利用數(shù)字PCR法檢測(cè)肺癌患者血漿游離DNA 中T790M突變

王俊 李瑋 胡穎熹 石立彥 謝宇鋒 喻正源（通訊作者）

（1 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 江蘇 蘇州 215000）

（2 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科 江蘇 蘇州 215000）

肺癌位于世界癌癥之首，而大量肺癌患者存在著表皮生長(zhǎng)因子受體突變。絡(luò)氨酸激酶抑制劑是表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性的晚期非小細(xì)胞肺癌患者首選靶向治療藥物。但是患者在服藥后在一定時(shí)期內(nèi)會(huì)不可避免的出現(xiàn)耐藥，而在耐藥患者中有50%存在T790M突變[1-2]。阿斯利康最新生產(chǎn)的泰瑞沙能夠有效治療T790M突變的患者[3-4]，因此對(duì)T790M突變檢測(cè)顯得尤為重要。晚期肺癌患者穿刺活檢存在較大風(fēng)險(xiǎn)，患者也要承受較大痛苦，近年來(lái)液態(tài)活檢由于采樣方便、創(chuàng)傷小逐漸成為一種重要腫瘤患者基因檢測(cè)手段，目前主流檢測(cè)方法有二代測(cè)序，ARMS法等，而數(shù)字PCR最近逐漸成為一種新興的液態(tài)活檢方法。本研究對(duì)40例經(jīng)穿刺活檢后對(duì)組織進(jìn)行ARMS法檢測(cè)證實(shí)存在T790M突變的肺癌患者的血漿游離DNA進(jìn)行數(shù)字PCR法和ARMS法的T790M突變檢測(cè)，并對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，以探討數(shù)字PCR法作為一種新的檢測(cè)方法在血漿游離DNA中檢測(cè)T790M突變的效果。

1.樣本來(lái)源及檢測(cè)方法

1.1 收集2015年3月—2018年6月期間在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理確診為肺腺癌患者活檢石蠟組織157例，其中活檢組織用ARMS法確認(rèn)為T790M突變陽(yáng)性的患者40例。40例樣本中男性18例，女性22例，臨床分期為Ⅲ到Ⅳ期。平均年齡59歲。采集這40例患者的外周血標(biāo)本。同時(shí)采集20例健康志愿人群外周血標(biāo)本。均采用10ml無(wú)創(chuàng)cell free DNA專用采血管（美國(guó)streck公司），采血后2h內(nèi)進(jìn)行1200g離心10min，吸取上層血漿轉(zhuǎn)移至2ml離心管，15000g離心12min，吸取上層血漿進(jìn)行游離DNA提取。

1.2 血漿游離DNA的提取

使用血清/血漿游離DNA分離試劑盒（德國(guó)qiagen公司）抽提血漿游離DNA。提取的DNA使用qubit2.0（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行濃度定量。

1.3 血漿游離DNA

T790M突變檢測(cè) 采用數(shù)字微滴式PCR儀 QX200（美國(guó)Bio-Rod公司）及伯樂(lè)數(shù)字PCR T790M突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中T790M突變。采用羅氏480熒光定量PCR儀（美國(guó)羅氏公司）及人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（中國(guó)廈門艾德公司）檢測(cè)標(biāo)本中T790M突變。結(jié)果判讀均參照說(shuō)明書(shū)指示。

2.結(jié)果

2.1 40例肺癌患者血漿游離DNA T790M突變結(jié)果

40例患者血漿標(biāo)本中使用數(shù)字PCR法檢測(cè)到32例T790M突變陽(yáng)性，8例陰性。ARMS法檢測(cè)到27例T790M突變陽(yáng)性，13例陰性。數(shù)字PCR T790M突變檢測(cè)敏感度為80%，ARMS法T790M突變檢測(cè)敏感度為67.5%。數(shù)字PCR法和ARMS法T790M突變檢測(cè)一致率為87.5%。見(jiàn)表。

表 數(shù)字PCR法和ARMS法檢測(cè)40例肺腺癌患者血漿游離DNA T790M突變結(jié)果

2.2 2 0 例健康志愿者血漿游離DNA T790M突變結(jié)果

20例健康志愿者血漿標(biāo)本中數(shù)字PCR法和ARMS法檢測(cè)790M突變結(jié)果均為陰性。數(shù)字PCR法和ARMS法T790M突變檢測(cè)特異度均為100%。

3.討論

絡(luò)氨酸激酶抑制劑是表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性的肺腺癌患者的重要靶向藥物，故對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體突變情況的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)肺癌患者的診治至關(guān)重要。阿斯利康最新研發(fā)的泰瑞沙在T790M耐藥突變的肺腺癌進(jìn)展患者上體現(xiàn)出了非常好的治療效果。我們?cè)?0例患者血漿標(biāo)本中使用數(shù)字PCR法檢測(cè)到32例T790M突變陽(yáng)性，8例陰性。ARMS法檢測(cè)到27例T790M突變陽(yáng)性，13例陰性，20例健康志愿者血漿標(biāo)本使用數(shù)字PCR法和ARMS法檢測(cè)T790M突變均為陰性。這個(gè)結(jié)果顯示數(shù)字PCR在血漿游離DNA基因檢測(cè)上體現(xiàn)出了非常好的敏感性和特異性，未來(lái)可以在血漿游離DNA基因檢測(cè)上成為一種非常重要的檢測(cè)方法進(jìn)行補(bǔ)充。而受限于血漿游離DNA易降解，以及腫瘤時(shí)空異質(zhì)性等客觀情況，目前和活檢組織的檢測(cè)敏感度還存在一定的差別，未來(lái)隨著數(shù)字PCR檢測(cè)方法的改進(jìn)，以及血漿游離DNA保存和提取的工藝提升，相信數(shù)字PCR法的檢測(cè)靈敏度還會(huì)有進(jìn)一步的提高。