不同功能菌液人工窖泥的培養(yǎng)研究

張 健，張宿義，2，秦 輝，2，楊 艷，邱川峰，徐 瓊，康承霞，羅 杰，李德林，馬 蓉，王加彬

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000； 2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000）

濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖為主要容器和基礎(chǔ)，窖泥中棲息著豐富而極其復(fù)雜的微生物菌系，其中主要的有益功能菌如己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、硫酸鹽還原菌和硝酸鹽還原菌等[1]。正是這些有益功能菌的大量生長、繁殖、代謝以及相互協(xié)調(diào)作用，才賦予了濃香型白酒的獨特香味，形成了以己酸乙酯為主體香的典型風(fēng)格[2]。窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。為了提高窖泥培養(yǎng)質(zhì)量，各大企業(yè)和專家學(xué)者對人工培養(yǎng)窖泥工作開展了大量研究，并總結(jié)形成了以優(yōu)質(zhì)的原始窖泥為基礎(chǔ)，通過添加營養(yǎng)物質(zhì)、老窖泥及各類功能菌，營造良好的環(huán)境條件，使有益功能菌迅速生長繁殖成優(yōu)勢菌群，從而培養(yǎng)出能夠達到老窖泥特性的人工窖泥[3]。人工窖泥培養(yǎng)過程中，添加的窖泥功能菌液主要有純種己酸菌培養(yǎng)液或復(fù)合功能菌液。本研究采用從100余年老窖泥中富集培養(yǎng)的復(fù)合功能菌液、分離純化的己酸菌液以及將二者按比例混合培養(yǎng)的復(fù)合菌液培養(yǎng)人工窖泥，根據(jù)窖泥培養(yǎng)過程的升溫、理化指標、微生物變化以及窖泥感官評價，對窖泥培養(yǎng)進行綜合評價及分析。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料

黃泥、窖皮泥、老窖泥、麩皮、豆粕、曲粉、磷酸氫二鉀、黃水、尾水、窖泥功能菌液、純種己酸菌液。

1.1.2 主要儀器

LRH.250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），VD-850桌上式潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），DT1002電子天平（常熟市佳衡天平儀器有限公司），BST0001萬用電爐（泰州市貝斯特電熱電器有限公司），YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），UV-1600PC紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司），窖池數(shù)顯溫度計（濟南雪納斯儀表有限公司），Agilent7890B型氣相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 窖泥功能菌液培養(yǎng)

從連續(xù)使用100余年窖底四周及中心點分別取樣后混合均勻，經(jīng)富集培養(yǎng)及多次擴培篩選出產(chǎn)己酸能力強、菌體生長旺盛且穩(wěn)定的窖泥復(fù)合功能菌液F1、F3，接種到窖泥時己酸菌數(shù)為2.6×108個/mL。分離純化己酸菌液S2、S4，接種到窖泥時菌數(shù)為3×108個/mL。窖泥復(fù)合功能菌液與純種己酸菌液按1∶1的比例混合擴大培養(yǎng)菌液，接種到窖泥時菌數(shù)為2.9×108個/mL。

1.2.2 人工窖泥培養(yǎng)方案

（1）窖泥培養(yǎng)原料：黃泥、窖皮泥、老窖泥、麩皮、豆粕、曲粉、磷酸氫二鉀、黃水、尾水，按10%比例接入窖泥功能菌液，方案設(shè)計見表1。

（2）將地面清洗干凈，把黃泥均勻鋪在地面上（厚度20～30 cm），潑上一定量的黃水和尾水，然后按比例依次將麩皮、豆粕、曲粉、窖皮泥、老窖泥層層均勻鋪在黃泥上面，再根據(jù)需要潑上一定量的黃水和尾水，最后均勻灑上磷酸氫二鉀。

（3）使用耙梳和鐵鏟將原料和黃泥拌和均勻，窖泥功能菌液采用潑灑的方式，邊潑灑菌液邊用攪拌機拌和窖泥，并根據(jù)感官判斷添加尾水。

（4）待所有原輔料拌和均勻后且窖泥柔熟后，將窖泥收堆成長條狀（2 m×2 m×0.75 m），用鐵鏟拍光，蓋上窖皮，四周用黃泥壓封，采用丟糟覆蓋保溫使其在30～40℃的環(huán)境下密封發(fā)酵90 d以上。

