Rho激酶抑制劑聯(lián)合神經(jīng)生長因子促進脊髓損傷后神經(jīng)再生的實驗研究

董春霞，金 善

神經(jīng)生長因子（NGF）廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，屬于神經(jīng)調(diào)節(jié)因子之一，對神經(jīng)細胞的生長、分化、存活、再生和功能維護等多方面具有調(diào)控作用；同時對于受損傷的神經(jīng)，可以發(fā)揮營養(yǎng)和促進修復及再生的作用。研究發(fā)現(xiàn)髓鞘源性抑制分子可以激活Rho激酶活性，而NGF可以對此過程產(chǎn)生明顯的抑制作用，因此能夠在上游途徑阻斷Rho/Rho激酶信號通路［1，2］；Fasudil屬于 Rho 激酶的抑制劑，可以從下游途徑對Rho/Rho激酶信號通路進行阻斷。因此NGF聯(lián)合Rho激酶抑制劑能夠在上下游途徑同時阻斷Rho/Rho激酶信號通路，從而最大程度地促進神經(jīng)修復和再生。目前針對脊髓損傷的情況，尚未有機構(gòu)將二者聯(lián)合應用進行研究。該研究選擇應用Fasudil聯(lián)合神經(jīng)生長因子進行治療，目的在于研究二者聯(lián)合應用對大鼠脊髓損傷神經(jīng)再生的促進作用。

1 材料與方法

1.1 基礎資料及分組方式 該次研究共選擇40只清潔級健康的雌性SD大鼠，體重均在250～300 g。按照隨機分組的方式分成四組，每組10只，具體分為對照組，F(xiàn)asudil治療組，NGF治療組和Fasudil+NGF聯(lián)合治療組四組。其中Fasudil治療組在對大鼠進行脊髓橫斷后，立即給予腹腔注射Fasudil Hydrochloride 5 mg/kg，1次/d，同時采用微量注射泵以3μl/h的速度經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔持續(xù)注射生理鹽水20μl/d，連續(xù)注射4 W；NGF治療組每只大鼠經(jīng)微量注射泵以3μl/h的速度持續(xù)蛛網(wǎng)膜下腔注射NGF20 μl（60 μg）/d，同時腹腔注射生理鹽水（與Fasudil Hydrochloride同體積）1次/d，連續(xù)4 W；Fasudil+NGF聯(lián)合組同時腹腔注射Fasudil Hydrochloride 5 mg/kg，1次/d及微量注射泵蛛網(wǎng)膜下腔注射 NGF 3 μl/h，20 μl（60 μg）/d，連續(xù) 4 W；對照組腹腔及蛛網(wǎng)膜下腔注射等量生理鹽水。

1.2 主要試劑 多聚甲醛 （上?；瘜W試劑廠），Mouse Anti-Tau1抗體 （美國 Millipore公司），SABC-Cy3試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司），F(xiàn)asudil Hydrochloride（天津紅日藥業(yè)有限公司），注射用鼠神經(jīng)生長因子（武漢海特生物制藥股份有限公司）。

1.3 儀器 眼科維納斯剪（江蘇六六視覺科技股份有限公司），手術(shù)顯微鏡（上海醫(yī)療儀器廠），微量注射泵（來普LP210型），MDF-32V超低溫冰箱（日本SANYO），恒冷箱切片機（德國Leica公司），熒光顯微鏡（奧林巴斯BX51），多聚賴氨酸載玻片（上海桑戈生物科技有限公司）。

1.4 方 法

1.4.1 模型制備 使用10%的水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉，按照0.4 g/kg給藥劑量注射；待麻醉起效后，將大鼠取俯臥四肢外展體位固定于手術(shù)臺上。該次研究脊髓損傷位置均選擇在T10節(jié)段，根據(jù)T9～T11的骨性標志進行查找定位，然后對手術(shù)區(qū)進行備皮、消毒并鋪設無菌洞巾。在手術(shù)區(qū)域沿棘突做一約4 cm長的縱行切口，分層切開皮膚和淺筋膜，然后進行軟組織分離，至T7～T9椎板暴露；將T8的椎板和棘突咬除，并注意盡量減少對周圍脂肪組織的撕扯，以防由于椎管內(nèi)靜脈叢破裂而導致大出血。然后在顯微鏡下進行操作，將椎管和硬膜囊充分暴露出來，并剪開硬膜囊，應用眼科維納斯剪跨過脊髓背側(cè)中線將脊髓后3/4剪斷，深度約為1.5 mm（該次研究所選大鼠的脊髓深度約在2 mm左右）；并用棉片對受傷位置輕壓止血，利用前期分離出的軟組織進行創(chuàng)口填塞，從而達到減少腦脊液外漏及隔絕外界炎性物質(zhì)刺激的作用，防止對脊髓繼續(xù)造成損傷；同時在創(chuàng)口撒上青霉素粉劑，按照組織分層，從肌肉到皮下、皮膚逐層進行縫合。對于假手術(shù)組所有過程與橫斷組相同，但不進行脊髓切斷。

