毛竹林集約經(jīng)營(yíng)對(duì)土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

劉彩霞,周 燕,徐秋芳,*,陳俊輝,秦 華,李永春,梁 雪

1 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江農(nóng)林大學(xué),臨安 311300 2 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,臨安 311300

毛竹(Phyllostachypubescens) 又稱楠竹,多年生禾本科剛竹屬植物,主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū),是我國(guó)分布最廣、面積最大的經(jīng)濟(jì)竹種。據(jù)第八次全國(guó)森林資源清查報(bào)告顯示,毛竹面積已達(dá)443.01萬(wàn)hm2,占我國(guó)竹林總面積的73.7%[1]。二十世紀(jì)八九十年代我國(guó)南方地區(qū)開始大規(guī)模推行以施用化肥為主要特征的集約化經(jīng)營(yíng),這一措施提高了當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的收入,但長(zhǎng)期集約化經(jīng)營(yíng)也給生態(tài)環(huán)境帶來一系列負(fù)面影響。土壤中積累的大量養(yǎng)分元素通過地表徑流、滲濾和淋溶的方式進(jìn)入地表和地下水,造成農(nóng)業(yè)面源污染[2- 4]。更重要的是不同學(xué)者已研究發(fā)現(xiàn)施肥、翻耕等集約化經(jīng)營(yíng)措施導(dǎo)致了毛竹林土壤三大菌群細(xì)菌、真菌和放線菌[5-6]以及某些功能菌群如固氮菌[7]和氨氧化菌[8]群落結(jié)構(gòu)的變化。

土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)顯著影響土壤生態(tài)系統(tǒng)過程和功能的發(fā)揮,特別是地球生物化學(xué)碳循環(huán)過程[9]。生物固碳是地球生物化學(xué)碳循環(huán)中的重要環(huán)節(jié),自然界中固定CO2的生物主要有植物和自養(yǎng)微生物,其中自養(yǎng)微生物具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,廣泛存在于草地[10]、森林[11]、水稻土[12],和海洋深處[13]不同的生態(tài)系統(tǒng)中。自養(yǎng)微生物主要通過同化CO2并將其轉(zhuǎn)化為土壤有機(jī)碳來調(diào)節(jié)大氣中CO2濃度和提高土壤的碳固定[14],對(duì)減緩大氣CO2濃度升高發(fā)揮著不可忽視的作用。自養(yǎng)微生物迄今為止發(fā)現(xiàn)的5條固碳途徑中,卡爾文循環(huán)是自養(yǎng)微生物同化大氣 CO2的主要調(diào)控途徑[15],1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)是該過程中的關(guān)鍵酶。自然界存在的不同類型RubisCO,按照其結(jié)構(gòu)、催化性能和對(duì)O2的敏感性可分為4種,依次為RubisCOⅠ至RubisCO Ⅳ[16]。cbbL是RubisCOⅠ的編碼基因,且具有高度保守性,已被用于農(nóng)田[14]、草地[10]、湖泊海洋[13],等不同生態(tài)環(huán)境中固碳微生物群落多樣性的研究。

