圓斑星鰈sox9基因的克隆與表達(dá)*

張樂樂 邊 力 常 青 侯吉倫 陳四清 趙 慶 劉 琨 葛建龍 劉長(zhǎng)琳

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圓斑星鰈9基因的克隆與表達(dá)*

張樂樂1,2邊 力2常 青2侯吉倫3陳四清2①趙 慶1,2劉 琨1,2葛建龍2劉長(zhǎng)琳2

(1. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海海洋大學(xué) 上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站 秦皇島 066100)

本研究篩選到圓斑星鰈()的性別相關(guān)基因9，并通過RACE技術(shù)獲得了全長(zhǎng)序列，基因全長(zhǎng)為3287 bp，包括1431 bp的ORF，編碼477個(gè)氨基酸，368 bp的5￠UTR和1488 bp的3￠UTR。在3￠UTR中有多聚腺苷酸尾和加尾信號(hào)AATAAA。通過熒光定量PCR測(cè)定了9基因在圓斑星鰈成魚不同組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)9基因在圓斑星鰈的腦、眼、鰓、心、肝、膽、腸、精巢、卵巢、腎和肌肉等各個(gè)組織中都有不同程度的表達(dá)。在鰓、腦和精巢組織中檢測(cè)到較高水平的9轉(zhuǎn)錄，其中精巢中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他組織，9基因在性腺中的表達(dá)顯示出性別兩相性差異。其在精巢中的表達(dá)水平要顯著高于卵巢，說明9基因與雄性性腺發(fā)育相關(guān)。通過測(cè)定9基因在圓斑星鰈幼魚不同發(fā)育時(shí)期(20、30、40、50、60、70和80日齡)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在20~50日齡表達(dá)量逐漸下降，在60日齡時(shí)表達(dá)量上升，推測(cè)表達(dá)量上升可能與幼魚性腺分化相關(guān)。

圓斑星鰈；9；性別基因；mRNA表達(dá)

基因(SRY-related HMG-box)是與哺乳動(dòng)物睪丸決定基因(Sex determination Region of Y chromosome)的保守區(qū)HMG基序有60%以上同源性的一類基因的統(tǒng)稱，而9(Sex determining region Y-box 9)是基因家族中重要的一員(Foster, 1994)。東天等(2015)研究表明，9基因是目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)脊椎動(dòng)物睪丸發(fā)育的主要基因之一，被認(rèn)為與性逆轉(zhuǎn)、性別分化胚胎期的細(xì)胞分化以及精原細(xì)胞的形成有關(guān)。哺乳類9下調(diào)4 (Wingless-type MMTV integration site family, member 4)的表達(dá)，性腺將發(fā)育成睪丸(侯林等, 2007)；9參與激活(Anti-mullerian hormone)，可以使哺乳動(dòng)物性腺向精巢方向發(fā)育(文愛韻等, 2011)。目前，在尼羅羅非魚(、青鳉()、高身麗脂鯉()、西伯利亞鱘魚()和牙漢魚()等多種魚類中獲得了9基因(Kobayashi, 2008; Nakamura, 2012; Fernandino, 2003; Adolfi, 2015; Berbejillo, 2013)。證實(shí)了9基因在魚類性別分化和性腺發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。李永婧等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，9的突變會(huì)導(dǎo)致雌性個(gè)體出現(xiàn)雄性表型，這可能與生殖細(xì)胞數(shù)目的減少相關(guān)，表明在硬骨魚類中9基因可能具有新的功能，即在生殖細(xì)胞系維持和存活方面發(fā)揮了重要作用。