1.4.2 大鼠蛛網(wǎng)膜下腔置管 大鼠橫斷模型制備成功后暫不完全縫合創(chuàng)口，于T10節(jié)段處蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)插入硬膜外導管，導管與椎旁軟組織及皮膚固定，另一端露于皮膚外，石蠟封口，注射藥物時與微量注射泵連接。

1.4.3 術(shù)后護理 由于脊髓神經(jīng)損傷，術(shù)后大鼠體溫調(diào)節(jié)功能嚴重失調(diào)，出現(xiàn)體溫偏低的情況，所以術(shù)后應將飼養(yǎng)環(huán)境中的溫度保持在25～28℃，同時注意通風問題。術(shù)后預防性給予青霉素40萬U，肌肉注射1次/d，連續(xù)給藥7 d；同時為防止出現(xiàn)水電解質(zhì)紊亂給予生理鹽水10 ml/d，腹腔注射，連續(xù)給藥7 d；另外術(shù)后7 d內(nèi)給予含有呋喃坦啶的飲用水以防止和減輕尿路系統(tǒng)感染；術(shù)后應加強飲食營養(yǎng)支持，可給予適量餅干。術(shù)后實驗大鼠分籠飼養(yǎng)，避免互相影響，墊料需要每日定時更換；同時為了避免大鼠術(shù)后出現(xiàn)下肢水腫和壓瘡，應每日進行患肢按摩，并對下肢周圍皮膚進行清洗和干燥。術(shù)后1～2 W大鼠可以恢復自主排尿功能，在此之前應通過按摩和擠壓膀胱輔助進行排尿2次/d。

1.4.4 運動功能評價 采用 BBB（Basso，Beattie，and Bresnahan）Locomotor Rating Scale［3］運動功能評分法對大鼠的后肢運動功能進行評價，評價采用實驗操作者以外的雙人、雙盲獨立評價方式，最后按照平均值進行評分。具體標準如下：0分：后肢完全未能運動。1分：1或2個關(guān)節(jié)可以進行輕微運動，多數(shù)為膝或踝關(guān)節(jié)。2分：存在1個可以進行廣泛運動的關(guān)節(jié)，可同時伴或不伴有另1個可輕微運動的關(guān)節(jié)。3分：存在2個可以進行廣泛運動的關(guān)節(jié)。4分：3個關(guān)節(jié)均可以進行輕微運動。5分：2個可輕微運動的關(guān)節(jié)和第3個可進行廣泛運動的關(guān)節(jié)。6分：2個可進行廣泛運動的關(guān)節(jié)和第3個可輕微運動的關(guān)節(jié)。7分：3個關(guān)節(jié)均可以進行廣泛運動。8分：無負重狀態(tài)下可以進行運動或足底踏地。9分：只有在靜止狀態(tài)下可以進行負重足底踏地，或者頻繁甚至持續(xù)的足背踏地。10分：負重足底步態(tài)偶爾發(fā)生，但與前肢運動并不協(xié)調(diào)。11分：負重足底步態(tài)頻繁或持續(xù)，但與前肢運動并不協(xié)調(diào)。12分：負重足底步態(tài)頻繁或持續(xù)，與前肢運動偶爾協(xié)調(diào)。13分：負重足底步態(tài)頻繁或持續(xù)，與前肢運動協(xié)調(diào)較為頻繁。14分：持續(xù)存在負重足底步態(tài)，且與前肢運動協(xié)調(diào)狀態(tài)持續(xù)存在；在剛抬腿和剛接觸地面時姿勢以內(nèi)旋或外旋為主，呈現(xiàn)出頻繁的足底步態(tài)，前后肢運動持續(xù)協(xié)調(diào)，偶見足背步態(tài)。15分：持續(xù)存在負重足底步態(tài)，且與前肢運動協(xié)調(diào)狀態(tài)持續(xù)存在；前肢向前運動時未見或偶見趾尖交替踏地，爪子初次接觸地面時爪位與身體方向相同且較有力量。16分：持續(xù)存在負重足底步態(tài)，且與前肢運動協(xié)調(diào)狀態(tài)持續(xù)存在；前肢向前運動時趾尖交替踏地較頻繁，當爪子初次接觸地面時，及立足姿勢在結(jié)束抬爪之前，爪位與身體方向相同且較有力。17分：足底步態(tài)和與前肢相協(xié)調(diào)的運動持續(xù)存在，前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁，在落爪和抬爪時，爪位與身體方向相同且較有力。18分：足底步態(tài)和與前肢運動協(xié)調(diào)狀態(tài)持續(xù)存在，前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁，在落爪和抬爪時，爪位與身體方向相同且十分有力。19分：足底步態(tài)和與前肢相協(xié)調(diào)的運動持續(xù)存在，前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁，在落爪和抬爪時，爪位與身體平行，且積極有力，大鼠尾部始終保持下垂狀態(tài)。20分：足底步態(tài)和與前肢相協(xié)調(diào)的運動持續(xù)存在，前肢向前運動時趾尖交替踏地頻繁，在落爪和抬爪時，爪位與身體平行且有力，大鼠尾部持續(xù)抬起狀態(tài)，軀干穩(wěn)定性差。21分：連續(xù)的足底步態(tài)，且步態(tài)協(xié)調(diào)，腳尖持續(xù)踏地，整個過程爪位有力且與身體平行，尾部持續(xù)抬起狀態(tài)，且軀干穩(wěn)定。