1.2.3 數(shù)據(jù)采集方法

每天定時定點檢測溫度，每15 d取樣測定理化指標及微生物數(shù)量，窖泥培養(yǎng)結(jié)束，經(jīng)專家鑒定其質(zhì)量后應(yīng)用于生產(chǎn)。

1.3 檢測方法

己酸菌計數(shù)方法：血球計數(shù)板法。

溫度測定：窖池數(shù)顯溫度計。

水分、pH值、氨態(tài)氮、有效磷測定：參照《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》窖泥分析[4]。

有效鉀測定：參照《土壤農(nóng)化分析》土壤中鉀的測定[5]。

腐殖質(zhì)測定：參照《森林土壤腐殖質(zhì)組成的測定》[6]。

窖泥微生物計數(shù)方法：稀釋平板法。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥培養(yǎng)過程升溫情況

窖泥培養(yǎng)過程升溫情況見圖1。

從圖1可以看出，各方案中人工窖泥在培養(yǎng)過程中溫度變化呈現(xiàn)先上升，中間維持較高溫度，后期緩慢下降的規(guī)律。培養(yǎng)前期，窖泥中營養(yǎng)物質(zhì)充足，加之殘存的氧氣，微生物快速生長繁殖產(chǎn)生大量的熱量，導(dǎo)致窖泥溫度逐漸升高，在25 d左右達到頂溫，升溫幅度在10～16℃之間，在頂溫附近維持15 d左右，而后由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累，微生物的生長及代謝活動逐漸變緩，窖泥溫度開始緩慢下降。

表1 方案設(shè)計

對比各方案可以看出，方案5和方案6中混合培養(yǎng)菌液培養(yǎng)的窖泥升溫幅度和頂溫均高于其他方案，復(fù)合功能菌液與純種己酸菌液培養(yǎng)的窖泥升溫情況相近。

2.2 窖泥培養(yǎng)過程理化指標變化情況

2.2.1 窖泥培養(yǎng)過程水分含量變化

水是細胞的重要組成部分，菌體所需營養(yǎng)物必須呈水溶液狀態(tài)才能被吸收，各種微生物的生化活動與窖泥含水量也有密切關(guān)系，水分過少時，微生物生長、繁殖困難；水分過大時，窖泥過稀，搭窖困難，使用不便，人工窖泥必須濕潤柔熟。所以，窖泥含水一般控制在35%～45%。窖泥培養(yǎng)過程水分含量變化見圖2。

由圖2可知，6個方案中，各方案起始水分含量均不超過37%，培養(yǎng)過程中窖泥水分含量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。在窖泥培養(yǎng)前45 d，窖泥水分含量明顯增加，這是由于培養(yǎng)前期，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物利用添加的有機質(zhì)等進行生長繁殖代謝，將有機質(zhì)分解成CO2、H2O、H2S、NH3等小分子物質(zhì)；后期由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及溫度過高或過低等原因，微生物生長及代謝活動減緩，水分緩慢增加。對比各方案得出，窖泥培養(yǎng)過程水分隨著培養(yǎng)時間的延長而升高，增幅相差不大，培養(yǎng)90 d后水分含量均在40%左右。

2.2.2 窖泥培養(yǎng)過程pH值變化

pH值一方面影響微生物代謝過程中一些酶的活性，超出一定的范圍都會使微生物的生長受到限制；另一方面會引起微生物細胞膜內(nèi)外電荷的變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[7]。己酸菌最適生長初始pH值為7.0，在中性或中性偏酸的條件下菌體增殖較好。窖泥培養(yǎng)過程pH值變化見圖3。

