綠色魏斯氏菌實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法的建立

張藝鴿，姜曉冰,*，于 濤，孫麗瀅

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000）

綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens）[1]屬于乳桿菌目（Lactobacillales）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、魏斯氏菌屬（Weissella）[2-4]。該菌在微觀和宏觀形態(tài)方面與乳酸菌的其他代表菌株相似，特別是容易與明串珠菌（Leuconostoc）和乳桿菌（Lactobacillus）[1]混淆。綠色魏斯氏菌為革蘭氏陽性菌，呈不規(guī)則的短桿狀，兩端呈圓形或稍細(xì)小，成對或短鏈排列[5]；在MRS瓊脂培養(yǎng)基上形成透明的小菌落，呈微隆起圓形輪廓[6]。

綠色魏斯氏菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，能夠?qū)е率称诽貏e是肉制品的腐敗變質(zhì)[1,6-7]。當(dāng)暴露于氧氣中時，一些肉制品，如香腸、真空包裝肉、煙熏肉等會出現(xiàn)變綠的現(xiàn)象。綠色魏斯氏菌是造成肉制品表面出現(xiàn)黏液并發(fā)綠的主要原因[1,6]。起初，黏液僅在單個菌落周圍出現(xiàn)，之后逐漸形成一整片綠色的黏液，并從肉制品的表面向內(nèi)部滲透。綠色魏斯氏菌已經(jīng)成為威脅肉制品質(zhì)量與安全的重要腐敗菌，給肉類加工行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[6]。因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法對預(yù)防和控制綠色魏斯氏菌對食品的污染、保障食品質(zhì)量與安全具有重要意義。

目前，針對綠色魏斯氏菌的檢測方法十分有限。傳統(tǒng)的綠色魏斯氏菌檢測方法包括增菌培養(yǎng)、分離純化、鏡檢和生化鑒定等步驟，耗時長、操作繁瑣且結(jié)果可靠性低[8-10]，嚴(yán)重影響檢測鑒定的效率[11-13]。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測技術(shù)具有操作簡便、靈敏、特異、快速、直觀、定量準(zhǔn)確、閉管反應(yīng)等優(yōu)點[14-16]。食源性致病菌的檢測多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，其步驟冗繁，耗時費力[17-19]。因此，實時熒光定量PCR方法在食源性細(xì)菌檢測中已得到廣泛應(yīng)用[20-22]。Gómez-Rojo等[23]建立了針對綠色魏斯氏菌特異性基因recN的Taq Man探針實時熒光定量PCR方法，但還未見報道綠色魏斯氏菌特異性基因的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法[24-25]。本研究以綠色魏斯氏菌特異性基因rpoA為靶基因，應(yīng)用常規(guī)PCR技術(shù)[26-27]和SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR技術(shù)[28]建立快速、準(zhǔn)確檢測綠色魏斯氏菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

所用菌株如表1所示，其中綠色魏斯氏菌、糞腸鏈球菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、大腸桿菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌均為本實驗室保藏菌株，融合魏斯氏菌、食物魏斯氏菌以及乳明串珠菌由中國海洋微生物菌種保藏管理中心提供。

表1 所用菌株及其來源Table 1 Strains used in this study

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒北京天根生化科技有限公司；用于PCR擴增的試劑：Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP、2 000 bp DNA Marker寶生物工程（大連）有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DH360電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；THZ-82氣浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市天竟實驗儀器廠；ETC811基因擴增儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；TGL-16B離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；DG-800旋渦混合器 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；LightCycler@96實時熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司；NanoDropTM2000微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌基因組DNA的提取

利用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，利用分光光度計測定其濃度和純度。具體操作如下：用移液槍取1 μL DNA樣品滴加到檢測平臺上，分別讀取樣品在260、280 nm波長處的吸光度（A），A260nm反映DNA樣品的濃度，A260nm和A280nm的比值（A260nm/A280nm）反映樣品的純度。

