利用高分辨率熔解曲線技術(shù)進(jìn)行豬親子鑒定的研究

陳焱森，謝 蘇，沈永巧，張淑君，黃 濤

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；3. 烏蘇市畜牧獸醫(yī)站，新疆烏蘇 833300）

親子鑒 定（Identification in Disputed Paternity）是指確定是否為父親與子女的親生關(guān)系[1]。目前國內(nèi)外已經(jīng)開展了動物的親子鑒定工作，如馬匹[2]、奶牛[3]、肉牛[4]、東北虎[5]、綿羊[6]、豚鹿[7]等動物親子關(guān)系的確認(rèn)都已成功解決，但在豬上的高效親子鑒定方法還需進(jìn)一步研究，并且在豬的育種中，親子鑒定是一種防止人工出錯的有效手段。

傳統(tǒng)的親子鑒定方法有標(biāo)準(zhǔn)抗血清法、多價抗血清法與蛋白電泳區(qū)分法等方法，但準(zhǔn)確率均較低[2]。隨著微衛(wèi)星研究的深入，其在親子鑒定中的應(yīng)用逐漸增多。微衛(wèi)星是DNA重復(fù)序列[8]，故又稱簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSR）。 1998年，Jeffreys等[9]對SSR做了進(jìn)一步探究，并使之成為新一代分子遺傳標(biāo)記。對SSR產(chǎn)物的傳統(tǒng)檢測方法是在PCR反應(yīng)結(jié)束后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳[10]，后發(fā)展為可以通過毛細(xì)管電泳的方法在自動分析儀上完成，提高了工作效率，但在電泳前仍需對PCR產(chǎn)物處理（如脫鹽）。SSR的擴(kuò)增產(chǎn)物也可以在自動測序儀上進(jìn)行電泳分析，但要求PCR所用引物分別進(jìn)行熒光標(biāo)記，使成本增加。所以，尋求操作簡單、高效的SSR標(biāo)記檢測方法具有重要意義。

2003年，美國Utah大學(xué)的Wittwer實(shí)驗(yàn)室首次提出了基于新型飽和熒光染料LCGreen而發(fā)明基因突變檢測的高分辨率熔解曲線新技術(shù)（High-Resolution Melting Curve Analysis，HRM）[11]。HRM主要是根據(jù)DNA序列長度、GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，通過PCR之后的熔解曲線分析檢測PCR片段的微小序列差異，其分辨精度可以達(dá)到對單個堿基差異的區(qū)分[12-13]。陳焱森等[14]采用HRM技術(shù)成功對豬的微衛(wèi)星多態(tài)性進(jìn)行了檢測。

本次研究采用HRM技術(shù)對豬的微衛(wèi)星進(jìn)行多態(tài)性檢測，進(jìn)而進(jìn)行豬親子鑒定，期望探究出一種新的快速和準(zhǔn)確的豬親子鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)動物選自新疆天康加美育種有限公司，其中包括系譜明確的杜洛克豬9頭、長白豬6頭和大白豬33頭，各品種公母比分別為1:8、1:5與9:24，共采集豬耳組織樣48個，系譜結(jié)構(gòu)如圖1。使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒提取全基因組DNA，再利用核酸濃度測定儀測定濃度與純度，用超純水將DNA濃度稀釋到20 ng/μL，并放于-20 冰箱中備用。

圖1 48個樣品系譜

主要儀器：PCR儀（Bio-Rad，USA），垂直電泳槽（北京六一儀器廠），羅氏LightCycler?96熒光定量PCR 儀（Roche，Germany），水平電泳槽（北京六一儀器廠），電泳凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）。

HEM試劑：LightCycler 480 High Resoluting Melting Master試劑盒（Roche，Germany），熒光定量八聯(lián)管帶蓋（Roche，Germany）。非變性聚酰胺凝膠電泳主要試劑：2×Taq MasterMix（內(nèi)含染料，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。單克隆測序試劑：聚丙烯酰胺凝膠電泳DNA回收試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，北京），T載體（Promega Corporation，USA），感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京）。