圖1 窖泥培養(yǎng)過程溫度變化情況

圖2 窖泥培養(yǎng)過程水分含量變化情況

由圖3可知，各方案在窖泥培養(yǎng)前45 d，pH值呈下降趨勢，后期pH值略有上升，后下降。主要由于前期營養(yǎng)豐富，微生物進行各種生化反應(yīng)產(chǎn)生多種有機酸。從整個培養(yǎng)過程看，pH值降低，但下降幅度不大，培養(yǎng)終點pH值均在5.1左右。各方案之間表現(xiàn)出，兩種混合培養(yǎng)菌液培養(yǎng)的窖泥pH值降低較多，純種己酸菌液培養(yǎng)的窖泥pH值降低最少，可能是混合培養(yǎng)，微生物間協(xié)同作用增強，提高了功能菌的產(chǎn)酸能力，從而使pH值下降更多。

2.2.3 窖泥培養(yǎng)過程氨態(tài)氮含量變化

氨態(tài)氮是窖泥功能菌生長、繁殖所需的主要氮源，除曲藥中本身含有一定量的氨態(tài)氮外，氨態(tài)氮是微生物分解有機質(zhì)而形成的。在使用的窖泥配方中，微生物主要可以分解豆粕、麩皮、曲藥中的有機質(zhì)而形成氨態(tài)氮。窖泥培養(yǎng)過程氨態(tài)氮含量變化見圖4。

如圖4所示，各方案窖泥中氨態(tài)氮含量總體表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢，培養(yǎng)結(jié)束后氨態(tài)氮含量在140 mg/100 g干土左右，較劉淼等[8]的研究，氨態(tài)氮含量偏低。主要是由于本文窖泥配方中所添加的氮源，均是有機氮源，除菌種培養(yǎng)基中添加少量硫酸銨以外，未單獨添加無機氮源。適宜的菌種添加量能保證有機質(zhì)的分解進而作為氮源，減少無機氮源的添加，能有效防止窖泥板結(jié)等現(xiàn)象，同時避免氨態(tài)氮積累過多，導(dǎo)致窖泥出現(xiàn)泥臭。

上周（8月13日-8月17日），市場供貨略偏緊，氯化鉀報價高位堅挺。8月20日中國氯化鉀批發(fā)價格指數(shù)（CKPI）為 2155.14點，環(huán)比上漲15.33點，漲幅為0.72%；同比上漲283.97點，漲幅為15.18%；比基期下跌1135.45點，跌幅為34.51%。

圖3 窖泥培養(yǎng)過程pH值變化情況

圖4 窖泥培養(yǎng)過程氨態(tài)氮含量變化情況

2.2.4 窖泥培養(yǎng)過程有效磷含量變化

有效磷是細胞核組成成分，也是微生物生長、繁殖的必需物質(zhì)，因此，磷是窖泥功能菌增殖的必需物質(zhì)。同時，磷又是參與乙醇、乙酸化合成己酸這一發(fā)酵過程的重要物質(zhì)[9]。窖泥培養(yǎng)過程有效磷含量變化見圖5。

如圖5所示，各方案中有效磷均呈現(xiàn)出逐漸減少的趨勢，且在前15 d下降較多，后期有效磷含量上下波動、變化較小。在人工培泥過程中，不宜加過磷酸鈣和重過磷酸鈣，由于它們含有游離的酸性強的H3PO4、H2SO4，且Ca2+易與乳酸形成沉淀，造成窖泥板結(jié)退化，本實驗方案添加磷酸氫二鉀作為磷和鉀的補充。磷、鉀一般在窖內(nèi)發(fā)酵中，從酒醅中得到補充，使含量越積越多，因此培養(yǎng)窖泥時滿足微生物生長即可，不必過量添加，否則會因無機鹽濃度過高而造成窖泥的板結(jié)，從而嚴重影響窖泥微生物的活動，致使窖泥退化。

2.2.5 窖泥培養(yǎng)過程有效鉀含量變化

窖泥培養(yǎng)過程有效鉀含量變化見圖6。

土壤中有效鉀主要為水溶性鉀和代換性鉀，它是酵母、霉菌、細菌等微生物所需的無機鹽類。雖然微生物對無機鹽需求量較少，但缺少鉀是不行的。如圖6所示，各方案中有效鉀含量在發(fā)酵過程中上下波動，總量基本維持不變。