1.3.2 引物的設(shè)計與合成

從GenBank中下載綠色魏斯氏菌的rpoA基因靶序列，登錄號為AM711320，應(yīng)用Dnaman軟件進(jìn)行同源性分析，確定在綠色魏斯氏菌菌株內(nèi)保守、其他菌株間特異的片段。應(yīng)用Primerpremier 5.0生物軟件設(shè)計1 對引物，預(yù)計擴增長度為196 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列：上游引物：5’-GATTTCGTTGGTGATGCTG-3’；下游引物：5’-CGATTGGGGTAAAGATTGA-3’。

1.3.3 PCR擴增

1.3.3.1 常規(guī)PCR反應(yīng)體系

10×Buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、上下游引物各1.5 μL、Taq酶0.125 μL、DNA模板1 μL、無菌水補足至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，接著反應(yīng)30 個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性40 s、51 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并觀察結(jié)果。

1.3.3.2 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1.5 μL、無酶水（RNase-Free ddH2O），補足至25 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性：95 ℃、15 min；變性：95 ℃、10 s；退火：60 ℃、30 s；延伸：72 ℃、30 s；反應(yīng)進(jìn)行40 個循環(huán)。

1.3.4 特異性評價

以表1所列菌株的基因組DNA為模板，并用無菌水作為無模板空白對照，按照1.3.3節(jié)所述條件進(jìn)行PCR擴增，通過觀察電泳條帶和擴增曲線分別驗證常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR方法的特異性。

1.3.5 靈敏度評價

1.3.5.1 基因組DNA靈敏度評價

將已知濃度的綠色魏斯氏菌基因組DNA進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個稀釋度的DNA樣品各取1 μL為模板，按照

1.3.3 節(jié)所述條件進(jìn)行PCR擴增，能得到肉眼可見條帶或明顯擴增曲線（“S”型擴增曲線）的最低濃度即為PCR檢測體系靈敏度。

1.3.5.2 純培養(yǎng)物檢測靈敏度評價

綠色魏斯氏菌經(jīng)純培養(yǎng)后，用MRS培養(yǎng)基做10 倍梯度稀釋，并選擇10－5、10－6和10－73 個稀釋度做平板計數(shù)，以此計算原始菌落數(shù)。同時每個稀釋度各取3 mL菌液提取DNA，取1 μL為模板，按照1.3.3節(jié)所述條件進(jìn)行PCR擴增，能得到肉眼可見條帶或明顯擴增曲線（“S”型擴增曲線）的最低濃度即為PCR檢測體系靈敏度。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確性評價

將已知濃度的綠色魏斯氏菌基因組DNA進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個稀釋度的DNA樣品各取1 μL為模板，按照1.3.3.2節(jié)所述條件進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增（每個濃度梯度3 個平行），以循環(huán)閾（circulation threshold，Ct）值為縱坐標(biāo)，DNA模板量的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

再以10 倍梯度稀釋的綠色魏斯氏菌基因組DNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR，獨立重復(fù)3 次，評價實驗結(jié)果的可重復(fù)性；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算模板的濃度，并將計算值與理論值進(jìn)行比較，評價定量結(jié)果的可靠性。

1.3.7 人工污染食品樣品檢測

取綠色魏斯氏菌菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇10-5、10-6和10-73 個稀釋度做平板計數(shù)，計算純培養(yǎng)物的初始菌落數(shù)。取若干個稀釋度（原液、10-1～10-8）的菌液各1 mL添加到25 g無菌牛肉樣品中，加入40 mL蛋白胨水，均質(zhì)2 min；取40 mL均質(zhì)液，2 000 r/min離心10 min以沉淀食品雜質(zhì)；吸取上清液轉(zhuǎn)移至干凈無菌的離心管中，10 000 r/min離心3 min后，緩慢倒掉上清液，獲得菌體沉淀，用于基因組DNA的提取；取1 μL作為模板，按照1.3.3節(jié)所述條件進(jìn)行PCR擴增，能得到肉眼可見條帶或明顯擴增曲線的最低濃度即為PCR檢測體系靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR及實時熒光定量PCR方法的特異性