特別說明：（1）足底步態(tài)是指足底與地面接觸以支持自身體重，且后肢積極進行向前方運動時足底能夠再次與地面接觸并支持體重。（2）足背步態(tài)是指在行走的過程中，足背的某個部位發(fā)揮支持體重的作用。

1.5 脊髓組織切片制備 每次評分結(jié)束后，在四組大鼠內(nèi)各隨機抽取5只，將右心耳剪開，然后經(jīng)左心室插管到升主動脈內(nèi)，首先灌注500 ml 37℃的生理鹽水，然后快速灌注250 ml 4%的多聚甲醛（pH7.4），當大鼠全身抽搐時需要首尾拉直并減緩灌注速度；1 h內(nèi)再次灌注250 ml的多聚甲醛，此時大鼠出現(xiàn)全身僵硬。完成灌注后，在脊髓橫斷上下位置各0.5 cm處取1 cm長度的損傷段脊髓，置于4%的多聚甲醛內(nèi)進行固定，時間為6 h，然后進行脫水處理、石蠟包埋，恒冷切片機內(nèi)切片，矢狀位切片厚6μm，并貼于防脫載玻片上，晾干后-20℃保存。最后應用SABC法進行RhoA和ROCK2免疫組織化學染色。

1.6 免疫熒光染色（Tau1）方法 具體操作如下：（1）將冰凍切片在室溫環(huán)境下放置1 h，然后置入0.01mol PBS 中清洗 3 次，10min/次；（2）滴加 0.01mol PBS1∶10稀釋的正常血清封閉液，室溫10 min，除去多余液體；（3）滴加 0.01 mol PBS1∶500 稀釋的小鼠抗 Tau1 一抗，37 ℃ 2 h；（4）0.01 mol PBS 洗滌2 min×3 次；（5） 滴加 0.01 mol PBS1∶100 稀釋的生物素化抗小鼠 IgG，37 ℃ 30 min；（6）0.01 mol PBS洗滌 2 min×3 次；（7） 滴加 1∶100 稀釋的 SABCCy3，37 ℃ 30 min；（8）0.01 mol PBS 洗滌 5 min×3次；（9）1∶1 甘油 PBS 封固。

1.7 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以 （x±s）表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行完全隨機設計的方差分析，兩組之間比較行Dunnett t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

該次研究成模的40只大鼠，在4 W觀察期內(nèi)，4只大鼠死亡，其中2只死于體重過低，另2只死于皮膚感染，已根據(jù)各組的條件死亡時及時給予補充。

2.1 大鼠BBB評分對比 Fasudil治療組、NGF治療組和對照組大鼠術(shù)后3 d BBB評分為0分，F(xiàn)asudil+NGF聯(lián)合組術(shù)后3 d有部分大鼠開始出現(xiàn)后肢輕微運動；術(shù)后 7 d、14 d及 28 d時間點Fasudil+NGF聯(lián)合組、Fasudil治療組和NGF治療組BBB評分均較對照組明顯升高（P＜0.05）；術(shù)后各時間點Fasudil+NGF聯(lián)合組BBB評分均較Fasudil治療組和NGF治療組升高，差異有顯著性意義 （P＜0.05）。 見表 1、圖 1。