2.2.6 窖泥培養(yǎng)過程腐殖質(zhì)含量變化

窖泥中的腐殖質(zhì)部分是在微生物酶的作用下形成的小分子化合物和微生物代謝產(chǎn)物的合成物，部分是由其他有機物腐殖化的過程形成[9]。它是窖泥水分和養(yǎng)料的貯存器，可以為窖泥微生物提供充足的水分和養(yǎng)分，具有保持窖泥營養(yǎng)，調(diào)節(jié)窖泥酸度，緩解乳酸鈣、乳酸鐵的生成，避免窖泥的板結(jié)退化等重要作用。使用時要防止因腐殖質(zhì)過量而帶來的惡臭。窖泥培養(yǎng)過程腐殖質(zhì)含量變化見圖7。如圖7所示，各方案中腐殖質(zhì)均呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，表明被窖泥微生物利用，但總體下降幅度不大；兩種混合培養(yǎng)菌液培養(yǎng)的窖泥腐殖質(zhì)含量下降最少。

圖5 窖泥培養(yǎng)過程有效磷含量變化情況

圖6 窖泥培養(yǎng)過程有效鉀含量變化情況

圖7 窖泥培養(yǎng)過程腐殖質(zhì)含量變化情況

2.3 窖泥培養(yǎng)過程微生物數(shù)量變化情況

2.3.1 窖泥中細菌總數(shù)變化

窖泥中細菌總數(shù)變化見圖8。

由圖8可知，窖泥培養(yǎng)前15 d，由于窖泥中添加的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，存在部分氧氣，且環(huán)境條件優(yōu)越，方案1、方案3、方案5、方案6窖泥中細菌數(shù)量均有明顯增加；15～50 d，氧氣逐漸被消耗，窖泥溫度較高，細菌數(shù)量緩慢增加。后期由于營養(yǎng)物質(zhì)大量被消耗，所以部分細菌開始死亡，有些細菌形成芽孢桿菌以適應(yīng)環(huán)境變化，最終細菌數(shù)量達到平衡狀態(tài)。而方案2、方案4窖泥中細菌數(shù)量整體變化幅度不大，主要原因是兩種方案窖泥培養(yǎng)添加的菌液為經(jīng)過分離純化的純種己酸菌液，雖然配方中添加老窖泥及窖皮泥中有其余窖泥功能菌存在，但數(shù)量較少。而其余方案中，所添加的復(fù)合窖泥功能菌液及混合培養(yǎng)菌液均較大程度地保留了窖泥中窖泥功能菌的多樣性，且部分菌種之間存在互利共生的關(guān)系，使其對環(huán)境有更強的適應(yīng)能力。

2.3.2 窖泥中芽孢桿菌變化

在窖泥中，芽孢桿菌是濃香型白酒生產(chǎn)的主要釀酒功能微生物。芽孢桿菌對己酸的產(chǎn)生起到非常重要的作用，正是它們使?jié)庀阈桶拙凭哂衅洫毺氐娘L(fēng)格和香味。窖泥中芽孢桿菌變化見圖9。

由圖9可以看出，6個方案中，窖泥培養(yǎng)發(fā)酵過程芽孢桿菌數(shù)量總體變化均呈先增加后減少的趨勢；在發(fā)酵進行到30 d時，方案1、方案3窖泥中芽孢桿菌數(shù)量超過其他幾種方案，達到最大值，隨后呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢；而方案2、方案4、方案5、方案6窖泥均在發(fā)酵45 d時，芽孢桿菌數(shù)量達到最大值。此后，方案5、方案6窖泥中芽孢桿菌數(shù)量高于其他幾種方案。方案1、方案3芽孢桿菌數(shù)量峰值高于其他方案且達到峰值的時間更短。分析原因可能是，通過富集培養(yǎng)的復(fù)合功能菌液菌群更豐富，在菌群的協(xié)同作用下環(huán)境適應(yīng)能力更強。