圓斑星鰈()是一種具有廣闊養(yǎng)殖前景的新興養(yǎng)殖對(duì)象，雌性在生長(zhǎng)速度與體型上明顯比雄性大，5~8 cm的圓斑星鰈經(jīng)養(yǎng)殖4年，雌、雄魚的體重分別達(dá)4.3 kg和1.2 kg(葉建生等, 2006)。通過進(jìn)行性別控制，培育單一雌性苗種，可以有效提高其養(yǎng)殖效益。性別決定機(jī)制與性別分化特征的研究對(duì)實(shí)現(xiàn)單性化繁殖十分重要。迄今圓斑星鰈性別相關(guān)基因的研究還未見報(bào)道。作者克隆了圓斑星鰈9基因的全長(zhǎng)序列，并分析其在圓斑星鰈成魚不同組織及在幼魚不同發(fā)育階段的表達(dá)差異，為圓斑星鰈的性別決定及性腺發(fā)育機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 成魚各組織樣品的制備 圓斑星鰈成魚取自蓬萊天源水產(chǎn)有限公司，解剖魚體，觀察其性腺，確定性別，然后取成體雄魚和雌魚各3尾，體長(zhǎng)為(23.5±0.5) cm、體重為(340±20) g，取其組織(全腦、眼、鰓、心、肝、膽、腸、精巢、卵巢、腎和肌肉)，置于有RNA later試劑的離心管中，液氮速凍后，將樣品保存于?80℃超低溫冰箱，待用。

1.1.2 仔魚各發(fā)育時(shí)期樣品的制備 不同發(fā)育時(shí)期的仔魚取自于山東省威海市乳山市的山東科合海洋高技術(shù)有限公司。選取20、30、40、50、60、70和80日齡仔魚，其全長(zhǎng)分別為(10.5±0.7)、(13.5±0.6)、(19.6±1.8)、(29.6±2.4)、(36.2±2.5)、(45.1±2.3)和(57.7± 2.8) cm，每個(gè)日齡取10尾魚，去頭去尾保留腹部，處理后裝入凍存管中，液氮速凍，于?80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

本研究采用Trizol法提取成魚不同組織以及仔魚各發(fā)育時(shí)期性腺組織的RNA。用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。用DEPC處理水將RNA稀釋成濃度為1 μg/μl的溶液，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)，以稀釋后的RNA為模板，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：在冰上，向0.2 ml的PCR管中依次加入5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl，gDNA Eraser 1.0 μl，Total RNA 1 ng，RNase Free dH2O補(bǔ)至10 μl；42℃水浴2 min，置于冰上；再加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μl，RT Primer Mix 1.0 μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，RNase Free dH2O 4.0 μl；然后，37℃水浴15 min，85℃水浴5 s，置于冰上。產(chǎn)物cDNA轉(zhuǎn)移至?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 sox9基因核心片段的克隆

基于本課題組前期獲得的圓斑星鰈轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Ge, 2017)，使用軟件Oligo7設(shè)計(jì)特性引物9-S1和9-A1(表1)，以成魚性腺組織的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增9核心序列。

PCR反應(yīng)體系(50 μl)：在0.2 ml PCR管中依次加入2×TSINGKE Master Mix 25 μl，9-S1(10 μmol/L) 1 μl，9-A1(10 μmol/L) 1 μl，cDNA 1 μl，加雙蒸水補(bǔ)至50 μl；PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，7℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物保存于?20℃。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

Tab.1 Primers used in this study

1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物中的目的條帶。UV2下切膠，使用SanPrep柱式DNA凝膠回收試劑盒(生工)和PMDTM18-T載體(TaKaRa)對(duì)目的DNA片段進(jìn)行回收、連接和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。具體步驟參考試劑盒使用說明書。菌液PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。

菌液PCR反應(yīng)體系(10 μl)如下，在0.2 ml PCR管中依次加入2×TSINGKE Master Mix 5 μl，M13-S1 (10 μmol/L) 0.4 μl，M13-A1 (10 μmol/L) 0.4 μl，菌液2 μl，加雙蒸水補(bǔ)至10 μl。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物保存于?20℃。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶(原目的條帶加150~200 bp為陽(yáng)性克隆)。有目的條帶的菌液送測(cè)。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，確定序列為9基因的核心序列。

1.4 sox9基因5￠ UTR和3￠ UTR的擴(kuò)增

使用SMARTTMRACE cDNA Amplification RACE (TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以性腺組織RNA為模板制備5￠和3￠cDNA的第一條鏈。根據(jù)前面所得的核心序列設(shè)計(jì)特異性引物3￠GSP-1和3￠GSP-2擴(kuò)增9基因的3￠UTR。設(shè)計(jì)特異性引物5￠GSP-1和5￠GSP-2擴(kuò)增9基因的5￠UTR(表2)。5￠UTR和3￠UTR擴(kuò)增都采用巢式PCR方法，共2輪PCR反應(yīng)，第一輪以5￠和3￠cDNA的第一條鏈為模板及外側(cè)特異引物GSP-1進(jìn)行擴(kuò)增，第二輪以第一輪PCR產(chǎn)物為模板及內(nèi)側(cè)特異引物GSP-2進(jìn)行擴(kuò)增。