1.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)的選取 從國際動物遺傳學(xué)學(xué)會（ISAU）推薦用于親子鑒定和國際糧農(nóng)組織提供的微衛(wèi)星座位中選取55個分布在各個染色體的微衛(wèi)星，并從NCBI中查詢引物，沒有查詢到結(jié)果的利用Primer 5 軟件自行設(shè)計(jì)，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體見表1。

1.3 微衛(wèi)星檢測方法

1.3.1 PAGE 檢測 PCR 反應(yīng)體系為 15 μL ：2×Taq Master-Mix 7.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol/L）和DNA 0.5 μL（25 ng/μL ），用無菌水補(bǔ)全。PCR 程序：94 120 s；95 30 s，退火溫度 30 s，72 30 s，循環(huán)35次；72 600 s。采用10%聚丙烯酰氨凝膠電泳，銀染顯色，拍照、觀察和記錄結(jié)果。

1.3.2 HRM 檢測 采用 LightCycler?480 HRM Master Mix試劑盒。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×飽和熒光染料10 μL，DNA0.5 μL（25 ng/μL） ，上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol/L）和 Mg2+2 μL，用無菌水補(bǔ)齊。PCR 程序：95 600 s；95 10 s，退火溫度（表1） 15 s，72 15 s，循環(huán)50次；95 60 s，40 60 s，65 1 s，97 1 s。PCR 結(jié)束后用 LightCycler?96SW1.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 單克隆測序 將PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，切下目的條帶，再利用DNA回收試劑盒按說明書回收DNA，連接T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，涂板過夜培養(yǎng)，挑菌，搖菌，做菌液PCR鑒定，把有目的條帶的菌液送上海生工進(jìn)行測序。

1.4 親子鑒定 基于非父排除率的方法有3種情況：第1種是雙親都未知；第2種是雙親只知其母；第3種是雙親均知。所有遺傳參數(shù)數(shù)據(jù)處理均用Cervus3.0處理。

2 結(jié) 果

2.1 微衛(wèi)星的篩選結(jié)果及基因分型 通過非變性聚酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，從55個微衛(wèi)星中篩選出12個適于HRM的微衛(wèi)星，利用HRM技術(shù)對12個微衛(wèi)星進(jìn)行多態(tài)性檢測，結(jié)果如表2所示，SW951微衛(wèi)星基因型數(shù)最多，為9個；S0107與S0003微衛(wèi)星基因型數(shù)都為8；SW511（圖2，以此為例）和SW1953微衛(wèi)星基因型數(shù)均為7個，SW72、SW271及S0005微衛(wèi)星基因型數(shù)都為6個，SW29微衛(wèi)星基因型數(shù)有5個，SW2155與SW2448微衛(wèi)星基因型數(shù)都為4個，S0218微衛(wèi)星基因型數(shù)為3個。

表1 55個候選微衛(wèi)星引物信息

續(xù)表1

表2 12個微衛(wèi)星信息（n=48）

圖2 PAGE對SW511微衛(wèi)星位點(diǎn)分型結(jié)果

2.2 HRM檢測結(jié)果 以HRM技術(shù)對所篩選到的12個微衛(wèi)星進(jìn)行多態(tài)性檢測，得到結(jié)果均與PAGE檢測結(jié)果相同。HRM檢測結(jié)果圖以SW511為例（圖3）。

圖3 HRM對SW511微衛(wèi)星位點(diǎn)分型結(jié)果

2.3 SW72微衛(wèi)星單克隆測序結(jié)果 對SW72微衛(wèi)星位點(diǎn)的所有基因型進(jìn)行單克隆測序，以檢驗(yàn)HRM技術(shù)檢測的基因型是否正確。利用PAGE獲得SW72微衛(wèi)星6個基因型的條帶（圖4），再分別切出目的條帶進(jìn)行克隆測序，結(jié)果顯示樣品1的3個條帶分別有14、10和10個重復(fù)，為雜合子；樣品5的2個條帶都有14個重復(fù)，為純合子；樣品7的3個條帶都有9個重復(fù)，為純合子；樣品8的2個條帶都有10個重復(fù)，為純合子；樣品9（圖5，以此為例）的4個條帶分別有14、9、14和9個重復(fù)，為雜合子；樣品38的3個條帶都有15個重復(fù)，為純合子。由HRM結(jié)果與測序結(jié)果對比，可以得出HRM檢測微衛(wèi)星具有準(zhǔn)確性。每個樣本切取目的條帶和測序峰圖結(jié)果展示均從上往下。