表2 菌株常規(guī)PCR及實時熒光定量PCR檢測結(jié)果Table 2 Routine PCR and real-time quantitative PCR detection results

圖1 綠色魏斯氏菌常規(guī)PCR檢測結(jié)果Fig. 1 Detection of Weissella viridescens by conventional PCR

以建立的常規(guī)PCR體系對表1所列的菌株進(jìn)行檢測。由表2及圖1可知，只有綠色魏斯氏菌反應(yīng)結(jié)果為陽性，且擴增出196 bp的目的產(chǎn)物。

圖2 綠色魏斯氏菌實時熒光定量PCR擴增曲線Fig. 2 Amplification curve of quantitative real-time PCR for Weissella viridescens

圖3 綠色魏斯氏菌實時熒光定量PCR熔解曲線Fig. 3 Melting curve of quantitative real-time PCR for Weissella viridescens

利用本研究建立的綠色魏斯氏菌實時熒光定量PCR檢測方法對表1所列菌株進(jìn)行檢測。由圖2～3可知，只有綠色魏斯氏菌能夠產(chǎn)生典型的“S”型擴增曲線，綠色魏斯氏菌的熔解曲線均在85 ℃出現(xiàn)1 個目標(biāo)條帶特異熔解峰，表明所用引物的特異性強，并且穩(wěn)定性良好。

2.2 靈敏度

2.2.1 基因組DNA靈敏度

圖4 綠色魏斯氏菌基因組DNA常規(guī)PCR靈敏度檢測結(jié)果Fig. 4 Sensitivity evaluation of conventional PCR for genomic DNA from Weissella viridescens

經(jīng)過測定可知綠色魏斯氏菌基因組DNA的質(zhì)量濃度為267 ng/μL。由圖4可知，對于常規(guī)PCR體系，當(dāng)綠色魏斯氏菌基因組DNA質(zhì)量濃度低至2.667 pg/μL時仍能觀察到1 條擴增條帶，表明該方法的檢測下限為2.667 pg/μL。

圖5 綠色魏斯氏菌基因組DNA實時熒光定量PCR擴增曲線Fig. 5 Amplification curve of quantitative real-time PCR for genomic DNA from Weissella viridescens

由圖5可知，對于實時熒光定量PCR體系，當(dāng)綠色魏斯氏菌基因組DNA模板質(zhì)量濃度低至2.667×10-3pg/μL時仍能觀察到明顯的擴增曲線，因此該方法的檢測下限為2.667×10-3pg/μL。

2.2.2 純培養(yǎng)物DNA靈敏度

表3 純培養(yǎng)物DNA檢測靈敏度測定結(jié)果Table 3 Results of sensitivity evaluation for DNA of pure bacterial culture

通過平板計數(shù)可知，綠色魏斯氏菌純培養(yǎng)物的初始菌液濃度為3×109CFU/mL。由表3可知：對于常規(guī)PCR體系，當(dāng)純培養(yǎng)物濃度低至3×104CFU/mL時仍能觀察到擴增條帶，表明該方法的靈敏度為3×104CFU/mL，即30 CFU/PCR反應(yīng)；對于實時熒光定量PCR體系，當(dāng)純培養(yǎng)物濃度低至30 CFU/mL時仍能觀察到擴增曲線，則該方法的靈敏度為30 CFU/mL。

2.3 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.3.6節(jié)單獨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.46x＋16.30（R2=0.99）。曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，定量準(zhǔn)確。