圖8 窖泥培養(yǎng)過程細菌總數(shù)變化情況

圖9 窖泥培養(yǎng)過程芽孢桿菌變化情況

2.3.3 窖泥中酵母菌數(shù)變化

窖泥中酵母菌數(shù)變化見圖10。

由圖10可看出，各方案在發(fā)酵前15 d，酵母菌數(shù)量均有所下降，在后期培養(yǎng)過程基本呈現(xiàn)出增加、減少交替出現(xiàn)的趨勢?？傮w來看，方案2、方案4窖泥中酵母菌數(shù)總體變化不大，其他方案窖泥中酵母菌數(shù)變化明顯，培養(yǎng)結(jié)束后，酵母菌數(shù)量明顯增加。

2.3.4 窖泥中霉菌總數(shù)變化

窖泥中霉菌總數(shù)變化見圖11。

由圖11可看出，方案2、方案4窖泥中霉菌數(shù)總體變化不大，其余4種方案窖泥在發(fā)酵前15 d，霉菌數(shù)量大幅下降，這同任道群等[10]研究的霉菌前期變化規(guī)律一致，培養(yǎng)75 d后有所增加。

在窖泥培養(yǎng)過程中，微生物總體呈現(xiàn)態(tài)勢為細菌總數(shù)＞芽孢桿菌＞霉菌＞酵母。通過對比可以大致得出，以富集培養(yǎng)的復(fù)合功能菌液和混合培養(yǎng)的菌液接種培養(yǎng)的窖泥中，細菌、芽孢桿菌、霉菌和酵母數(shù)量都高于純種己酸菌液，且混合培養(yǎng)的各種微生物數(shù)量又高于富集培養(yǎng)的復(fù)合菌液，主要是因為：富集培養(yǎng)液和混合培養(yǎng)菌液生物多樣性高，菌群更豐富，各種微生物間相互促進、互利共生；同時，純菌種繁殖代謝能力強，菌株強壯，畸形率低，能較穩(wěn)定的保持生長優(yōu)勢。

2.4 窖泥感官評價

由于各廠家窖泥培養(yǎng)過程中添加的窖泥功能菌液比例、各種配料的種類及比例不同，導(dǎo)致各理化及微生物指標差異較大，亦沒有相關(guān)標準對窖泥質(zhì)量等級進行劃分，因此窖泥質(zhì)量以感官鑒定為主。在窖泥90 d發(fā)酵結(jié)束后，對不同窖泥進行感官評價，結(jié)果見表2。

圖10 窖泥培養(yǎng)過程酵母菌變化情況

圖11 窖泥培養(yǎng)過程霉菌總數(shù)變化情況

表2 不同方案人工窖泥的感官鑒定

從各方案窖泥感官鑒定看來，方案2、方案4窖泥氣味比較單一、缺少窖香味，而各方案窖泥老熟程度差異不大。

3 總結(jié)

添加不同窖泥功能菌液培養(yǎng)人工窖泥，其發(fā)酵正常，升溫幅度及維持頂溫的時間相差不大；各方案理化指標變化規(guī)律趨于一致，數(shù)量上有一定差異：均表現(xiàn)出窖泥水分、氨態(tài)氮含量隨著發(fā)酵的進行逐漸增加，窖泥pH值、有效磷、腐殖質(zhì)隨著發(fā)酵的進行逐漸減少，窖泥中有效鉀含量變化不大。各方案微生物數(shù)量呈現(xiàn)出細菌總數(shù)、芽孢桿菌先增加后減少；酵母菌及霉菌由于其數(shù)量較少，規(guī)律性不強。對比各方案微生物可以得出，添加復(fù)合功能菌液和混合培養(yǎng)菌液的4種窖泥培養(yǎng)方案，在各微生物數(shù)量上優(yōu)于添加純種己酸菌液；且此4種方案的感官評價結(jié)果亦較優(yōu)。后期，將6種方案培養(yǎng)的窖泥應(yīng)用于同一班組不同窖池，在相同工藝參數(shù)的情況下，跟蹤幾排產(chǎn)酒情況，綜合評價窖泥質(zhì)量。