不同學(xué)者分別對(duì)福建、湖南、江西以及四川等毛竹主產(chǎn)區(qū)的毛竹林生態(tài)系統(tǒng)碳貯量進(jìn)行估算,證實(shí)了毛竹林生態(tài)系統(tǒng)極強(qiáng)的年固碳能力[17-19]。同時(shí)發(fā)現(xiàn),毛竹林土壤中貯存的碳量明顯高于毛竹喬木層碳,周國(guó)模等[20]利用標(biāo)準(zhǔn)樣方法估算毛竹林生態(tài)系統(tǒng)碳貯量為106.33 t/hm2,其中0—60 cm土壤層碳貯量為71.47 t/hm2,喬木層為30.580 t/hm2,土壤層碳貯量約為喬木層碳貯量2.3倍。近年來關(guān)于毛竹林地上部分固碳作用及毛竹林生態(tài)系統(tǒng)貯碳量已被廣泛研究[21- 22],而土壤微生物在毛竹林生態(tài)系統(tǒng)中的固碳作用卻未見報(bào)道。本研究假設(shè),集約經(jīng)營(yíng)可能對(duì)土壤固碳微生物活動(dòng)產(chǎn)生影響。本研究選取不同集約經(jīng)營(yíng)歷史的毛竹林地土壤,揭示集約經(jīng)營(yíng)對(duì)毛竹林土壤固碳cbbL基因的豐度和群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響,以期為毛竹林的固碳潛力及可持續(xù)土壤管理提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省麗水市遂昌縣,介于118°41′—119°30′E,28°13′—18°49′N之間,坡度20—25°,向陽(yáng),屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū),多年平均氣溫16.8℃,無霜期251 d,降水量1510 mm。母巖為由花崗巖變質(zhì)的片麻巖石,壤土,土壤深厚、疏松,土層厚度大于1 m。1989年之前為竹林管理粗放經(jīng)營(yíng),以劈山、墾復(fù)為主,不施用任何肥料,毛竹密度為1800株/hm2左右。1989年后陸續(xù)在不同地塊開始實(shí)施以施肥翻耕為主的集約經(jīng)營(yíng)管理,林下基本沒有灌木雜草,毛竹平均密度約3250株/hm2左右。施肥方法為:大量出筍的大年,在6月份留養(yǎng)的新竹葉子完全展開后,在每株毛竹的上方開出環(huán)形溝,施用尿素(或碳銨)450 kg/hm2;2000—2010年期間進(jìn)行配方施肥,用量為尿素450 kg/hm2,過磷酸鈣380 kg/hm2,氯化鉀75 kg/hm2;2010年之后施用毛竹專用肥(福建中化生產(chǎn))750 kg/hm2和尿素450 kg/hm2。

1.2 樣品采集與處理

于2013年9月,選擇由同一農(nóng)戶經(jīng)營(yíng)、并位于同一山上,施肥管理措施一致,不同時(shí)間開始集約經(jīng)營(yíng)(主要是施肥和翻耕)以及位于同一山上相鄰未施肥的粗放經(jīng)營(yíng)毛竹林地,經(jīng)營(yíng)時(shí)間分別為:粗放經(jīng)營(yíng)(未施肥對(duì)照)、2003年、1998年、1993年和1988年,相當(dāng)于集約時(shí)間分別為0 a(記為CK)、10 a、15 a、20 a、25 a,4個(gè)時(shí)間梯度(處理)。每個(gè)年份毛竹林分別選取3個(gè)20 m×20 m樣地(即為3個(gè)重復(fù)),每個(gè)樣地采用 5 點(diǎn)取樣法采集表層(0—20 cm)和亞表層(20—40 cm)土壤充分混勻過篩(2 mm)裝入采樣袋。樣品分為2份,1份放到-70 ℃冰箱,經(jīng)冷凍干燥后,供分子生物學(xué)研究;另1份于室內(nèi)自然風(fēng)干后,研磨過篩用于基本理化性質(zhì)分析。

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

1.4 土壤固碳微生物分析

1.4.1 土壤固碳功能菌cbbL基因熒光定量PCR

采用PowerSoilTMTotal DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤總DNA,稱取0.5 g凍干土樣品,按照說明書進(jìn)行DNA提取。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取DNA的效果進(jìn)行鑒定,并用微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。提取后的DNA分裝并保存于-40℃。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantutative PCR,qPCR)測(cè)定固碳功能菌cbbL基因拷貝數(shù),上游引物:K2f[11]5′-ACCA[C/T] CAAGCC[G/C] AAGCT[C/G] GG- 3′,下游引物V2r : 5′-GCCTTC[C/G] AGCTTGCC[C/G] ACC[G/A] C- 3′,得到492 bp—495 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物[24]。使用CFX 96TMReal-Time System(Bio-Rad, USA)儀器對(duì)cbbL基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,每個(gè)樣品重復(fù)3次。體系組成如下: 2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL,50 μmol/L上游和下游引物各0.2 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 補(bǔ)水至 20 μL。反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[24]:95℃預(yù)變性 3 min,40個(gè)循環(huán)包括95℃ 10s,62℃ 40 s,72℃ 30 s。熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后,與pEASY-T3載體連接并轉(zhuǎn)接入大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞,在含Ampicillin平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆,挑選部分陽(yáng)性克隆子送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的已知陽(yáng)性克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA,用微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度(OD260/OD280)。重組質(zhì)粒梯度稀釋后8倍作為cbbL基因的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)樣品,標(biāo)準(zhǔn)樣品的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上[24]。溶解曲線為單一峰型,說明條件符合要求,引物特異性良好。表層和亞表層土壤擴(kuò)增效率為96.6%和93.9%,標(biāo)線R2均大于0.995。

