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    Rho激酶抑制劑聯(lián)合神經(jīng)生長因子促進脊髓損傷后神經(jīng)再生的實驗研究

    2018-12-20 06:09:30董春霞
    實用醫(yī)藥雜志 2018年12期
    關(guān)鍵詞:前肢軸突步態(tài)

    董春霞,金 善

    神經(jīng)生長因子(NGF)廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,屬于神經(jīng)調(diào)節(jié)因子之一,對神經(jīng)細胞的生長、分化、存活、再生和功能維護等多方面具有調(diào)控作用;同時對于受損傷的神經(jīng),可以發(fā)揮營養(yǎng)和促進修復及再生的作用。研究發(fā)現(xiàn)髓鞘源性抑制分子可以激活Rho激酶活性,而NGF可以對此過程產(chǎn)生明顯的抑制作用,因此能夠在上游途徑阻斷Rho/Rho激酶信號通路[1,2];Fasudil屬于 Rho 激酶的抑制劑,可以從下游途徑對Rho/Rho激酶信號通路進行阻斷。因此NGF聯(lián)合Rho激酶抑制劑能夠在上下游途徑同時阻斷Rho/Rho激酶信號通路,從而最大程度地促進神經(jīng)修復和再生。目前針對脊髓損傷的情況,尚未有機構(gòu)將二者聯(lián)合應用進行研究。該研究選擇應用Fasudil聯(lián)合神經(jīng)生長因子進行治療,目的在于研究二者聯(lián)合應用對大鼠脊髓損傷神經(jīng)再生的促進作用。

    1 材料與方法

    1.1 基礎資料及分組方式 該次研究共選擇40只清潔級健康的雌性SD大鼠,體重均在250~300 g。按照隨機分組的方式分成四組,每組10只,具體分為對照組,F(xiàn)asudil治療組,NGF治療組和Fasudil+NGF聯(lián)合治療組四組。其中Fasudil治療組在對大鼠進行脊髓橫斷后,立即給予腹腔注射Fasudil Hydrochloride 5 mg/kg,1次/d,同時采用微量注射泵以3μl/h的速度經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔持續(xù)注射生理鹽水20μl/d,連續(xù)注射4 W;NGF治療組每只大鼠經(jīng)微量注射泵以3μl/h的速度持續(xù)蛛網(wǎng)膜下腔注射NGF20 μl(60 μg)/d,同時腹腔注射生理鹽水(與Fasudil Hydrochloride同體積)1次/d,連續(xù)4 W;Fasudil+NGF聯(lián)合組同時腹腔注射Fasudil Hydrochloride 5 mg/kg,1次/d及微量注射泵蛛網(wǎng)膜下腔注射 NGF 3 μl/h,20 μl(60 μg)/d,連續(xù) 4 W;對照組腹腔及蛛網(wǎng)膜下腔注射等量生理鹽水。

    1.2 主要試劑 多聚甲醛 (上?;瘜W試劑廠),Mouse Anti-Tau1抗體 (美國 Millipore公司),SABC-Cy3試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司),F(xiàn)asudil Hydrochloride(天津紅日藥業(yè)有限公司),注射用鼠神經(jīng)生長因子(武漢海特生物制藥股份有限公司)。

    1.3 儀器 眼科維納斯剪(江蘇六六視覺科技股份有限公司),手術(shù)顯微鏡(上海醫(yī)療儀器廠),微量注射泵(來普LP210型),MDF-32V超低溫冰箱(日本SANYO),恒冷箱切片機(德國Leica公司),熒光顯微鏡(奧林巴斯BX51),多聚賴氨酸載玻片(上海桑戈生物科技有限公司)。

    1.4 方 法

    1.4.1 模型制備 使用10%的水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉,按照0.4 g/kg給藥劑量注射;待麻醉起效后,將大鼠取俯臥四肢外展體位固定于手術(shù)臺上。該次研究脊髓損傷位置均選擇在T10節(jié)段,根據(jù)T9~T11的骨性標志進行查找定位,然后對手術(shù)區(qū)進行備皮、消毒并鋪設無菌洞巾。在手術(shù)區(qū)域沿棘突做一約4 cm長的縱行切口,分層切開皮膚和淺筋膜,然后進行軟組織分離,至T7~T9椎板暴露;將T8的椎板和棘突咬除,并注意盡量減少對周圍脂肪組織的撕扯,以防由于椎管內(nèi)靜脈叢破裂而導致大出血。然后在顯微鏡下進行操作,將椎管和硬膜囊充分暴露出來,并剪開硬膜囊,應用眼科維納斯剪跨過脊髓背側(cè)中線將脊髓后3/4剪斷,深度約為1.5 mm(該次研究所選大鼠的脊髓深度約在2 mm左右);并用棉片對受傷位置輕壓止血,利用前期分離出的軟組織進行創(chuàng)口填塞,從而達到減少腦脊液外漏及隔絕外界炎性物質(zhì)刺激的作用,防止對脊髓繼續(xù)造成損傷;同時在創(chuàng)口撒上青霉素粉劑,按照組織分層,從肌肉到皮下、皮膚逐層進行縫合。對于假手術(shù)組所有過程與橫斷組相同,但不進行脊髓切斷。