2.4 基因頻率分析結(jié)果 12個微衛(wèi)星位點(diǎn)在48個DNA樣中的結(jié)果分析，得出每個微衛(wèi)星座位的等位基因頻率（表3）。12個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因總數(shù)為50個，其中S0003、S0107、SW951和SW271等位基因?yàn)?個，SW72、SW511及SW1953等位基因?yàn)?個，SW2155、SW2448、SW29和S0005等位基因?yàn)?個，

圖4 SW72微衛(wèi)星PAGE實(shí)驗(yàn)的6個基因型結(jié)果

圖5 SW72微衛(wèi)星樣本9的測序結(jié)果

表3 12個微衛(wèi)星等位基因頻率分析

2.5 微衛(wèi)星標(biāo)記的群體遺傳學(xué)分析結(jié)果 12個微衛(wèi)星座位群體遺傳雜合度（He）平均值為0.595 478，He＞0.5表明這12個微衛(wèi)星位點(diǎn)在該群體遺傳變異程度較高；有效等位基因數(shù)（Ne）平均值為2.675 482；平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.539 842，其中S0218微衛(wèi)星位點(diǎn)為0.155 485，PIC＜0.25，屬于低度多態(tài)，SW2448為0.386 895，0.25＜PIC＜0.5，屬于中度多態(tài)，其余10個基因座多態(tài)信息含量PIC＞0.5，屬于高度多態(tài)?？傮w看來，12個微衛(wèi)星座位在48個DNA樣中呈現(xiàn)高度多態(tài)性（表4）。

表4 12個微衛(wèi)星在該群體中的遺傳參數(shù)（n=48）

2.6 非父排除率分析 利用12個微衛(wèi)星對48個樣本進(jìn)行親子鑒定。從表5可見，在2個親本信息都未知的情況下，非父排除率（E-1P）的累積非父排除率為0.940 095 767；在1個親本信息已知的情況下，另一個親本的非父排除率（E-2P）的累積非父排除率為0.991 503 613；在2個親本信息都已知的情況下，一組親本信息的非父排除率（E-PP）的累積非父排除率為0.999 875 188。

2.7 利用建立的親子鑒定體系檢測結(jié)果 利用建立的基于HRM技術(shù)對12微衛(wèi)星多態(tài)性組合檢測的親子鑒定體系，結(jié)合系譜，對其中的8個家系（3個家系均進(jìn)行2個子代檢測）的子代進(jìn)行驗(yàn)證，得到的累積非父排除率結(jié)果均大于0.999 9（表6），證明建立了豬高效的親子鑒定體系。

表5 12個基因座非父排除率分析

表6 親子鑒定結(jié)果

3 討 論

3.1 用于親子鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)中，通過聚酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)對55個微衛(wèi)星多態(tài)性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示部分前人檢測的具有多態(tài)性的微衛(wèi)星，在本實(shí)驗(yàn)群體中多態(tài)程度較低。程文科[15]在對豬的親子鑒定中，使用了S0386微衛(wèi)星位點(diǎn)，檢測出10個等位基因，而本實(shí)驗(yàn)中只檢測出2個等位基因；王淑新等[16]對云南的熱帶雨林區(qū)域中的野豬微衛(wèi)星DNA多態(tài)性研究中，檢測到IGF-1微衛(wèi)星位點(diǎn)具有5個等位基因，但本研究中只檢測到2個等位基因。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是：IGF-1與豬的體長性狀[17]和生長發(fā)育性狀相關(guān)，經(jīng)高強(qiáng)度選育的高產(chǎn)種豬可能在長期定向選育中間接對這些微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行了選擇，而使IGF-1的多態(tài)性逐漸消失。本研究中的實(shí)驗(yàn)動物來自加拿大的引進(jìn)種豬，所以本研究只檢測到2個等位基因。這也就要求在不同群體或經(jīng)過長期選育以后，需要檢查篩查微衛(wèi)星標(biāo)記變異程度。本次實(shí)驗(yàn)檢測到的具有多態(tài)性的微衛(wèi)星可用于后續(xù)親子鑒定，也更新了用于豬親子鑒定的微衛(wèi)星。