1.4.2 固碳功能菌cbbL基因末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析(T-RFLP)

采用T-RFLP技術(shù)分析固碳功能菌群落,引物K2f和V2r[10]。上游引物5′端用FAM熒光標(biāo)記,反應(yīng)體系包括Premix 10 μL、10 μmol /L的上游和下游引物各0.2 μL、Bovine Serum Albumin(BSA,20 mg/mL)0.2 μL、DNA模板0.3 μL、ddH2O 補(bǔ)水至50 μL,反應(yīng)程序[26]:95℃ 預(yù)變性3 min,95℃變性1 min,62℃退火1 min,72℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán),72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,用限制性內(nèi)切酶MspI在37℃下消化4 h,酶切產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司利用毛細(xì)管電泳檢測(cè)自動(dòng)測(cè)序分析。將圖譜中±1 bp T-RFs視為一個(gè)OTU,當(dāng)T-RFs的相對(duì)豐度>1%時(shí)可納入后續(xù)分析;相對(duì)豐度>10%被視為優(yōu)勢(shì)種群[24]。

1.4.3 固碳功能菌cbbL基因克隆文庫(kù)

構(gòu)建固碳功能細(xì)菌cbbL基因克隆文庫(kù)來確定固碳自養(yǎng)微生物的種類。擴(kuò)增PCR,引物及反應(yīng)程序同熒光定量PCR。PCR產(chǎn)物純化后連接到pEASY-T3載體連接并轉(zhuǎn)接入大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞,在氨芐青霉素平板進(jìn)行藍(lán)白斑挑選,驗(yàn)陽(yáng)挑選200個(gè)陽(yáng)性克隆子送至生工生物工程有限公司(上海)測(cè)序。利用DOTUR軟件將相似性大于97%的序列視為同一操作分類單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)[25]。分別以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中cbbL基因BLAST結(jié)果相似性大于90%的序列為參比序列[25],利用Clustal X進(jìn)行多重比對(duì),采用MEGA 5.0 中的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所獲得的cbbL基因序列提交至NCBI,序列登錄號(hào)為MF430937-MF431023。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,OriginPro 8軟件作圖,SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)T-RFLP圖譜中OTU的數(shù)目及其豐度通過BIO-DAP程序(http://nhsbig.inhs.uiuc.edu/wes/population.html)計(jì)算樣品的多樣性指數(shù)。采用Canoco 4.5軟件(Mocrocomputer Power,Ithaca,USA)對(duì)T-RFLP結(jié)果進(jìn)行冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果分析

2.1 毛竹林集約經(jīng)營(yíng)過程中土壤理化性質(zhì)變化

表1 不同集約經(jīng)營(yíng)年限毛竹林土壤理化性質(zhì)

CK: 空白對(duì)照,Control check; 10 a: 集約經(jīng)營(yíng)10年;15 a: 集約經(jīng)營(yíng)10年;20 a: 集約經(jīng)營(yíng)20年;25 a: 集約經(jīng)營(yíng)25年;平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3);同列數(shù)值后不同小寫字母代表同一土層不同經(jīng)營(yíng)年限的顯著性差異(P<0. 05);除全氮和C∶N比數(shù)據(jù)外,其他指標(biāo)與何冬華等[7]相同

2.2 毛竹林集約經(jīng)營(yíng)過程中土壤cbbL基因數(shù)量變化及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系

圖1 不同集約經(jīng)營(yíng)年限毛竹林土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度 Fig.1 Abundance of cbbL gene under long-term intensive managed Phyllostachys pubescens stand大寫字母代表0—20 cm土層不同經(jīng)營(yíng)年限的顯著性差異(P<0.05);小寫字母代表20—40 cm土層不同經(jīng)營(yíng)年限的顯著性差異(P<0.05)

2.3 毛竹林集約經(jīng)營(yíng)過程中土壤固碳細(xì)菌結(jié)構(gòu)及物種變化

圖2 不同集約經(jīng)營(yíng)年限毛竹林土壤固碳細(xì)菌cbbL基因T-RFs相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of cbbL T-RFs under long-term intensive managed Phyllostachys pubescens forests T-RFs: 限制性多態(tài)片段,Terminal restriction fragments

擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)MspI酶切處理后,得到40—488 bp之間的T-RFs19條。如圖所示(圖2)其中177 bp是所有表層和亞表層土壤的優(yōu)勢(shì)片段(20.70%—45.52%)。第二優(yōu)勢(shì)片段40 bp(7.96%—17.79%),隨著集約經(jīng)營(yíng)時(shí)間延長(zhǎng)其相對(duì)豐度提高,分別在表層和亞表層15 a達(dá)到最大值(17.79%和16.57%),在隨后的經(jīng)營(yíng)年限中又逐漸下降。213 bp與40 bp具有相同的變化規(guī)律,但并未成為優(yōu)勢(shì)片段。360 bp與40 bp及213 bp規(guī)律相反,表層和亞表層15 a豐度最低(3.06%和11.77%),它是亞表層的第三優(yōu)勢(shì)片段。以上描述的片段出現(xiàn)在所有土壤處理(年限)中,集約經(jīng)營(yíng)措施只改變其豐度;而有些片段只出現(xiàn)在某1個(gè)或幾個(gè)集約經(jīng)營(yíng)年限土壤中,如表層中的49 bp、127 bp、129 bp和亞表層中的362 bp在CK中出現(xiàn),隨著集約經(jīng)營(yíng)的進(jìn)行消失,在隨后的經(jīng)營(yíng)年限土壤中又出現(xiàn);相反表層中的219 bp、364 bp和488 bp與亞表層42 bp、219 bp并未在CK中出現(xiàn),在毛竹林開始集約經(jīng)營(yíng)后逐漸出現(xiàn);488 bp是表層特有片段,但并非優(yōu)勢(shì)片段。說明施肥翻耕對(duì)這些片段代表的微生物產(chǎn)生影響。

圖3 基于部分cbbL序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partial cbbL sequences

本研究挑選200個(gè)陽(yáng)性克隆子測(cè)序,基于97%的相似性被分成64個(gè)OTU。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示(圖 3),序列共形成3個(gè)未知 Cluster 簇(56%),余下的序列與變形菌門(Proteobacteria)的α-Proteobacteria(11%)和γ-Proteobacteria(6%)以及Actinobacteria(28%)相似度較高。T-RFLP圖譜結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),第一優(yōu)勢(shì)T-RF片段177 bp與慢生根瘤菌Bradyrhizobiumottawaense(LT629693.1) 、慢生根瘤菌Bradyrhizobiumicense(CP016428.1)、沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonaspalustris(CP000283.1)、Starkeyanovella(CP002026.1)、高溫單孢菌Thermomonosporacurvata(CP001738.1)和Dokdonellakoreensis(CP015249.1)親緣關(guān)系較近,分布在3個(gè)未知 Cluster 簇、α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria簇和Actinobacteria簇上,與來自草地[10]、森林[25]和水稻土[12]的基因序列相似度高。362 bp和36 bp與Thermomonospoacurvata(CP001738.1)親緣關(guān)系較近,分布在Actinobacteria簇上,與來自旱地[26]和草地[10]的基因序列相似度高。175 bp分布在Cluster Ⅲ簇上,同樣與來自旱地[26]和草地[10]的基因序列相似度高。第二優(yōu)勢(shì)片段40 bp本研究中雖未克隆到該片段,但已有學(xué)者[27]利用與本研究相同的MspI酶研究固碳細(xì)菌時(shí)發(fā)現(xiàn),(40±1) bp與Bradyrhizobiumottaweanse(LT629693.1)的親緣相似度達(dá)76%。

2.4 毛竹集約經(jīng)營(yíng)過程中cbbL基因多樣性變化

表2 不同經(jīng)營(yíng)歷史毛竹林土壤固碳微生物多樣性指數(shù)

同列數(shù)值后不同小寫字母代表不同經(jīng)營(yíng)年限的顯著性差異(P<0. 05)