    1.4.2 大鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管 大鼠橫斷模型制備成功后暫不完全縫合創(chuàng)口,于T10節(jié)段處蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插入硬膜外導管,導管與椎旁軟組織及皮膚固定,另一端露于皮膚外,石蠟封口,注射藥物時與微量注射泵連接。

    1.4.3 術(shù)后護理 由于脊髓神經(jīng)損傷,術(shù)后大鼠體溫調(diào)節(jié)功能嚴重失調(diào),出現(xiàn)體溫偏低的情況,所以術(shù)后應將飼養(yǎng)環(huán)境中的溫度保持在25~28℃,同時注意通風問題。術(shù)后預防性給予青霉素40萬U,肌肉注射1次/d,連續(xù)給藥7 d;同時為防止出現(xiàn)水電解質(zhì)紊亂給予生理鹽水10 ml/d,腹腔注射,連續(xù)給藥7 d;另外術(shù)后7 d內(nèi)給予含有呋喃坦啶的飲用水以防止和減輕尿路系統(tǒng)感染;術(shù)后應加強飲食營養(yǎng)支持,可給予適量餅干。術(shù)后實驗大鼠分籠飼養(yǎng),避免互相影響,墊料需要每日定時更換;同時為了避免大鼠術(shù)后出現(xiàn)下肢水腫和壓瘡,應每日進行患肢按摩,并對下肢周圍皮膚進行清洗和干燥。術(shù)后1~2 W大鼠可以恢復自主排尿功能,在此之前應通過按摩和擠壓膀胱輔助進行排尿2次/d。

    1.4.4 運動功能評價 采用 BBB(Basso,Beattie,and Bresnahan)Locomotor Rating Scale[3]運動功能評分法對大鼠的后肢運動功能進行評價,評價采用實驗操作者以外的雙人、雙盲獨立評價方式,最后按照平均值進行評分。具體標準如下:0分:后肢完全未能運動。1分:1或2個關(guān)節(jié)可以進行輕微運動,多數(shù)為膝或踝關(guān)節(jié)。2分:存在1個可以進行廣泛運動的關(guān)節(jié),可同時伴或不伴有另1個可輕微運動的關(guān)節(jié)。3分:存在2個可以進行廣泛運動的關(guān)節(jié)。4分:3個關(guān)節(jié)均可以進行輕微運動。5分:2個可輕微運動的關(guān)節(jié)和第3個可進行廣泛運動的關(guān)節(jié)。6分:2個可進行廣泛運動的關(guān)節(jié)和第3個可輕微運動的關(guān)節(jié)。7分:3個關(guān)節(jié)均可以進行廣泛運動。8分:無負重狀態(tài)下可以進行運動或足底踏地。9分:只有在靜止狀態(tài)下可以進行負重足底踏地,或者頻繁甚至持續(xù)的足背踏地。10分:負重足底步態(tài)偶爾發(fā)生,但與前肢運動并不協(xié)調(diào)。11分:負重足底步態(tài)頻繁或持續(xù),但與前肢運動并不協(xié)調(diào)。12分:負重足底步態(tài)頻繁或持續(xù),與前肢運動偶爾協(xié)調(diào)。13分:負重足底步態(tài)頻繁或持續(xù),與前肢運動協(xié)調(diào)較為頻繁。14分:持續(xù)存在負重足底步態(tài),且與前肢運動協(xié)調(diào)狀態(tài)持續(xù)存在;在剛抬腿和剛接觸地面時姿勢以內(nèi)旋或外旋為主,呈現(xiàn)出頻繁的足底步態(tài),前后肢運動持續(xù)協(xié)調(diào),偶見足背步態(tài)。15分:持續(xù)存在負重足底步態(tài),且與前肢運動協(xié)調(diào)狀態(tài)持續(xù)存在;前肢向前運動時未見或偶見趾尖交替踏地,爪子初次接觸地面時爪位與身體方向相同且較有力量。16分:持續(xù)存在負重足底步態(tài),且與前肢運動協(xié)調(diào)狀態(tài)持續(xù)存在;前肢向前運動時趾尖交替踏地較頻繁,當爪子初次接觸地面時,及立足姿勢在結(jié)束抬爪之前,爪位與身體方向相同且較有力。17分:足底步態(tài)和與前肢相協(xié)調(diào)的運動持續(xù)存在,前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁,在落爪和抬爪時,爪位與身體方向相同且較有力。18分:足底步態(tài)和與前肢運動協(xié)調(diào)狀態(tài)持續(xù)存在,前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁,在落爪和抬爪時,爪位與身體方向相同且十分有力。19分:足底步態(tài)和與前肢相協(xié)調(diào)的運動持續(xù)存在,前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁,在落爪和抬爪時,爪位與身體平行,且積極有力,大鼠尾部始終保持下垂狀態(tài)。20分:足底步態(tài)和與前肢相協(xié)調(diào)的運動持續(xù)存在,前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁,在落爪和抬爪時,爪位與身體平行且有力,大鼠尾部持續(xù)抬起狀態(tài),軀干穩(wěn)定性差。21分:連續(xù)的足底步態(tài),且步態(tài)協(xié)調(diào),腳尖持續(xù)踏地,整個過程爪位有力且與身體平行,尾部持續(xù)抬起狀態(tài),且軀干穩(wěn)定。

