基于60個核心SSR標記的糯玉米自交系遺傳多樣性分析

趙文明，王 森，陳艷萍，張美景，袁建華

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 糧食作物研究所，江蘇 南京 210014)

鮮食糯玉米因其營養(yǎng)豐富，風味獨特，適口性好而成為農(nóng)產(chǎn)品新寵，深受消費者青睞，市場需求激增，種植面積逐年擴大。近年來，江蘇省糯玉米年種植面積達10萬hm2以上，已發(fā)展成為高效農(nóng)業(yè)重要組成部分，促進了農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)村發(fā)展。江蘇是國內(nèi)較早開展糯玉米育種研究的單位，擁有豐富的糯玉米種質(zhì)資源。研究江蘇糯玉米種質(zhì)和其他地區(qū)糯玉米種質(zhì)的遺傳多樣性與親緣關系，對于促進其他地區(qū)種質(zhì)在江蘇糯玉米育種中的利用、拓寬江蘇糯玉米種質(zhì)資源具有重要意義。糯玉米種質(zhì)多來源于農(nóng)家品種和雜交種，多數(shù)自交系親緣關系不清楚。SSR標記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、共顯性、操作簡單等優(yōu)點，已廣泛應用于糯玉米自交系遺傳多樣性的研究[1-12]。北京市農(nóng)林科學院玉米研究中心設計了一套適于中國玉米種質(zhì)資源、尤其是自交系研究的核心標記，包括40個核心SSR標記和20個候選核心SSR標記[13]。這些標記具有良好的穩(wěn)定性與極高的多態(tài)性，一直用于中國玉米品種一致性鑒定以及中國玉米自交系與雜交種指紋圖譜的構建[14-16]。目前，利用這些核心SSR標記對糯玉米自交系的遺傳多樣性的研究相對較少。本研究利用60個核心SSR標記分析68份糯玉米自交系的遺傳差異及親緣關系，旨在為江蘇糯玉米種質(zhì)的改良和利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為68份糯玉米自交系(見表1)。Tris、NaCl、EDTA、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、N,N′-亞甲雙丙烯酰胺、尿素、硼酸、無水乙醇、硝酸銀、10 PCR×Buffer(含MgCl2)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTP購自生工生物工程(上海)股份有限公司。NanoDrop 2000C超微量分光光度計購自美國Thermo Fisher公司，PCR儀購自中國Long Gene公司，DYCZ-20C垂直電泳槽購自北京六一生物科技有限公司。

表1 68份糯玉米自交系名稱及地理來源

1.2試驗方法

1.2.1 DNA提取與檢測 供試材料于幼苗長至4片葉時，取新鮮葉片冷凍干燥后在自動磨樣機上研磨，采用改良的CTAB法提取基因組總DNA，利用NanoDrop 2000C超微量分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量。采用滅菌超純水將DNA樣品濃度稀釋至50 ng/μL，放在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計及合成 根據(jù)文獻Development and characterization of a core set of SSR markers for fingerprinting analysis of Chinese maize varieties[13]公布的60個核心SSR標記的名稱、序列等信息(見表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增與產(chǎn)物檢測 PCR擴增反應在Long Gene公司的MG96G型PCR儀上進行。PCR反應總體系10 μL。其中，10 PCR×Buffer(含MgCl2) 2 μL、2 mmol/L dNTP 0.2 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.1 μL、DNA 模板(25 ng/μL) 1 μL、引物 1 μL、ddH2O 5.7 μL。PCR反應過程為94 ℃預變性5 min，1個循環(huán)；94 ℃預變性40 s，60 ℃復性35 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。PCR 擴增完成后，PCR產(chǎn)物利用6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳檢測，以東盛生物M1041作為DNA分子量標記。電泳完畢后，硝酸銀染色，照相。

表2 60個核心SSR標記的基本信息

續(xù)表2：

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Power-Marker V3.25軟件計算60個SSR標記在所有自交系上的等位變異數(shù)、基因多樣性(Gene diversity)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)。采用Nei′s 1973算法計算自交系間遺傳距離(GD)，利用GD值按UPGMA進行遺傳相似性聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SSR標記的多態(tài)性分析

60個核心SSR標記在68份糯玉米自交系中擴增到414個等位變異，每個標記檢測出的等位變異數(shù)為3～13個，平均為6.9個。在這些標記中，等位變異最多的是bnlg1191k7，檢測出13個；最少的則是umc1432y6，檢測出3個。60個標記的多態(tài)性信息量(PIC)介于0.4630～0.8515之間，平均為0.7144。在這些標記中，bnlg2235y5的PIC最低，為0.4630；bnlg1191k7的PIC最高，為0.8515；11個標記的 PIC>0.8。68份糯玉米自交系的基因多樣性變幅為0.4982～0.9124，平均為0.7603。60個核心標記所揭示的基因多樣性差異較大，其中，bnlg2235y5、umc1705w1、umc1432y6揭示的基因多樣性低于0.6，49個標記則超過0.7，有15個超過0.9 (見表3)。