3.2 PAGE與單克隆測序檢測微衛(wèi)星多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)條件需優(yōu)化 在PAGE實(shí)驗(yàn)中，聚丙烯酰胺凝膠的濃度根據(jù)目的片段的不同而變動。本實(shí)驗(yàn)中目的片段在100～350 bp，故選用聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%～12%；由于本實(shí)驗(yàn)的檢測量大，經(jīng)歷了冬夏季節(jié)，其他條件相同時，在冬季時，需要電泳9～10 h才能得到較好的結(jié)果，而夏季只需7～8 h，所以在電泳時應(yīng)注意環(huán)境溫度變化對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的重大影響，這與張文祥[18]在電泳實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)論一致，同樣在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠時，冬季需要30～60 min，而夏季為60～90 min，只有凝膠充分凝結(jié)，才能得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這樣不宜出現(xiàn)“微笑”和模糊條帶；本實(shí)驗(yàn)在判斷基因型中，如在目的條帶的上方出現(xiàn)1條較淺的帶，則認(rèn)為是目的條帶的影子帶。

在單克隆測序?qū)嶒?yàn)中，應(yīng)對每個基因型跑3～5個重復(fù)，再對每個基因型的每個條帶進(jìn)行重復(fù)回收，以提高回收的濃度，便于單克隆測序連接；在連接時，應(yīng)使用4 過夜條件反應(yīng)，以增加連接率；在挑菌時，挑出3～5個單個菌落到LB液中，增加實(shí)驗(yàn)成功率，并在搖菌后，做菌液PCR，檢測是否轉(zhuǎn)化成功。

3.3 HRM技術(shù)檢測微衛(wèi)星多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)條件需優(yōu)化HRM鑒定微衛(wèi)星多態(tài)性時主要受模板DNA濃度、Mg2+濃度、染料和產(chǎn)物長度影響。模板DNA濃度需一致，HRM技術(shù)是一種非常靈敏的技術(shù)，若DNA濃度不同，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響[19]，這與本實(shí)驗(yàn)中預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果相同。本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中Mg2+濃度為2～2.5 mmol/L，能取得較好結(jié)果，使微衛(wèi)星不同基因型區(qū)分開，并且建議對每對引物都進(jìn)行Mg2+濃度梯度測試，與尤崇革等[20]在使用不同飽和染料利用HRM技術(shù)對SNP基因型分型能力的實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)果相似。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，使用了SYBR Green 1 和 ResoLight飽和染料，第1種染料不能區(qū)分微衛(wèi)星基因型，而第2種得到較好結(jié)果，這也與饒丹等[21]在HRM中對熒光染料比較實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論相同。本次研究通過聚酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)對于長度超過350 bp的產(chǎn)物進(jìn)行了剔除，同樣饒婷等[21]在HRM對不同擴(kuò)增片段的實(shí)驗(yàn)中表明產(chǎn)物長度會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，并與溫立斌等[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同。

以HRM技術(shù)鑒定微衛(wèi)星多態(tài)性，在整個反應(yīng)和分析過程中，真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，這與非變性聚酰胺凝膠電泳技術(shù)相比，更好地避免了在轉(zhuǎn)換過程中一些不利因素的干擾；在分析上，HRM技術(shù)更迅速和準(zhǔn)確，避免了非變性聚酰胺凝膠電泳的染色過程；在一次檢測樣本量上，HRM技術(shù)一次至少可檢測96個樣本，減少了實(shí)驗(yàn)次數(shù)；在反應(yīng)時間上，HRM技術(shù)只需要90～100 min即可得出結(jié)果，而非變性聚酰胺凝膠電泳至少需要1 d。隨著更多更高效、靈敏的HMR分析設(shè)備和飽和染料研發(fā)成功，HRM技術(shù)成本降低，加快了HRM技術(shù)的推廣。