    特別說明:(1)足底步態(tài)是指足底與地面接觸以支持自身體重,且后肢積極進行向前方運動時足底能夠再次與地面接觸并支持體重。(2)足背步態(tài)是指在行走的過程中,足背的某個部位發(fā)揮支持體重的作用。

    1.5 脊髓組織切片制備 每次評分結(jié)束后,在四組大鼠內(nèi)各隨機抽取5只,將右心耳剪開,然后經(jīng)左心室插管到升主動脈內(nèi),首先灌注500 ml 37℃的生理鹽水,然后快速灌注250 ml 4%的多聚甲醛(pH7.4),當大鼠全身抽搐時需要首尾拉直并減緩灌注速度;1 h內(nèi)再次灌注250 ml的多聚甲醛,此時大鼠出現(xiàn)全身僵硬。完成灌注后,在脊髓橫斷上下位置各0.5 cm處取1 cm長度的損傷段脊髓,置于4%的多聚甲醛內(nèi)進行固定,時間為6 h,然后進行脫水處理、石蠟包埋,恒冷切片機內(nèi)切片,矢狀位切片厚6μm,并貼于防脫載玻片上,晾干后-20℃保存。最后應用SABC法進行RhoA和ROCK2免疫組織化學染色。

    1.6 免疫熒光染色(Tau1)方法 具體操作如下:(1)將冰凍切片在室溫環(huán)境下放置1 h,然后置入0.01mol PBS 中清洗 3 次,10min/次;(2)滴加 0.01mol PBS1∶10稀釋的正常血清封閉液,室溫10 min,除去多余液體;(3)滴加 0.01 mol PBS1∶500 稀釋的小鼠抗 Tau1 一抗,37 ℃ 2 h;(4)0.01 mol PBS 洗滌2 min×3 次;(5) 滴加 0.01 mol PBS1∶100 稀釋的生物素化抗小鼠 IgG,37 ℃ 30 min;(6)0.01 mol PBS洗滌 2 min×3 次;(7) 滴加 1∶100 稀釋的 SABCCy3,37 ℃ 30 min;(8)0.01 mol PBS 洗滌 5 min×3次;(9)1∶1 甘油 PBS 封固。

    1.7 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以 (x±s)表示,采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行完全隨機設計的方差分析,兩組之間比較行Dunnett t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    該次研究成模的40只大鼠,在4 W觀察期內(nèi),4只大鼠死亡,其中2只死于體重過低,另2只死于皮膚感染,已根據(jù)各組的條件死亡時及時給予補充。

    2.1 大鼠BBB評分對比 Fasudil治療組、NGF治療組和對照組大鼠術(shù)后3 d BBB評分為0分,F(xiàn)asudil+NGF聯(lián)合組術(shù)后3 d有部分大鼠開始出現(xiàn)后肢輕微運動;術(shù)后 7 d、14 d及 28 d時間點Fasudil+NGF聯(lián)合組、Fasudil治療組和NGF治療組BBB評分均較對照組明顯升高(P<0.05);術(shù)后各時間點Fasudil+NGF聯(lián)合組BBB評分均較Fasudil治療組和NGF治療組升高,差異有顯著性意義 (P<0.05)。 見表 1、圖 1。