2.3.2 獨立重復(fù)實驗結(jié)果分析

由表4可知：梯度稀釋DNA 3 次獨立重復(fù)實驗的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差均小于1，變異系數(shù)為0.02%～1.28%，說明檢測結(jié)果重復(fù)性好；計算結(jié)果與理論計數(shù)處于同一數(shù)量級水平，說明定量準(zhǔn)確可靠。

表4 熒光定量PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性Table 4 Accuracy analysis of the results of real time PCR detection

2.4 人工污染食品樣品檢測結(jié)果

表5 人工污染食品樣品檢測結(jié)果Table 5 Results of detection of artificial contaminated food samples

根據(jù)平板計數(shù)結(jié)果可知，綠色魏斯氏菌的初始菌液濃度為2×109CFU/mL。由表5可知：對于常規(guī)PCR體系，當(dāng)污染牛肉樣品的菌液濃度低至8×102CFU/g時仍能觀察到擴增條帶，表明該方法的檢測下限為8×102CFU/g；對于實時熒光定量PCR體系，當(dāng)污染牛肉樣品的菌液濃度低至0.8 CFU/g時仍能觀察到擴增曲線，則該方法的檢測下限為0.8 CFU/g。

3 討 論

性能優(yōu)良的引物是建立準(zhǔn)確可靠的PCR檢測體系的前提，而優(yōu)良的引物則依賴于高度特異的檢測靶基因。在前期研究中，利用生物信息學(xué)方法，對綠色魏斯氏菌種內(nèi)及種間的DNA序列進(jìn)行比對，選擇了6 條綠色魏斯氏菌種內(nèi)保守、種間特異的序列。針對這些序列設(shè)計引物并進(jìn)行PCR擴增驗證，最終選擇性能最好的1 對引物建立PCR檢測體系。該引物對應(yīng)的靶基因即為綠色魏斯氏菌的rpoA基因，該基因編碼DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶α亞基，參與DNA的復(fù)制過程，種內(nèi)高度保守。本研究根據(jù)綠色魏斯氏菌rpoA基因的保守片段設(shè)計引物，結(jié)果表明，基于rpoA基因的常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR檢測的特異性均為100%。

本研究所建立的實時熒光定量PCR方法的靈敏度達(dá)2.667×10－3pg/μL，對純培養(yǎng)物和模擬污染牛肉樣品直接檢測的靈敏度分別為30 CFU/mL和0.8 CFU/g。與常規(guī)PCR相比，實時熒光定量PCR檢測的靈敏度是其1 000 倍[29]。目前，國內(nèi)外關(guān)于綠色魏斯氏菌的快速檢測方法鮮有報道。西班牙學(xué)者Gómez-Rojo等[23]建立了針對綠色魏斯氏菌特異性基因recN的Taq Man探針實時熒光定量PCR方法[30]，該方法的靈敏度為8.2×10-2pg/PCR，相應(yīng)的平均Ct值為40.0；在人工污染布爾格斯血腸樣品試驗中，其檢測靈敏度為100 CFU/g，相應(yīng)的平均Ct值為41.6。Taq Man探針法需要專門合成特異性的探針，價格昂貴。相比之下，本研究建立的基于rpoA基因的綠色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法靈敏度更高、成本低。

實時熒光定量PCR方法獨立重復(fù)實驗結(jié)果表明，變異系數(shù)為0.02%～1.28%，表明重復(fù)性良好，實時熒光定量PCR方法能對樣品進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測。與常規(guī)PCR相比，該方法不需要電泳檢測、不使用染料溴化乙錠，安全性更高。綠色魏斯氏菌在微觀和宏觀形態(tài)方面與明串珠菌和乳桿菌十分相似，傳統(tǒng)的檢測方法有時也難以將其區(qū)分。本研究建立的綠色魏斯氏菌實時熒光定量PCR方法具有很高的特異性，能充分保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

綜上所述，本研究所建立的綠色魏斯氏菌SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法靈敏度高、特異性強，可以實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。與探針法相比，成本更低，操作更方便，適合PCR技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化推廣。