2.2 供試材料的聚類分析

群體內(nèi)個體間親緣關系的遠近通常由遺傳距離的大小來反映。群體內(nèi)個體間遺傳距離小，說明親緣關系近，遺傳多樣性低；遺傳距離大，說明親緣關系遠，遺傳多樣性高。采用Nei′s 1973算法計算68個糯玉米自交系間遺傳距離(GD)。68個糯玉米自交系的遺傳距離，變幅為0.1800～0.9600，平均為0.7402。68份自交系的遺傳距離分析表明，89.79%的自交系間遺傳距離分布在0.6100～0.9600之間，說明供試材料間的遺傳距離較大，親緣關系較遠。其中，25.23%的遺傳距離分布在0.8100～0.9600之間，說明這些成對自交系之間的親緣關系較弱。10.21%的自交系間遺傳距離分布在0.1800～0.6000之間，表明這些自交系之間有不同程度的親緣關系。0.75%的自交系間遺傳距離分布在0.1800～0.4000之間，說明這些成對自交系間有很大的親緣相關性。68份自交系之間，靖黑糯001與JDN003的遺傳距離最大，為0.9600；DN830與LBN2586、QW85與LBN2586、QW85與衡白522之間的遺傳距離次之，為0.9400，說明這4對自交系間的親緣關系最遠。JSW0388與JSW6238的遺傳距離最小，為0.1800；JSW10684與JSW10722、T361與通系5的遺傳距離次之，為0.2200，說明這3對自交系之間親緣關系最近。此結果與自交系的來源基本一致，也表明68份糯玉米自交系有廣泛的遺傳基礎，遺傳多樣性豐富(見圖1)。

表3 60個核心SSR標記的遺傳多樣性統(tǒng)計

續(xù)表3：

2.3 供試材料的聚類分析

根據(jù)68份糯玉米自交系在60個核心SSR標記的基因型數(shù)據(jù)，運用Power Marker V3．25 軟件，采用Nei′s 1973 算法計算自交系之間的遺傳距離，構建UPGMA聚類圖，進行聚類分析。聚類分析結果表明，68份自交系被劃分為5大類群(見圖2、表4)。第一類群以JS0381為代表，包括11個自交系，稱為JS0381類群；第二類群以衡白522為代表，包括15個自交系，稱為衡白522類群；第三類群以西南地區(qū)優(yōu)良糯玉米自交系S181為代表，包括9個自交系，稱為S181類群；第四類群以通系5為代表，包括19個自交系，稱為通系5類群；第五類群包括14個自交系，這些自交系地理來源廣泛，未能明確地劃分到其他4個類群，稱為中間類群。將類群劃分結果與自交系系譜來源進行對比分析，發(fā)現(xiàn)聚類分析結果與自交系來源基本一致(見表5)。此結果表明，60個核心SSR標記可用于糯玉米自交系類群劃分。通過聚類分析和遺傳距離分析，可以將一些來源不清晰的糯玉米自交系劃分至不同的類群中，明確了與其它自交系間的親緣關系，可提高其利用效率。

圖1 68份糯玉米自交系之間的遺傳距離(GD)分布

圖2 基于SSR標記的68份糯玉米自交系UPGMA聚類圖

2.4 江蘇糯玉米雜種優(yōu)勢模式分析

合理準確地劃分玉米自交系雜種優(yōu)勢群，建立相應的雜優(yōu)模式，才能有效地改良自交系和選配雜交組合，提高育種效率和水平。糯玉米自交系雜種優(yōu)勢群的劃分和雜種優(yōu)勢利用模式的建立，有利于糯玉米育種水平的提高和發(fā)展[17]。本研究聚類分析結果表明，江蘇糯玉米自交系主要是通系5和衡白522的衍生系，劃分為通系5 類群和衡白522 類群；以此為基礎組配雜交組合，育成了蘇玉糯1號、蘇玉糯2號、蘇玉糯639、蘇玉糯901、江南花糯、蘇科花糯2008、蘇科糯3號、蘇科糯4號、蘇科糯5號、蘇科糯9號、蘇科糯1505，形成了通系5 類群×衡白522 類群的雜種優(yōu)勢利用模式。江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所以糯玉米雜交種中糯1號和FP0702為基礎材料，育成了糯玉米自交系JS0381、JS04388、JS0388、JSW10721、JSW1166，形成了JS0381類群；以糯玉米雜交種黔糯968和國家玉米產(chǎn)業(yè)技術體系交換材料WX004為基礎材料，育成了糯玉米自交系JSW15180和JSW15227，劃分到S181類群。JS0381、JS04388、JS0388、JSW10721與JS0382、JS09116、JSW10722和JSW10684組配雜交組合，育成了蘇科糯2號、蘇科糯6號、蘇科糯8號、明玉1203，形成了JS0381類群×通系5類群的雜種優(yōu)勢利用模式；JSW1166與WX004、JSW15227組配雜交組合，育成了蘇科糯10號、蘇科糯1703，形成了JS0381類群×S181類群的雜種優(yōu)勢利用模式；JS0581、JSW12471與JSW15180組配雜交組合，育成了蘇科糯1704、蘇科糯1701，形成了衡白522類群×S181類群的雜種優(yōu)勢利用模式(見表5)。本研究表明，通系5 類群×衡白522 類群仍是江蘇糯玉米育種主要的雜種優(yōu)勢模式；引進的新種質(zhì)已逐步在江蘇糯玉米育種中得到應用，拓寬了江蘇糯玉米種質(zhì)的遺傳基礎，形成了JS0381類群×通系5類群、JS0381類群×S181類群、衡白522類群×S181類群的雜種優(yōu)勢模式。盡管這些新種質(zhì)及其雜種優(yōu)勢模式目前尚未在江蘇糯玉米育種中占主導地位，但其具有較為豐富的遺傳多樣性及存在許多優(yōu)異種質(zhì)資源，這將是江蘇未來糯玉米育種取得突破的關鍵。

