ADAMTS-12表達(dá)與腰椎間盤(pán)退變的相關(guān)性分析

韋中陽(yáng)，侯桂紅

(1、安陽(yáng)市人民醫(yī)院骨一科，河南 安陽(yáng) 455000；2、洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（骨科醫(yī)院）頸腰痛二科，河南 洛陽(yáng) 471002)

腰 椎 間 盤(pán) 突 出 癥 （Lumbar disc herniation，LDH）是臨床常見(jiàn)的脊柱退行性疾病，椎間盤(pán)纖維環(huán)破裂后，突入椎管內(nèi)的髓核、殘留的纖維環(huán)覆蓋在后縱韌帶上，壓迫鄰近神經(jīng)根，誘發(fā)一系列的臨床病癥[1]。該疾病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，臨床發(fā)現(xiàn)除生物化學(xué)因素外還可能存在細(xì)胞因子的作用。解聚蛋白酶－12(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 12，ADAMTS－12) 是一類Zn2+依賴的分泌性金屬蛋白酶家族成員，在維持凝血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、器官生成、炎癥與生育方面具有重要作用，能夠有效分解明膠，降解膠原溶解物，在椎間盤(pán)退變過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。本研究對(duì)腰椎骨折椎間盤(pán)與退行腰椎間盤(pán)進(jìn)行組織學(xué)觀察，并分析ADAMTS－12在退變腰椎間盤(pán)組織中的表達(dá)，以進(jìn)一步探索椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2015年2月至2017年2月在我院治療的腰椎間盤(pán)突出患者的椎間盤(pán)標(biāo)本54例，納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴均經(jīng) CT、MRI等檢查確診[3]，其中MRI示TW2髓核信號(hào)變低；⑵均在我院行手術(shù)髓核切除；⑶患者臨床病理資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有類風(fēng)濕疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)疾病。其中男性30例，女性24例；年齡35～69歲，平均年齡（46．28±9．28）歲；椎間盤(pán)節(jié)段：L3－4 椎間盤(pán)突出患者7例，L4－5椎間盤(pán)突出患者34例，L5－S1椎間盤(pán)突出患者13例。根據(jù)術(shù)中觀察及北美脊柱協(xié)會(huì)[4]分類進(jìn)行分組，其中后外層纖維環(huán)破裂 （指突出椎間盤(pán)組織完全穿破外層纖維環(huán)和后縱韌帶復(fù)合物，并進(jìn)入椎管內(nèi)）32例，后外層纖維未破裂 （指椎間盤(pán)局部突出區(qū)域在外層纖維環(huán)和后縱韌帶復(fù)合物內(nèi)）22例。同時(shí)選取同期在我院治療的腰椎骨折并接受椎體融合術(shù)的患者腰椎間盤(pán)組織40例（對(duì)照組），其中男性25例，女性15例；年齡 37～72 歲，平均年齡（47．04±10．24）歲；椎間盤(pán)節(jié)段：L3－4椎間盤(pán)突出患者5例，L4－5椎間盤(pán)突出患者29例，L5－S1椎間盤(pán)突出患者6例。

1．2 MRI檢 測(cè) 所 有 患 者 采 用 GE 1．5T Signa TwinSpeed with excite雙梯度超導(dǎo)型磁共振掃描儀進(jìn)行MRI掃描，相控陣頭線圈完成對(duì)腰椎間盤(pán)的掃描，MRI掃描時(shí)以橫軸位為主，矢狀為輔，進(jìn)行平掃、動(dòng)態(tài)增強(qiáng)與減影成像，層間距為0．5mm，層厚度為5mm。

1．3 HE染色 ⑴標(biāo)本固定：將采集的髓核組織制作成標(biāo)本，固定在4%甲醛固定液6～10h。⑵沖洗、脫水、滲透：使用流水沖洗固定液后，采用梯度酒精脫水，二甲苯透明。⑶組織包埋：預(yù)熱好的石蠟倒入蠟槽內(nèi)，將放好的組織自然冷卻，修整蠟塊。⑷裱片：取一清潔載玻片，涂一層蛋白甘油，在水中撈取切好的蠟片，擺正蠟片，放入格盤(pán)中，在64℃溫箱中烘干。⑸切片染色：二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，使用自來(lái)水沖洗。⑹蘇木精染色：浸泡7min蘇木精染液，染細(xì)胞核，自來(lái)水沖洗3～5min。⑺1%鹽酸乙醇分化1－5s，自來(lái)水沖洗1～3min。⑻弱堿性水溶液返藍(lán)30s～1min，自來(lái)水沖洗5～10min。⑼伊紅染色：浸泡伊紅染色液1－5s，染細(xì)胞質(zhì)。⑽梯度乙醇脫水、二甲苯透明。⑾中性樹(shù)膠封片。