2.2 免疫熒光染色結(jié)果 Tau1為軸突標志物，陽性纖維顯示為紅色熒光，用image軟件測量陽性纖維的截面積。4 W時對照組損傷段脊髓組織內(nèi)陽性纖維數(shù)量極少；NGF治療組陽性纖維較對照組增加，但排列紊亂；Fasudil治療組陽性纖維也較對照組明顯增加，且部分陽性纖維連續(xù)性增強；Fasudil+NGF聯(lián)合組陽性纖維數(shù)量較其他三組均明顯增加，連續(xù)性也明顯增強，如表2所示具有顯著性差異（P＜0.05）。相應運動功能評價見圖2。

表1 各組大鼠不同時間點BBB評分，分）

表1 各組大鼠不同時間點BBB評分，分）

注：與 Fasudil組、NGF 組比較，＊P＜0.05；與 Fasudil組、NGF 組和 Fasudil+NGF 組比較，▲P＜0.05。

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表2 各組大鼠4周時免疫熒光染色陽性纖維截面積（mm2）

圖1 術(shù)后不同時點運動功能

圖2 4 W時免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

當中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）出現(xiàn)損傷時，局部可發(fā)生較為復雜的生理和病理變化，同時存在著多種抑制神經(jīng)再生的因素，例如局部神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏或濃度過低，以及損傷局部出現(xiàn)再生抑制蛋白以及在損傷區(qū)形成膠質(zhì)瘢痕等情況，均不利于神經(jīng)的修復和再生。Rho/ROCK信號通路的主要生理功能為調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白的合成、降解、移動和收縮等，并參與細胞的遷移、增殖和存活等基本生命過程［4，5］。大量研究顯示，Rho/Rho激酶信號通路對損傷脊髓的神經(jīng)修復和再生具有很強的抑制作用，起到關(guān)鍵作用；因此阻斷該信號通路將有助于促進損傷后的神經(jīng)再生。神經(jīng)再生過程主要分為三個階段：軸突芽生、再生軸突的生長和延伸、恢復神經(jīng)支配原靶器官。研究發(fā)現(xiàn)Rho激酶抑制劑Fasudil能夠改善脊髓損傷后的運動功能，促進軸突再生，減輕繼發(fā)性損傷［6］。神經(jīng)生長因子（NGF）廣泛存在于各機體神經(jīng)系統(tǒng)中，屬于神經(jīng)調(diào)節(jié)因子之一，對神經(jīng)細胞的生長、分化、存活、再生和功能維護等多方面具有調(diào)控作用；同時對于受損傷的神經(jīng)，NGF可以發(fā)揮營養(yǎng)和促進修復及再生的作用。對其生物學效應進行分析，主要包括以下四個方面：（1）NGF具有較強的促進神經(jīng)再生作用，可以直接對再生軸突發(fā)揮作用，通過受體介導細胞內(nèi)進行信號轉(zhuǎn)導，激活周圍各種分化因子，有效發(fā)揮神經(jīng)趨化作用，從而引導軸突生長并加快生長速度；并通過促進雪旺細胞的增殖分化，吞噬、清除細胞殘渣，為神經(jīng)元的重生提供空間，神經(jīng)膜細胞同時可以產(chǎn)生髓磷脂對神經(jīng)軸突進行包繞，恢復超微結(jié)構(gòu)，從而為神經(jīng)傳導恢復打下堅實的基礎。（2）NGF具有促進神經(jīng)芽生的作用。（3）NGF對炎性反應趨化作用和再生神經(jīng)的血管形成均有促進作用。通過以上分析可見，NGF可以有效促進中樞和外周神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、成熟，既能夠維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，又可以加快神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復［2］。同時NGF對已經(jīng)出現(xiàn)損傷的神經(jīng)元的基因表達發(fā)揮調(diào)控作用，抑制細胞凋亡，降低受損神經(jīng)細胞的死亡率，具有抑制凋亡速度的作用，從而降低神經(jīng)元的損傷程度?？赡艿淖饔脵C制包括：（1）NGF可以有效促進生長相關(guān)蛋白 43mRNA （growth-associated protein，GAP-43 mRNA）的合成；（2）NGF能促進突觸素p38mRNA的表達；（3）對毒性氨基酸的釋放具有顯著的抑制作用；（4）對超氧自由基的釋放和鈣離子的超載也有顯著的抑制作用［7，8］。脊髓損傷后外源性NGF能夠發(fā)揮神經(jīng)再生修復作用，但對損傷局部再生仍然存在著抑制作用，從而使NGF不能發(fā)揮促神經(jīng)再生的最佳效果，如果在給予外源性促神經(jīng)生長因子的同時阻斷微環(huán)境中抑制神經(jīng)再生的關(guān)鍵信號傳導通路，即Rho/Rho激酶信號通路，就可以最大程度地發(fā)揮促進損傷神經(jīng)的修復和再生作用。目前針對脊髓損傷的情況，尚未有將二者聯(lián)合應用進行的研究。本研究針對大鼠脊髓損傷情況，選擇應用Fasudil聯(lián)合神經(jīng)生長因子進行治療，采用BBB評分及微管相關(guān)蛋白Tau1免疫熒光染色法觀察聯(lián)合應用對損傷后軸突再生及運動功能的改善作用，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合應用有協(xié)同效應，能在更大程度上促進軸突再生及改善運動功能。