3.4 微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多態(tài)性 等位基因數(shù)多、高度多態(tài)性、相互之間無連鎖關(guān)系、分布于多條不同染色體上是微衛(wèi)星標(biāo)記篩選的基本要求。等位基因的變異在自然界中普遍存在，對基因表達(dá)有重要的調(diào)控作用，并且其數(shù)目越多表明該位點(diǎn)在群體進(jìn)化過程中的遺傳變異越大[23]。本次研究中篩選出的12個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)平均為4.167個。余國春[24]在豬的親子鑒定研究中，采用的15個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)平均為5.2個。

PIC是檢測微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的一個指標(biāo)[25]。Botstcin等[26]研究結(jié)果表明，當(dāng)PIC＞0.5時，研究對象群體具有高度多態(tài)性；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時，具有中度多態(tài)性；當(dāng)PIC＜0.25時，具有低度多態(tài)性。本次實(shí)驗(yàn)篩選的12個微衛(wèi)星中，S0218的PIC＜0.25，屬于低度多態(tài)性，SW2448的PIC處在0.25～0.5，屬于中度多態(tài)性，為增加累計(jì)非父排除率而增加，剩余10個微衛(wèi)星的PIC均大于0.5，屬于高度多態(tài)性，12個微衛(wèi)星的平均PIC為0.539 842 167，這與馮俊偉[27]在長江江豚親子鑒定中的結(jié)果相似，其利用8個微衛(wèi)星位點(diǎn)在3個群體中的進(jìn)行了多態(tài)高低程度分析，YFPSSR63和YFPSSR67微衛(wèi)星屬于低度多態(tài)位點(diǎn)，其余均屬于高度多態(tài)座位，故本實(shí)驗(yàn)篩選的12個微衛(wèi)星能夠?qū)ωi進(jìn)行親子鑒定。

3.5 微衛(wèi)星標(biāo)記組合排除率的對比 Nechtelberger等[28]成功篩選了10個微衛(wèi)星位點(diǎn)，利用這些位點(diǎn)對采集的大白豬和長白豬以及皮特蘭豬的DNA樣進(jìn)行檢測，并通過計(jì)算得出非父排除率PE為0.920 0；Ellegren等[29]以5個微衛(wèi)星位點(diǎn)為一組復(fù)合擴(kuò)增，檢測結(jié)果達(dá)到0.980 0以上，若選用10個位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，非父排除率大大增加，可達(dá)0.999 9 ；程文科[15]采集144頭豬DNA樣，利用微衛(wèi)星技術(shù)對豬群進(jìn)行研究，結(jié)果顯示非父排除率PE可達(dá)0.9835；余國春[24]選取15對微衛(wèi)星標(biāo)記研究2個家豬品種的親緣關(guān)系，結(jié)果表明12個微衛(wèi)星位點(diǎn)鑒別個體親緣關(guān)系的準(zhǔn)確率達(dá)0.900 0以上。本研究中雙親未知、只知單親和雙親已知的3種情況計(jì)算的累積非父排除率分別為0.940 1、0.991 5和0.999 9，得到的非父排除率可以進(jìn)行豬的親子鑒定。

4 結(jié) 論

本研究通過非變性聚酰胺凝膠電泳在48個樣本中對55個微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選，得到了12個適于HRM檢測的微衛(wèi)星，并利用HRM對12個微衛(wèi)星的多態(tài)性進(jìn)行了檢測，進(jìn)而建立了以HRM技術(shù)檢測微衛(wèi)星多態(tài)性為基礎(chǔ)的快速、準(zhǔn)確的豬親子鑒定體系。