    2.2 免疫熒光染色結(jié)果 Tau1為軸突標志物,陽性纖維顯示為紅色熒光,用image軟件測量陽性纖維的截面積。4 W時對照組損傷段脊髓組織內(nèi)陽性纖維數(shù)量極少;NGF治療組陽性纖維較對照組增加,但排列紊亂;Fasudil治療組陽性纖維也較對照組明顯增加,且部分陽性纖維連續(xù)性增強;Fasudil+NGF聯(lián)合組陽性纖維數(shù)量較其他三組均明顯增加,連續(xù)性也明顯增強,如表2所示具有顯著性差異(P<0.05)。相應運動功能評價見圖2。

    表1 各組大鼠不同時間點BBB評分,分)

    表1 各組大鼠不同時間點BBB評分,分)

    注:與 Fasudil組、NGF 組比較,*P<0.05;與 Fasudil組、NGF 組和 Fasudil+NGF 組比較,▲P<0.05。

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    表2 各組大鼠4周時免疫熒光染色陽性纖維截面積(mm2)

    圖1 術(shù)后不同時點運動功能

    圖2 4 W時免疫熒光染色結(jié)果

    3 討論

    當中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)出現(xiàn)損傷時,局部可發(fā)生較為復雜的生理和病理變化,同時存在著多種抑制神經(jīng)再生的因素,例如局部神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏或濃度過低,以及損傷局部出現(xiàn)再生抑制蛋白以及在損傷區(qū)形成膠質(zhì)瘢痕等情況,均不利于神經(jīng)的修復和再生。Rho/ROCK信號通路的主要生理功能為調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白的合成、降解、移動和收縮等,并參與細胞的遷移、增殖和存活等基本生命過程[4,5]。大量研究顯示,Rho/Rho激酶信號通路對損傷脊髓的神經(jīng)修復和再生具有很強的抑制作用,起到關(guān)鍵作用;因此阻斷該信號通路將有助于促進損傷后的神經(jīng)再生。神經(jīng)再生過程主要分為三個階段:軸突芽生、再生軸突的生長和延伸、恢復神經(jīng)支配原靶器官。研究發(fā)現(xiàn)Rho激酶抑制劑Fasudil能夠改善脊髓損傷后的運動功能,促進軸突再生,減輕繼發(fā)性損傷[6]。神經(jīng)生長因子(NGF)廣泛存在于各機體神經(jīng)系統(tǒng)中,屬于神經(jīng)調(diào)節(jié)因子之一,對神經(jīng)細胞的生長、分化、存活、再生和功能維護等多方面具有調(diào)控作用;同時對于受損傷的神經(jīng),NGF可以發(fā)揮營養(yǎng)和促進修復及再生的作用。對其生物學效應進行分析,主要包括以下四個方面:(1)NGF具有較強的促進神經(jīng)再生作用,可以直接對再生軸突發(fā)揮作用,通過受體介導細胞內(nèi)進行信號轉(zhuǎn)導,激活周圍各種分化因子,有效發(fā)揮神經(jīng)趨化作用,從而引導軸突生長并加快生長速度;并通過促進雪旺細胞的增殖分化,吞噬、清除細胞殘渣,為神經(jīng)元的重生提供空間,神經(jīng)膜細胞同時可以產(chǎn)生髓磷脂對神經(jīng)軸突進行包繞,恢復超微結(jié)構(gòu),從而為神經(jīng)傳導恢復打下堅實的基礎。(2)NGF具有促進神經(jīng)芽生的作用。(3)NGF對炎性反應趨化作用和再生神經(jīng)的血管形成均有促進作用。通過以上分析可見,NGF可以有效促進中樞和外周神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、成熟,既能夠維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能,又可以加快神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復[2]。同時NGF對已經(jīng)出現(xiàn)損傷的神經(jīng)元的基因表達發(fā)揮調(diào)控作用,抑制細胞凋亡,降低受損神經(jīng)細胞的死亡率,具有抑制凋亡速度的作用,從而降低神經(jīng)元的損傷程度??赡艿淖饔脵C制包括:(1)NGF可以有效促進生長相關(guān)蛋白 43mRNA (growth-associated protein,GAP-43 mRNA)的合成;(2)NGF能促進突觸素p38mRNA的表達;(3)對毒性氨基酸的釋放具有顯著的抑制作用;(4)對超氧自由基的釋放和鈣離子的超載也有顯著的抑制作用[7,8]。脊髓損傷后外源性NGF能夠發(fā)揮神經(jīng)再生修復作用,但對損傷局部再生仍然存在著抑制作用,從而使NGF不能發(fā)揮促神經(jīng)再生的最佳效果,如果在給予外源性促神經(jīng)生長因子的同時阻斷微環(huán)境中抑制神經(jīng)再生的關(guān)鍵信號傳導通路,即Rho/Rho激酶信號通路,就可以最大程度地發(fā)揮促進損傷神經(jīng)的修復和再生作用。目前針對脊髓損傷的情況,尚未有將二者聯(lián)合應用進行的研究。本研究針對大鼠脊髓損傷情況,選擇應用Fasudil聯(lián)合神經(jīng)生長因子進行治療,采用BBB評分及微管相關(guān)蛋白Tau1免疫熒光染色法觀察聯(lián)合應用對損傷后軸突再生及運動功能的改善作用,結(jié)果顯示兩者聯(lián)合應用有協(xié)同效應,能在更大程度上促進軸突再生及改善運動功能。