1．4 免疫組化檢測(cè) ⑴脫蠟、水化：切片浸泡二甲苯5min 2次，梯度酒精水化，自來(lái)水沖洗，PBS沖洗2次，5min/次。⑵微波熱修復(fù)。切片脫蠟至水后，3%H2O2處理10min，蒸餾水洗 2min×3。 將切片放入盛有 0．01M 枸櫞酸鹽緩沖液（pH6．0）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃～98℃之間并持續(xù)10～15min。取出容器，室溫冷卻10～20min。⑶3%H2O2（80%甲醇）滴加切片上，室溫靜置10min。⑷PBS沖洗2～3次。⑸滴加山羊血清封閉液，室溫放置20min后滴加第一抗體，4℃過(guò)夜后需在37℃復(fù)溫45min。⑹切片上滴加生物素化第二抗體 （IgG）， 室溫放置 20min，PBS沖洗 3次，5min/次。⑺滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（SA/HRP），37℃ 20min，PBS 沖洗 3 次，5min/次。⑻DAB顯色1～3min，在顯微鏡下掌握染色程度。⑼蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗10～15min。⑽乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片、鏡檢。

1．5 聚合酶鏈反應(yīng) （PCR） 設(shè)置上游引物：5'－CAC－TTGACTGGGTTCCTA－3'； 下游引物：5'－CTCATTCCCGTTCCTCT－3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 1096bp。PCR 擴(kuò)增體系：10×緩沖液 2．5ul，Mg2+1．0ul（25mol/L），Mix dNTP0．5ul （10mmol/L）， 上、 下游引物各0．5ul （20umol/L），Taq DNA 聚合酶 0．25ul，DNA 模板 1．0ul， 加入雙蒸水至 25ul。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 2min，94℃變性 45s，51℃退火 1min，72℃延伸 1min，循環(huán) 35次，72℃延伸 10min，4℃維持終止。采用ABI3100測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1．6 結(jié)果判斷 ADAMTS－12蛋白在椎間盤(pán)髓核組織細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，根據(jù)染色強(qiáng)度分為：無(wú)著色為－，淺棕黃色為+，棕黃色為++，深棕黃色為+++，其中++～+++為陽(yáng)性表達(dá)，－～+為陰性表達(dá)。椎間盤(pán)退變?cè)贛RI T2加權(quán)像上按Pearce分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5]分為5級(jí)，等級(jí)越高，表明椎間盤(pán)退變?cè)絿?yán)重，其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)為正常椎間盤(pán)，Ⅲ～Ⅴ級(jí)為退變椎間盤(pán)。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19．0軟件，計(jì)量資料采用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 椎間盤(pán)髓核組織HE染色 正常腰椎間盤(pán)髓核細(xì)胞呈卵圓形，存在不規(guī)則的軟骨陷窩，偶可見(jiàn)少量的細(xì)胞團(tuán)及多核巨細(xì)胞，見(jiàn)圖1A，退變髓核細(xì)胞的胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡狀，出現(xiàn)軟骨細(xì)胞的“網(wǎng)巢狀”結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1B。

圖1 腰椎間盤(pán)髓核組織HE染色（×400，A：正常組織；B：退變組織）

2．2 ADAMTS－12蛋白在腰椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá) 后外層纖維環(huán)破裂患者ADAMTS－12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于后外層纖維環(huán)未破裂患者和對(duì)照組 （P＜0．05）； 后外層纖維環(huán)未破裂患者ADAMTS－12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P＜0．05）。 見(jiàn)表 1 和圖 2。

表1 ADAMTS-12蛋白在腰椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá)

2．3 ADAMTS－12 mRNA 在腰椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá) 后外層纖維環(huán)破裂患者ADAMTS－12 mRNA 表達(dá)為（0．812±0．048），明顯高于后外層纖維環(huán)未破裂患者和對(duì)照組（P＜0．05）；后外層纖維環(huán)未破裂患者 ADAMTS－12 mRNA表達(dá)為 (0．521±0．037)，明顯高于對(duì)照組（P＜0．05）。見(jiàn)表 2。

表2 ADAMTS-12 mRNA在腰椎間盤(pán)髓核組織中的表達(dá)