表4 68份糯玉米自交系類群劃分明細

3 結論與討論

3.1 糯玉米自交系的遺傳多樣性

本研究結果表明，基于60個核心SSR標記所揭示的68份糯玉米自交系的平均等位變異為6.9個，基因多樣性為0.7603，多態(tài)性信息量為0.7144，高于前人基于普通SSR標記對糯玉米自交系遺傳多樣性的分析結果[2-12]。這可能與本研究所用自交系的來源廣泛和SSR標記的多態(tài)性較高有關。

3.2糯玉米自交系的類群劃分

利用聚類分析將不同來源的糯玉米種質(zhì)進行分類，明確其親緣關系，可為糯玉米種質(zhì)的改良和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)組合的組配提供參考依據(jù)。在糯玉米自交系類群劃分研究上，前人做了較多研究。受標記數(shù)量多少、研究材料來源及數(shù)量、標準測驗種等因素的影響，不同報道在類群個數(shù)、類群名稱的確定上存在一定的差異[3-12,18]。北京市農(nóng)林科學院玉米研究中心以糯玉米雜交種中糯1號為基礎材料，育成了自交系京糯6，形成了京糯6類群；以糯玉米雜交種紫糯3號為基礎材料，育成了自交系BN2，劃分到Reid類群[18]。本研究中，江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所以糯玉米雜交種中糯1號為基礎材料，育成了自交系JS0381、JS04388、JS0388，形成了JS0381類群；京糯6與JS0381類群自交系聚類在一起，BN2與衡白522類群自交系聚類在一起。本研究利用60個核心SSR標記，通過UPGMA 聚類分析，將68份自交系劃分為5個類群，劃分結果與自交系來源基本一致，與前人報道也表現(xiàn)出了一定的一致性，說明核心SSR標記可用于糯玉米自交系遺傳多樣性分析及類群劃分，并能取得良好效果。

3.3 糯玉米雜種優(yōu)勢利用模式

玉米育種研究的關鍵在于合理準確地劃分雜種優(yōu)勢群和建立雜種優(yōu)勢利用模式。沈錦根等[17]研究認為通系5類群和衡白522類群為江蘇糯玉米主要雜種優(yōu)勢群，通系5類群×衡白522類群是主要雜優(yōu)模式。史亞興等[18]研究認為京糯6群×Reid群是我國糯玉米品種選育的主要雜優(yōu)模式。張勝恒等[19]研究認為S181類群、衡白522類群為重慶糯玉米育種主要雜優(yōu)類群，S181類群×衡白522類群為主要雜優(yōu)模式。本研究表明，通系5類群×衡白522類群仍是江蘇糯玉米育種主要的雜種優(yōu)勢模式，已形成了JS0381類群×通系5 類群、JS0381類群×S181類群、衡白522類群×S181類群的雜種優(yōu)勢模式。一些來源不清晰的糯玉米自交系被劃分至不同類群中，依據(jù)此結果進行糯玉米雜交種組配，可以避免盲目測配，提高利用效率。糯玉米育種工作中，不僅要考慮雜種優(yōu)勢，還要考慮品質(zhì)性狀、抗病性、抗蟲性、抗逆性等，培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、廣適的品種。

表5 江蘇省育成的部分糯玉米品種親本自交系系譜來源

60個核心SSR標記適用于糯玉米自交系的遺傳多樣性分析及親緣關系研究，類群劃分結果基本符合自交系的來源情況。68份糯玉米自交系的遺傳多樣性相對豐富，親緣關系較遠，作為糯玉米種質(zhì)資源利用及品種選育具有一定的價值。