    鹽酸法舒地爾(fasudil hydrochloride)注射液,屬于ROCK抑制劑,可以通過競爭ROCK催化內(nèi)的ATP結(jié)合位點,發(fā)揮競爭性拮抗作用,從而阻斷ROCK活性,達到抑制Rho/Rho激酶信號通路下段的作用[9]。在Rho/Rho激酶信號通路被阻斷后,對于可以導致生長錐形成塌陷的髓鞘源性的再生抑制分子,包括Nogo2A、MAG和Omgp等的傳導受到抑制,從而使得損傷后的軸突可以繼續(xù)進行修復和再生[10]。外源性NGF的應用補充了損傷環(huán)境中神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏,同時近年來的研究還發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘源性再生抑制分子(Nogo2A、MAG和Omgp等)與NGF之間存在一個共同的低親和力受體,即p75NTR,所以通過給予外源性NGF,增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部NGF的濃度,從而大量與p75NTR發(fā)生結(jié)合,達到競爭性抑制Nogo2A、MAG和Omgp等與受體的結(jié)合,從而抑制其對 Rho 的激活[1,2]。 由此可見NGF能夠在Rho/Rho激酶信號通路的上游途徑發(fā)揮抑制作用,但由于p75NTR只是NGF的低親和受體[2],因此可能這種抑制作用并不完全。NGF與Fasudil聯(lián)合應用后,前者部分阻斷了Rho/Rho激酶信號通路的上游途徑,后者阻斷了下游途徑,兩者共同作用下在更大程度上抑制了Rho/Rho激酶信號通路的傳導,而此時NGF在再生抑制機制被阻斷的前提下能夠更有效地發(fā)揮其促神經(jīng)再生的作用,因此NGF與Fasudil的聯(lián)合應用在更大程度上促進了脊髓損傷后的軸突再生和相應的神經(jīng)功能恢復。該次研究結(jié)果顯示,聯(lián)合應用Fasudil+NGF組的大鼠術(shù)后3 d時BBB評分明顯高于對照組與單獨應用Fasudil治療和NGF治療組的大鼠(P<0.05),同時Fasudil+NGF聯(lián)合用藥組的大鼠多數(shù)在術(shù)后3 d已經(jīng)開始出現(xiàn)后肢輕微運動;之后各時間點的比較,F(xiàn)asudil+NGF聯(lián)合組的BBB評分也均高于其他三組,由此可以印證,采用Fasudil和NGF聯(lián)合用藥,分別對Rho/Rho激酶信號通路的上游和下游進行阻斷,達到徹底阻斷的作用。另外免疫熒光染色結(jié)果顯示,F(xiàn)asudil和NGF聯(lián)合應用后,軸突陽性纖維數(shù)量更多且排列整齊,連續(xù)性更強,也說明二者聯(lián)合用藥對神經(jīng)的再生具有很好的促進作用。

    綜上所述,聯(lián)合應用Fasudil與NGF可以有效促進受損脊髓神經(jīng)修復和再生,軸突纖維再生增多且連續(xù)性強,可以有效改善運動功能,兩者聯(lián)合應用將為脊髓損傷的藥物治療提供新的思路。

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