2．4 不同 MRI分級(jí)髓核組織 ADAMTS－12 mRNA表達(dá) MRI分級(jí)為Ⅴ級(jí)組織ADAMTS－12 mRNA表達(dá)為（0．901±0．042），明顯高于Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)組織（P＜0．05）； Ⅳ級(jí)組織 ADAMTS－12 mRNA 表達(dá)為（0．703±0．040），明顯高于Ⅲ級(jí)組織（P＜0．05）。 見(jiàn)表3。

表3 不同MRI分級(jí)髓核組織ADAMTS-12 mRNA表達(dá)

3 討論

正常人體的椎間盤(pán)具有彈性大、緩沖沖擊力強(qiáng)的特征，能夠承受較大壓力負(fù)荷，但隨著年齡增大或屈伸、擠壓、扭轉(zhuǎn)等外力作用，椎間盤(pán)發(fā)生退行性變，誘發(fā)纖維環(huán)破裂，出現(xiàn)椎間盤(pán)病變[6，7]。腰椎間盤(pán)突出是臨床骨科常見(jiàn)病，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，不僅僅是形態(tài)學(xué)上的變化，同時(shí)還伴有組織學(xué)與生化性質(zhì)變化，蛋白多糖與水含量減少、膠原類型轉(zhuǎn)化、降解酶活性升高與炎癥介質(zhì)大量釋放，這一系列變化最終導(dǎo)致椎間盤(pán)源性腰背部疼痛與神經(jīng)根病變[8，9]。

臨床研究指出，髓核50%成分為聚集蛋白聚糖，ADAMTS－12為這一類解聚蛋白聚糖酶，可以降解髓核組織，抑制軟骨細(xì)胞分化，誘發(fā)髓核退變[10]。ADAMTS－12在髓核細(xì)胞退變衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其水平變化與髓核退變間的關(guān)系已成為臨床研究的熱點(diǎn)[11]。

ADAMTS－12是臨床發(fā)現(xiàn)的一種解聚蛋白聚糖酶，由血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌合成，分子量為177．5KD[12，13]。 ADAMTS－12 羥基端血小板反應(yīng)蛋白可結(jié)合軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）表皮生長(zhǎng)因子樣功能區(qū)，加強(qiáng)纖維連接蛋白、蛋白多糖、膠原蛋白的聯(lián)系，發(fā)揮穩(wěn)定軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的作用[14，15]。本研究通過(guò)椎間盤(pán)髓核組織HE染色發(fā)現(xiàn)，正常腰椎間盤(pán)髓核細(xì)胞呈卵圓形，存在不規(guī)則的軟骨陷窩，偶可見(jiàn)少量的細(xì)胞團(tuán)及多核巨細(xì)胞，退變髓核細(xì)胞的胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡狀，出現(xiàn)軟骨細(xì)胞的“網(wǎng)巢狀”結(jié)構(gòu)，這些表現(xiàn)佐證了上述分析，同時(shí)也提示ADAMTS－12表達(dá)增強(qiáng)可作為椎間盤(pán)發(fā)生退變的重要標(biāo)志之一。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腰椎間盤(pán)組織ADAMTS－12與ADAMTS－12 mRNA的表達(dá)，結(jié)果提示，腰椎間盤(pán)髓核組織中ADAMTS－12蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為：后外層纖維環(huán)破裂＞后外層纖維環(huán)未破裂＞對(duì)照組，這說(shuō)明ADAMTS－12的確參與了患者腰椎間盤(pán)組織退變的病理過(guò)程，臨床應(yīng)定期檢查腰椎間盤(pán)組織中ADAMTS－12水平，并高度重視ADAMTS－12水平升高者，及時(shí)對(duì)其采取相應(yīng)的治療措施，改善預(yù)后。為進(jìn)一步明確ADAMTS－12與退行性腰椎間盤(pán)組織的關(guān)系，本研究觀察ADAMTS－12 mRNA在不同MRI分級(jí)髓核組織中的表達(dá)為V級(jí)＞Ⅳ級(jí)＞Ⅲ級(jí)，這表明ADAMTS－12不僅參與了腰椎間盤(pán)突出的發(fā)病過(guò)程，其水平隨著腰椎間盤(pán)組織退變程度而不斷升高。

綜上所述，退變腰椎間盤(pán)組織中ADAMTS－12的表達(dá)不同于腰椎骨折椎間盤(pán)組織，ADAMTS－12參與了腰椎間盤(pán)組織的退變過(guò)程，其表達(dá)水平與腰椎間盤(pán)組織退變程度有一定關(guān)系。