豬視黃醇結(jié)合蛋白基因研究進(jìn)展

付 玉 ，張 盼 ，張雅文 ，張 浩 ，強(qiáng)巴央宗

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物遺傳工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000）

視黃醇結(jié)合蛋白（Retinol-Binding Proteins，RBPs）是將肝中合成的維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織，以實(shí)現(xiàn)維生素A在細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。視黃醇（即維生素A）及其主要衍生物（全反式視黃酸和視黃醛）能夠調(diào)控脂肪細(xì)胞及肌纖維細(xì)胞的分化、遷移、侵襲和增殖，上皮細(xì)胞的完整性和功能，類(lèi)固醇和干擾素的生成以及免疫細(xì)胞的功能，尤其對(duì)胚胎發(fā)育有著極其重要的影響[1]。根據(jù)生物信息學(xué)分析比較序列同源性發(fā)現(xiàn)，視黃醇結(jié)合蛋白主要分為胞內(nèi)視黃醇結(jié)合蛋白（Cellular Retional Binding Protein，CRBP）和血清視黃醇結(jié)合蛋白（Serum RBP，一般簡(jiǎn)稱(chēng)為RBP）。CRBP分為 CRBP I、CRBP II、CRBP III和 CRBP IV，表達(dá)于脂肪和小腸等組織中，在胞內(nèi)起調(diào)節(jié)維生素A穩(wěn)態(tài)的作用[2-3]。 RBP主要指RBP4，它是目前已證實(shí)的唯一一類(lèi)可在血液中轉(zhuǎn)運(yùn)維生素A的蛋白，在豬中被廣泛研究[4]。豬是我國(guó)重要的肉用家養(yǎng)動(dòng)物，了解RBPs基因?qū)ωi繁殖性能、胚胎發(fā)育和肉質(zhì)性狀形成的作用有利于加快豬品種培育。

1 RBPs作用分子機(jī)制

RBPs屬a1-球蛋白的一種，主要合成于肝臟中，在機(jī)體內(nèi)負(fù)責(zé)將肝臟中的維生素A及其衍生物轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織[5]。如圖1所示，RBP轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇的作用機(jī)理主要包括：①當(dāng)靶組織需要維生素A時(shí)，酯酶會(huì)先將肝內(nèi)的維生素A水解為醇式，水解后的維生素A再與RBP及前白蛋白（Prealbumin，PA）結(jié)合形成復(fù)合體并釋放到肝臟外，隨著血液進(jìn)入到相應(yīng)的靶組織[6]。這種復(fù)合體使維生素A從脂溶性變?yōu)檩^穩(wěn)定的水溶性，另外由于細(xì)胞膜僅能識(shí)別復(fù)合體而非未結(jié)合的維生素A，因此可以減少維生素A過(guò)多而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，同時(shí)也能避免RBP經(jīng)腎小球過(guò)濾而流失。②維生素A-RBP-PA復(fù)合體隨血液流入靶細(xì)胞，RBP與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，并將維生素A釋放到細(xì)胞內(nèi)[7]。③與維生素A分開(kāi)后的RBP發(fā)生變性，不能再結(jié)合到細(xì)胞膜受體、PA或維生素A上。此時(shí)游離的小分子RBP經(jīng)過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)和腎小管的重吸收作用，在腎皮層細(xì)胞中被分解成氨基酸[8]。④進(jìn)入靶細(xì)胞的維生素A會(huì)立即與細(xì)胞膜受體結(jié)合，然后再由細(xì)胞膜內(nèi)同樣與受體結(jié)合的CRBP接收，以CRBP-維生素A復(fù)合體的形式將維生素A從膜上分離并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[9]。至此，RBPs完成了將維生素A從胞外轉(zhuǎn)到胞內(nèi)并維持其在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的整個(gè)過(guò)程。

