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    腌魚過程中組胺及產(chǎn)組胺菌研究

    2018-12-19 10:55:22陳踴南葉日英陳俏純陳慧珍羅敏敏陳欣
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年12期
    關(guān)鍵詞:腌魚組氨酸組胺

    陳踴南,葉日英,陳俏純,陳慧珍,羅敏敏,陳欣

    (廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東 湛江 524088)

    腌魚由于具有獨(dú)特的風(fēng)味而倍受人們青睞,且加工方法簡單、成本低廉,在魚類加工業(yè)中占有較大比重,是遠(yuǎn)洋捕撈及個體較小的魚多采用的加工方式。魚在腌制過程中,部分蛋白質(zhì)被分解為游離氨基酸,細(xì)菌使其產(chǎn)生脫羧反應(yīng)生成生物胺。組胺是組氨酸脫羧基反應(yīng)生成的無色無味、不揮發(fā)的有機(jī)胺,具有毒性,食用組胺含量較高的腌魚會使人出現(xiàn)急性中毒癥狀或引起慢性病變,曾出現(xiàn)多起由人食用腌魚而產(chǎn)生的組胺中毒事故。國際糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)于2012年7月23—27日在羅馬召開專家會議,討論魚和魚產(chǎn)品中組胺和其他生物胺引發(fā)的公共健康風(fēng)險(xiǎn)問題,確定組胺的無明顯損害作用水平值(NOAEL)為50 mg。由于金線魚腌制品較多,本研究選用金線魚作為原料進(jìn)行腌制試驗(yàn),在不同的時間點(diǎn)取樣檢測組胺含量。細(xì)菌是形成組胺的重要因素,因此在成品腌魚中分離出產(chǎn)組胺細(xì)菌,并對其進(jìn)行產(chǎn)組胺能力檢測和菌屬鑒定,以便今后采取有效措施抑制產(chǎn)組胺細(xì)菌的生長,控制腌制魚的組胺含量。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    冰鮮金線魚和食鹽均購于湛江市超市。

    磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、D-組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、L-組氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)均購于南京奧多福尼生物科技有限公司;其余試劑購于北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

    TD5臺式多管架低速離心機(jī),長沙英泰儀器有限公司;G1314F紫外檢測器,杭州瑞析科技有限公司;TC-24/H(b)型基因擴(kuò)增儀,杭州博日科技有限公司;DYY-6C型電泳儀,北京市六一儀器廠;VITEK2Compact微生物全自動分析儀,法國梅里埃公司。

    1.2 樣品制備

    用濾紙吸干金線魚外表的水,稱重,加入30%的食鹽,按層魚層鹽的方法將魚腌制于不銹鋼盆中, 室溫腌制3 d后置于太陽下晾曬,在第1、2、3、4、5、7、10 d取樣檢測。

    1.3 組胺含量檢測

    參考《GB 5009.208—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》方法,用組胺磷酸鹽標(biāo)品配制標(biāo)準(zhǔn)使用液,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取5 g腌魚于50 mL離心管中,加入TCA水溶液(100 g·L-1)15 mL,均質(zhì)1 min, 50 ℃超聲波處理30 min,3 000 r·min-1離心10 min后取上清液,水洗沉淀物2次過濾。合并濾液,吸取2 mL濾液置于分液漏斗,加入2~3滴NaOH 溶液(250 g·L-1)使濾液呈堿后,加入3 mL正戊醇,震蕩5 min,分別添加正戊醇3次,靜置15 min提取上層清液,定容至10 mL。準(zhǔn)確吸取2 mL正戊醇萃取液于分液漏斗,添加3 mL鹽酸,震蕩5 min,連續(xù)添加3次鹽酸溶液并震蕩后靜置15 min,收集下層的鹽酸萃取液并定容至10 mL,搖勻后以零管為參比,用紫外檢測器檢測萃取液的吸光度,代入組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出萃取液的組胺含量并計(jì)算腌魚的組胺含量。

    1.4 產(chǎn)組胺細(xì)菌分離

    根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)組胺使培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)的原理,利用溴甲酚紫培養(yǎng)基的呈色反應(yīng)方法進(jìn)行篩選[1]。由于樣品含有多種氨基酸,細(xì)菌利用各類氨基酸產(chǎn)生的生物胺都會使培養(yǎng)基堿性增強(qiáng),必須排除組胺外的其他生物胺的干擾,試驗(yàn)中采用二步篩選法進(jìn)行產(chǎn)組胺細(xì)菌分離。

