基因1型對初次治療未治愈患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸存在影響。因此，對于1型患者，延長用藥時長是基礎(chǔ)，更需時時檢測，及時調(diào)整用藥方案。

在抗HCV病毒的免疫反應(yīng)中，Th1/Th2的波動調(diào)節(jié)著丙型肝炎慢性進展程度及干擾素療效。IL-12作為Th1反應(yīng)的重要啟動因子，能促使Th1/Th2平衡傾向于Th1分化，激活細胞毒性T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)的殺傷功能，清除病毒[10]。IL-10則來源于Th2，抑制Th1介導(dǎo)的細胞免疫，導(dǎo)致感染持續(xù)存在，與肝炎慢性化有關(guān)。初次治療未治愈丙型肝炎患者中，IL-10的水平較低，IL-12較高，二者檢測值的變化可反映患者免疫狀態(tài)，具有預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸的潛力。IP-10是新近CXC家族趨化因子，主要由IFN-γ產(chǎn)生，通過募集活化T淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞等強化Th1型反應(yīng)，細胞免疫隨即增強[11]。ROC曲線結(jié)果顯示，IL-12聯(lián)合IL-10的預(yù)測價值更高，提示二者聯(lián)合作為初次治療未治愈丙型肝炎患者預(yù)后的預(yù)測指標較為理想，在復(fù)查患者病毒含量時，應(yīng)輔助分析患者IP-10、IL-12變化趨勢，對IP-10、IL-12較低的患者加以干預(yù)，避免停藥復(fù)發(fā)及肝纖維化程度加重。

綜上所述，Metavir分級、IL-10、IL-12、IP-10、HCV RNA載量及HCV基因型是影響預(yù)后的獨立影響因素；IL-12聯(lián)合IL-10有望作為初次治療未治愈丙型肝炎患者預(yù)后不良的評估指標。