2 豬RBPs基因的表達(dá)與調(diào)控

RBPs主要合成于肝臟，但脂肪、子宮等其他組織也有分泌，只是肝外RBPs不能動(dòng)員肝臟中的維生素A[10]。另外，由于動(dòng)物品種、器官和發(fā)育時(shí)期的差異，RBPs基因 mRNA 在哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)膜、睪丸和小腸等多種組織中表達(dá)量不同[11]。

圖1 RBP轉(zhuǎn)運(yùn)維生素A的機(jī)制和過(guò)程

在懷孕早期，子宮腔內(nèi)的分泌物有著精細(xì)的調(diào)控模式。受豬發(fā)情周期的影響，RBPs僅在發(fā)情間期的子宮而非卵巢中表達(dá)，所以卵泡液中的維生素A可能是從血漿傳遞過(guò)去，卵巢可能并不參與維生素A的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[12]。

不同組織中維生素A的傳遞效率不同，RBPs在孕體（15 d）和滋養(yǎng)層（20 d）中高表達(dá)，在尿囊絨毛膜胎盤(pán)（30～112 d）中低表達(dá)[13]。在妊娠第30天，尿囊絨毛膜胎盤(pán)發(fā)生高度血管化，而在第15～20天，滋養(yǎng)外胚層擴(kuò)大并大面積覆蓋于子宮內(nèi)膜表面，此時(shí)沒(méi)有血管運(yùn)輸維生素A，維生素A可能就與滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中的RBPs結(jié)合，然后釋放到囊胚腔供胚胎利用[13]。另外，在妊娠60 d后的豬子宮肌層中檢測(cè)到了RBPs，且其mRNA表達(dá)量快速增加，說(shuō)明RBPs合成和維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)是子宮肌層生長(zhǎng)、子宮體積增加所必需的[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)固醇 對(duì)豬子宮RBPs的合成、分泌和表達(dá)起到重要的調(diào)控作用。用黃體酮處理去除卵巢的母豬，發(fā)現(xiàn)子宮中RBPs分泌量增加，當(dāng)黃體酮表達(dá)量最高時(shí)，RBPs在黃體時(shí)期表達(dá)量最高，RBPs的mRNA水平與豬血漿中雌激素和懷孕豬子宮內(nèi)膜的黃體酮受體mRNA水平有關(guān)，黃體酮單獨(dú)作用以及黃體酮與雌激素一起作用都能增加RBPs的積累量，但是單獨(dú)的雌激素不起作用，說(shuō)明了雌激素和黃體酮在調(diào)控RBPs表達(dá)方面具有協(xié)同作用[15]。子宮中RBPs基因在豬發(fā)情周期第0、5、10天以及妊娠期第10天的表達(dá)量非常低，需要黃體酮積累到一定量時(shí)才可以檢測(cè)到，在發(fā)情期第10～12天RBPs基因表達(dá)水平開(kāi)始增加，一直增加至第15天，第18天后開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，不過(guò)配種后妊娠母豬的子宮內(nèi)膜中RBPs表達(dá)始終保持上升趨勢(shì)[16]。

3 RBPs與豬生產(chǎn)性能的關(guān)系

RBPs基因作為重要的維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在精液質(zhì)量、卵泡發(fā)育、妊娠、胚胎發(fā)育、產(chǎn)仔數(shù)和肌肉品質(zhì)等方面都發(fā)揮著重要的作用。

3.1RBPs基因?qū)ωi繁殖性能的作用 繁殖性狀是一種非常重要的經(jīng)濟(jì)性狀。缺乏維生素A會(huì)引起流產(chǎn)、繁殖力降低等不良反應(yīng)，因此維生素A是動(dòng)物繁殖的必需因子。

3.1.1 精液質(zhì)量RBP4的表達(dá)會(huì)影響公豬的繁殖性能。Sundaram等[17]研究表明，在睪丸組織中，RBP4將維生素A傳遞到靶細(xì)胞，附睪中RBP4的mRNA表達(dá)量高，影響公豬的睪丸生理功能和精液質(zhì)量，說(shuō)明該基因可能影響雄性動(dòng)物的生殖性能。Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，RBP4還與野豬精子的運(yùn)動(dòng)活力具有緊密聯(lián)系，視黃酸會(huì)影響野豬睪丸的功能和射精參數(shù)。