    第一步分離產(chǎn)生物胺的細(xì)菌:取25 g腌魚成品進(jìn)行碎處理,加入225 mL無菌水,并進(jìn)行梯度稀釋。對最后3個稀釋度分別用移液槍移取1 mL稀釋液于滅菌平皿,倒入下層培養(yǎng)基(蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、酵母膏1 g、葡萄糖0.1 g、瓊脂3.6 g、吐溫80 0.2 g、磷酸吡哆醛0.01 g、NaCl 0.5 g、MgSO40.08 g、K2HPO40.4 g、D-組氨酸10 g,L-組氨酸1 g、蒸餾水200 mL)10 mL左右輕輕混勻,凝固后于30 ℃培養(yǎng)24~48 h,觀察菌落狀態(tài)并計(jì)算菌落總數(shù),然后在表面注入5 mL上層培養(yǎng)基(1.6%溴甲酚紫-乙醇1 mL、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)覆蓋全部菌落,靜置5~10 min后觀察菌落顏色變化,變紫色或紫藍(lán)色的菌落則為形成生物胺的菌株,不變色或呈其他色澤的菌落則不形成生物胺。第二步篩選產(chǎn)組胺的細(xì)菌:用接種環(huán)小心挑取產(chǎn)生物胺的菌落接種于D、L-組氨酸瓊脂培養(yǎng)基(D-組氨酸10 g,L-組氨酸10 g,NaCl 5 g、磷酸吡哆醛0.01 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L, 調(diào)pH 6.0)平板,于30 ℃培養(yǎng)24~48 h至菌落長出充分長成,然后注入上層培養(yǎng)基5 mL左右覆蓋菌落,5~10 min變紫或紫藍(lán)色的菌落則為產(chǎn)組胺細(xì)菌。

    1.5 細(xì)菌產(chǎn)組胺能力檢測

    將分離細(xì)菌接種于產(chǎn)組胺能力檢測培養(yǎng)基(D/L-組氨酸10 g,大豆蛋白胨17 g,葡萄糖2.5 g,丙酮酸鈉10 g,NaCl 3 g,磷酸氫二鉀2.5 g,蒸餾水1 L,調(diào)pH 6.0),置于30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后按1.3所述的方法檢測組胺含量,產(chǎn)組胺含量高的菌株則為產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌。

    1.6 產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定及生化鑒定

    將產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,并觀察細(xì)菌菌落特征,同時用全自動細(xì)菌鑒定儀作生化反應(yīng)鑒定。

    1.7 產(chǎn)組胺細(xì)菌的基因序列鑒定

    采用16S rDNA序列鑒定法。參考文獻(xiàn)方法[2],將產(chǎn)組胺細(xì)菌制成菌懸液,用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司廣州分公司完成,將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌序列進(jìn)行比對和分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 金線魚腌制過程組胺含量

    將組胺標(biāo)準(zhǔn)液于波長480 nm處檢測吸光值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用Origin8.5對組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性分析,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式為y=0.006x+1.821 8,R2=0.999 4。

    組胺含量及細(xì)菌總數(shù)結(jié)果如圖1所示,組胺含量與細(xì)菌總數(shù)的變化規(guī)律相似,在腌制第3天出現(xiàn)峰值,第4天開始下降,第7天之后降低至相對穩(wěn)定狀態(tài)。這可能是由于原料魚從冷藏條件到室溫條件的變化促使魚體內(nèi)細(xì)菌快速生長繁殖的緣故。隨著腌制時間的延長,食鹽的滲透作用使魚體的鹽濃度逐漸增大,水分逐漸流失減少,由此導(dǎo)致部分細(xì)菌受到抑制,導(dǎo)致第7~10天細(xì)菌總數(shù)降至最少。蔣倩倩等[3-4]認(rèn)為,腌魚的組胺含量在腌制前期上升,而在腌制后期下降,是由于其他微生物與產(chǎn)組胺細(xì)菌存在競爭和拮抗作用,從而使產(chǎn)組胺細(xì)菌生長受到抑制,或者部分組胺被降解的緣故。