表3 土壤理化因子與cbbL基因多樣性指數(shù)相關(guān)性分析

*代表相關(guān)性達(dá)到顯著水平P<0.05;**代表相關(guān)性達(dá)到極顯著水平P<0.01

2.5 環(huán)境因子對(duì)土壤固碳微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

以T-RFLP 片段信息和土壤化學(xué)性質(zhì)為兩組變量進(jìn)行冗余分析(RDA)(圖4)。從二維排序軸上可知,表層土壤中CK與集約經(jīng)營(yíng)10 a、15 a、20 a、25 a樣地在第一排序軸上顯著分開,CK主要分布在第一排序軸正軸上,10 a、15 a、20 a、25 a處理主要分布在第一排序軸負(fù)軸上。亞表層土壤中CK與10 a、15 a、20 a樣地固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為接近,在第一排序軸上與25 a分開,CK與10 a、15 a、20 a主要分布在第一排序軸負(fù)軸上,25 a主要分布在第一排序軸正軸上。以上結(jié)果說明集約經(jīng)營(yíng)措施對(duì)表層和亞表層土壤固碳細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)均有顯著影響。

圖4 毛竹林土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of CO2 fixating bacterial community in soils of Phyllostachy spubescens stand

3 討論

以施肥和翻耕為主的集約經(jīng)營(yíng)顯著影響了毛竹林土壤三大菌群細(xì)菌、真菌和放線菌[5-6]以及某些功能菌群如固氮菌[7]和氨氧化菌[8]群落結(jié)構(gòu)的變化。本研究假設(shè),集約經(jīng)營(yíng)可能同樣對(duì)固碳微生物產(chǎn)生影響。T-RFLP 圖譜分析表明,毛竹集約經(jīng)營(yíng)后某些片段從無到有(表層中的219 bp和364 bp與亞表層42 bp、219 bp),某些片段從有到無、再出現(xiàn)(表層中的49 bp、127 bp、129 bp和亞表層中的175 bp、362 bp),說明毛竹林進(jìn)行集約經(jīng)營(yíng)顯著影響固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。第一和第二優(yōu)勢(shì)片段177 bp和40 bp的相對(duì)豐度增加,毛竹林集約經(jīng)營(yíng)后表層土壤177 bp在亞表層土壤變化不明顯、片段40 bp表現(xiàn)出增加趨勢(shì)。從系統(tǒng)發(fā)育可知,優(yōu)勢(shì)片段多為兼性自養(yǎng)細(xì)菌,與Tolli等[11]報(bào)道的松林和旱地的兼性自養(yǎng)細(xì)菌大于專性自養(yǎng)細(xì)菌的結(jié)論相類似。袁紅朝等[28]在研究施肥對(duì)固碳功能菌群落結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期施肥使硫桿菌,亞硝化螺菌(嚴(yán)格自養(yǎng)菌)等種群優(yōu)勢(shì)明顯降低,而產(chǎn)堿桿菌(兼性自養(yǎng)菌)優(yōu)勢(shì)度上升。固碳自養(yǎng)細(xì)菌按能量來源可分為光能型和化能型,Wu 等[29]的研究顯示光照主要影響表層1 cm左右的碳同化自養(yǎng)微生物。而兼性自養(yǎng)細(xì)菌則能夠利用除有機(jī)化合物外更廣的能量,如銨鹽、亞硝酸、硫、硫化氫等無化合物,在光源不足的土層中保證其正常的生長(zhǎng)代謝,因此其成為優(yōu)勢(shì)種群。

4 結(jié)論

本研究表明,長(zhǎng)期集約經(jīng)營(yíng)顯著提高了毛竹林表層和亞表層土壤的養(yǎng)分含量、降低土壤pH 值。集約經(jīng)營(yíng)毛竹林土壤固碳微生物數(shù)量并未表現(xiàn)出與SOC的相關(guān)性,而與N素水平的變化顯著相關(guān)。具體表現(xiàn)為:隨著集約經(jīng)營(yíng)的進(jìn)行表層土壤cbbL基因豐度呈先上升后下降的規(guī)律,與氮素水平呈正相關(guān);亞表層土壤cbbL基因豐度則呈直線下降趨勢(shì),與C∶N比呈正相關(guān)。集約經(jīng)營(yíng)導(dǎo)致表層和亞表層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變、表層固碳細(xì)菌多樣性指數(shù)下降。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,不可培養(yǎng)固碳細(xì)菌占56%比例,土壤中具有共同的優(yōu)勢(shì)種類多為變形菌和放線菌,以兼性自養(yǎng)為主。RDA分析結(jié)果表明土壤酸化和養(yǎng)分積累是毛竹林土壤固碳細(xì)菌群落和多樣性變化的重要原因。