3.1.2 卵泡發(fā)育 維生素A在卵泡的發(fā)育和卵細(xì)胞的成熟過(guò)程中均發(fā)揮作用[19]。維生素A及其活性代謝物視黃酸是不穩(wěn)定的疏水性化合物，是細(xì)胞分化和生長(zhǎng)必不可少的。卵巢中維生素A水平隨著發(fā)情周期的變化而變化[20]，豬卵泡顆粒細(xì)胞能夠表達(dá)RBP4，在豬囊腫卵泡液中RBP4含量很高[21]，調(diào)節(jié)著卵泡的發(fā)育、成熟和排出。

3.1.3 妊娠和胚胎發(fā)育 RBP4可維持子宮內(nèi)環(huán)境，在妊娠關(guān)鍵期中發(fā)揮著不可替代的作用。豬妊娠早期的特點(diǎn)是孕體及其周?chē)訉m環(huán)境快速發(fā)育和內(nèi)分泌變化，確保豬成功妊娠。維生素A和視黃酸活躍于妊娠母豬的胎盤(pán)和胚胎中，對(duì)孕體的發(fā)育和生長(zhǎng)至關(guān)重要。胎盤(pán)的重要作用之一就是維生素A的運(yùn)輸和代謝。母豬在妊娠12～90 d的飼料中缺乏維生素A，其后代會(huì)產(chǎn)生特異性先天畸形[22]。免疫反應(yīng)性RBPs存在于妊娠15 d豬的腺體子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，在妊娠15 d豬子宮內(nèi)膜和成年豬肝臟中RBPsmRNA表達(dá)量相當(dāng)，這說(shuō)明RBPs是豬子宮主要分泌物[23]。豬的子宮內(nèi)膜和孕體分泌RBPs的現(xiàn)象也從另一方面說(shuō)明了RBPs在孕體維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)中的重要作用。對(duì)于強(qiáng)壯的孕體，RBPs的分泌會(huì)因機(jī)體需要而不斷增加；對(duì)于脆弱的孕體，RBPs的分泌會(huì)減少，防止胚胎被殺死。

3.1.4 與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性 由于RBP4基因?qū)β雅莺团咛グl(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，因此該基因與母豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)。在懷孕母豬的飲食中補(bǔ)充維生素A能夠使子宮分泌RBPs，提高產(chǎn)仔數(shù)，且相對(duì)于經(jīng)產(chǎn)母豬，RBP4對(duì)初產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù)影響更大[22]。豬RBP4基因的MspI位點(diǎn)對(duì)母豬產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響[24-25]。通過(guò)對(duì)1 300頭母豬（大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克與大白豬雜交系）進(jìn)行RBP4標(biāo)記基因型（來(lái)自英國(guó)劍橋PIC實(shí)驗(yàn)室）分析，發(fā)現(xiàn)A為有利等位基因，AA基因型與BB基因型間差異為0.26頭產(chǎn)活仔數(shù)/窩和0.5頭總產(chǎn)仔數(shù)/窩，RBP4基因加性效應(yīng)為0.15頭產(chǎn)活仔數(shù)/窩和0.23頭總產(chǎn)仔數(shù)/窩，表明RBP4基因在豬產(chǎn)仔數(shù)方面發(fā)揮中等遺傳效應(yīng)[26]。在湖南黑豬、大白豬、山東地方/培育豬種內(nèi)均發(fā)現(xiàn)RBP4的A等位基因可能是豬繁殖性能的有利等位基因[27]。楊雪等[28]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在總產(chǎn)仔數(shù)還是活產(chǎn)仔數(shù)方面，RBP4的AA 基因型均高于AB 型和BB 型，且在大白豬和長(zhǎng)白豬雜交品種中，AA基因型新生仔豬死亡率低。 因此，RBP4的AA基因型是繁殖性能的有利基因型，可用于提高豬繁殖性能的選擇輔助標(biāo)記[29]。但也有觀點(diǎn)認(rèn)為，RBP4的B等位基因是豬繁殖性能的優(yōu)勢(shì)基因[30]。