    圖1 腌制魚過程中組胺含量及細(xì)菌總數(shù)變化

    2.2 細(xì)菌產(chǎn)組胺能力及關(guān)鍵細(xì)菌

    篩選細(xì)菌得到7株產(chǎn)組胺菌, 產(chǎn)組胺能力如圖2所示,其中菌株T4和T6的產(chǎn)組胺量明顯大于其余5株細(xì)菌,由此確定T4和T6是產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌。

    圖2 7株細(xì)菌培養(yǎng)48 h產(chǎn)組胺量

    2.3 產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征與生化特性

    細(xì)菌自動分析儀分析結(jié)果顯示,T4與馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)最接近, 相似度為96%,T6與蜂房芽孢桿菌(Paenibacillusalvei)最接近,相似度為98%。鏡檢結(jié)果顯示,T4細(xì)胞為圓形,革蘭氏陽性,無芽孢,無運(yùn)動;菌落較小,圓形,邊緣整齊,米白色,表面光滑,不透明。T6細(xì)胞為桿狀, 革蘭氏陽性,有芽孢,會運(yùn)動;菌落較小,圓形,邊緣有缺刻,乳白色,表面粗糙無光澤,不透明。形態(tài)學(xué)檢測及生化檢測的結(jié)果顯示,T4、T6分別與蜂房芽孢桿菌和馬胃葡萄球菌和蜂房芽孢桿菌高度相似(表1)。

    表1 2株產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌部分生化特征

    注:-為陰性,+為陽性。

    2.4 關(guān)鍵細(xì)菌的基因序列鑒定結(jié)果

    將T4和T6的基因序列提交至NCBI, 提交號為2444712, 將所得基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫的已知細(xì)菌序列進(jìn)行比對,結(jié)果T4與馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、T6與蜂房芽孢桿菌(Paenibacillusalvei)相似度均達(dá)到100%。根據(jù)16S rDNA序列檢測結(jié)果構(gòu)建T4和T6的基因發(fā)育樹如圖3、4所示。

    圖3 T4菌株基于16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 討論

    在腌制金線魚過程中,組胺含量呈現(xiàn)近似正態(tài)分布的變化規(guī)律。腌制初始階段,組胺含量呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,腌制第3天左右達(dá)到峰值,第4 天出現(xiàn)下降,直至第7~10天組胺含量降低至相對穩(wěn)定水平。分離細(xì)菌的結(jié)果顯示,細(xì)菌總數(shù)的變化也與組胺變化規(guī)律相似,其中產(chǎn)組胺細(xì)菌有7株,產(chǎn)組胺能力相參較強(qiáng)的細(xì)菌是馬胃葡萄球菌和蜂房芽孢桿菌。

    楊健[5]在鮐魚產(chǎn)組胺微生物生物學(xué)特性研究中表明,低溫可以抑制產(chǎn)組胺細(xì)菌的生長并能抑制其產(chǎn)生組胺,與本研究結(jié)果一致。吳素娟等[6]人認(rèn)為,隨著干制時間的推移,魚肉水分含量和水分活度不斷降低,到腌制后期,水分活度限制了產(chǎn)組胺細(xì)菌的生長,導(dǎo)致組胺含量逐漸降低,這與本實(shí)驗(yàn)在第4~10天的干制階段發(fā)現(xiàn)組胺含量下降的結(jié)果類似。另外,曾令彬等[7]發(fā)現(xiàn),腌魚中主要的微生物群是微球菌、葡萄球菌、乳酸菌和酵母菌等,部分微生物除了產(chǎn)組胺外,還會產(chǎn)生其他生物胺或其他呈味物質(zhì)[8],由此產(chǎn)生腌魚理化性質(zhì)和質(zhì)構(gòu)的變化。陳玉峰等[9]建議在生產(chǎn)過程中采用低溫干燥的辦法抑制脫羧酶活性和產(chǎn)組胺細(xì)菌的生長,從而有效控制腌制魚中組胺的生成?;谶@些研究報(bào)道,結(jié)合本研究結(jié)果,為了健康和安全地食用腌制魚,盡量選擇鹽漬后干制至第7天之后的腌魚進(jìn)行食用,或者采取特定的技術(shù)方法抑制產(chǎn)組胺關(guān)鍵細(xì)菌,降低腌制魚中組胺的生成量。

    圖4 T6菌株基于16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

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