鹽酸法舒地爾（fasudil hydrochloride）注射液，屬于ROCK抑制劑，可以通過競爭ROCK催化內(nèi)的ATP結(jié)合位點，發(fā)揮競爭性拮抗作用，從而阻斷ROCK活性，達到抑制Rho/Rho激酶信號通路下段的作用［9］。在Rho/Rho激酶信號通路被阻斷后，對于可以導致生長錐形成塌陷的髓鞘源性的再生抑制分子，包括Nogo2A、MAG和Omgp等的傳導受到抑制，從而使得損傷后的軸突可以繼續(xù)進行修復和再生［10］。外源性NGF的應用補充了損傷環(huán)境中神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏，同時近年來的研究還發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘源性再生抑制分子（Nogo2A、MAG和Omgp等）與NGF之間存在一個共同的低親和力受體，即p75NTR，所以通過給予外源性NGF，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部NGF的濃度，從而大量與p75NTR發(fā)生結(jié)合，達到競爭性抑制Nogo2A、MAG和Omgp等與受體的結(jié)合，從而抑制其對 Rho 的激活［1，2］。 由此可見NGF能夠在Rho/Rho激酶信號通路的上游途徑發(fā)揮抑制作用，但由于p75NTR只是NGF的低親和受體［2］，因此可能這種抑制作用并不完全。NGF與Fasudil聯(lián)合應用后，前者部分阻斷了Rho/Rho激酶信號通路的上游途徑，后者阻斷了下游途徑，兩者共同作用下在更大程度上抑制了Rho/Rho激酶信號通路的傳導，而此時NGF在再生抑制機制被阻斷的前提下能夠更有效地發(fā)揮其促神經(jīng)再生的作用，因此NGF與Fasudil的聯(lián)合應用在更大程度上促進了脊髓損傷后的軸突再生和相應的神經(jīng)功能恢復。該次研究結(jié)果顯示，聯(lián)合應用Fasudil+NGF組的大鼠術(shù)后3 d時BBB評分明顯高于對照組與單獨應用Fasudil治療和NGF治療組的大鼠（P＜0.05），同時Fasudil+NGF聯(lián)合用藥組的大鼠多數(shù)在術(shù)后3 d已經(jīng)開始出現(xiàn)后肢輕微運動；之后各時間點的比較，F(xiàn)asudil+NGF聯(lián)合組的BBB評分也均高于其他三組，由此可以印證，采用Fasudil和NGF聯(lián)合用藥，分別對Rho/Rho激酶信號通路的上游和下游進行阻斷，達到徹底阻斷的作用。另外免疫熒光染色結(jié)果顯示，F(xiàn)asudil和NGF聯(lián)合應用后，軸突陽性纖維數(shù)量更多且排列整齊，連續(xù)性更強，也說明二者聯(lián)合用藥對神經(jīng)的再生具有很好的促進作用。

綜上所述，聯(lián)合應用Fasudil與NGF可以有效促進受損脊髓神經(jīng)修復和再生，軸突纖維再生增多且連續(xù)性強，可以有效改善運動功能，兩者聯(lián)合應用將為脊髓損傷的藥物治療提供新的思路。