RBP4作為繁殖性能的候選基因，在不同豬種間其多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率分布和基因型效應(yīng)差別很大?？赡苁怯捎诟鞣N豬遺傳背景、豬場(chǎng)的飼養(yǎng)和選種方法以及環(huán)境等差異導(dǎo)致了不同性狀的表型差異。因此，RBP4遺傳標(biāo)記的效應(yīng)還需要在不同的品種中進(jìn)行系統(tǒng)的分析和驗(yàn)證。

3.2 RBPs對(duì)豬肉品質(zhì)性狀的作用 豬肌肉纖維細(xì)胞的組成種類(lèi)、數(shù)量和大小決定了豬肉產(chǎn)量和品質(zhì)，它們分別在胚胎發(fā)育和出生后個(gè)體的發(fā)育過(guò)程中完成。RBPs和視黃酸結(jié)合蛋白能協(xié)助體內(nèi)的維生素A和視黃酸發(fā)揮生理功能，視黃酸對(duì)細(xì)胞的增殖和分化有調(diào)節(jié)作用，所以RBPs也會(huì)對(duì)脂肪細(xì)胞和肌肉纖維細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生作用，進(jìn)而影響豬肉質(zhì)性狀[31]。

研究發(fā)現(xiàn)，RBP2-C117T位點(diǎn)的不同基因型與肌肉嫩度和大理石紋評(píng)分有著密切的關(guān)聯(lián)，推測(cè)此突變位點(diǎn)可能會(huì)影響維生素A代謝，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞和肌肉纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化以及脂肪沉積[32]。在巴克夏豬中，RBP4的等位基因B對(duì)體重達(dá)90 kg日齡、背膘厚及日增重的加性效應(yīng)分別為-1.3 d、0.70 mm和6.2 g，說(shuō)明RBP4等位基因B能夠增加巴克夏豬的生長(zhǎng)速率，有助于培育高產(chǎn)的巴克夏豬[33]。由于RBP4等位基因B也能增加豬背膘厚，因此在選育過(guò)程中也要注意合理應(yīng)用[33]。

程佳等[34]研究表明，RBP4能夠增加脂解基因ATGL和HSL的mRNA水平，降低成脂基因aP2等表達(dá)，因此推測(cè)RBP4抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化；相反，RBP4受到抑制時(shí)，成脂基因表達(dá)量升高，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累也明顯增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)RBP4主要是通過(guò)AKT參與調(diào)節(jié)insulin信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其抑制成脂作用。

4 小 結(jié)

綜上所述，RBPs通過(guò)在體內(nèi)協(xié)助維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)豬繁殖性能、胚胎生長(zhǎng)發(fā)育和肉品質(zhì)性狀的形成產(chǎn)生非常重要的影響。豬孕體RBPs和人血漿RBPs有91%的氨基酸序列同源性，人RBPs的抗體也能成功用于豬中，所以對(duì)豬RBPs的探討可能也有助于其在人類(lèi)作用方面的深入研究。此外，RBP4基因是否對(duì)不同豬種的繁殖性狀均有類(lèi)似影響，還需要進(jìn)一步深入研究。揭示RBP4對(duì)豬重要生產(chǎn)性能的作用和機(jī)制，可以為培育皮下脂肪少、產(chǎn)仔數(shù)多的豬優(yōu)良品系提供基礎(chǔ)。另外，可以考慮用基因編輯技術(shù)對(duì)RBPs進(jìn)行編輯，生產(chǎn)更高品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因豬種，提高育種進(jìn)程。