反應(yīng)體系25 μl：10×Buffer 2.5 μl，dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 μl，UPM 2.5 μl，5￠或3￠特異引物0.5 μl，5￠或3￠RACE模板1.25 μl，DNA聚合酶0.5 μl，ddH2O補(bǔ)足至25 μl。PCR反應(yīng)條件為94℃，30 s；68℃， 30 s；72℃，2 min。

將PCR所得的5'和3'端產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，UV2下切膠回收DNA片段，并連接轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定為9基因的片段。

1.5 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

使用軟件Gene Tool對(duì)9基因進(jìn)行序列分析，使用軟件DNAMAN對(duì)其進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)分析，使用軟件MEGA 5進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)9基因的核心序列，運(yùn)用軟件Oligo7設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，以圓斑星鰈成魚不同組織和幼魚不同發(fā)育階段性腺組織的cDNA為模板，熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定9基因在圓斑星鰈不同組織中和幼魚不同發(fā)育階段的表達(dá)水平。特異性引物要進(jìn)行引物試擴(kuò)增，檢測(cè)其條帶的特異性及擴(kuò)增效率，找出最佳的特異引物。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出最佳引物9-S2和9-A2(表1)，目的基因9與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率都接近100%，擴(kuò)增效率一致，采用2-DDCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μl)為2×SYBR Premix ExTMⅡ(TaKaRa) 10μl, cDNA模板2 μl，正反向引物各0.8 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，ddH2O補(bǔ)齊至20 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 30 s (1個(gè)循環(huán))；94℃ 5 s，60℃ 34 s ( 40個(gè)循環(huán))；95℃ 15s (1個(gè)循環(huán))；60℃ 1 min (1個(gè)循環(huán))；95℃ 15 s (1個(gè)循環(huán))。每一實(shí)驗(yàn)樣品重復(fù)擴(kuò)增3次，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行One-way ANOVA差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對(duì)9基因核心片段的克隆以及對(duì)其5￠UTR和3￠UTR的擴(kuò)增，得到了9基因的全長(zhǎng)序列?；蛉L(zhǎng)為3287 bp，經(jīng)軟件預(yù)測(cè)9基因包括1431 bp的ORF，可編碼477個(gè)氨基酸，368 bp的5￠UTR和1488 bp的3￠UTR(圖1)。在3￠UTR中有多聚腺苷酸尾和加尾信號(hào)AATAAA。

如圖2所示，將圓斑星鰈Sox9蛋白序列與其他物種的Sox9蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)所用的物種包括：人(，CAA86598.1)、原雞(，AAB09663.1)、鼠(，NP_035578.3)、非洲爪蟾(，NP_001084276.1)、紅鰭東方鲀(，Sox9a：AAQ18507.1，Sox9b：AAQ18508.1)、大菱鲆(，ART89197.1)、牙鲆(，ACO40490.1)、赤點(diǎn)石斑魚(，AAT77677.1)和青鳉(，Sox9a：NP_001098556.1，Sox9b：AAX62151.1)。比對(duì)結(jié)果顯示，包括圓斑星鰈在內(nèi)的魚類Sox9蛋白均含有高度保守的HMG結(jié)構(gòu)域。9基因編碼的477個(gè)氨基酸，其中103~173 aa為HMG結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)已發(fā)表的各個(gè)物種的Sox9蛋白序列，采用MEGA軟件的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)，自舉次數(shù)(bootstrap)1000次，構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。進(jìn)化樹構(gòu)建所用的Sox9蛋白的其他物種包括： 人(，CAA86598.1)、原雞(，AAB09663.1)、鼠(，NP_035578.3)、沼澤鱷(，ACU12296.1)、紅鰭東方鲀(，Sox9a：AAQ18507.1，Sox9b：AAQ18508.1)、大菱鲆(，ART89197.1)、牙鲆(，ACO40490.1)、斑馬魚(，Sox9a：AAG09814.1，Sox9b：AAG09815.1)、赤點(diǎn)石斑魚 (，AAT77677.1)和青鳉(，Sox9a：NP_001098556.1，Sox9b：AAX62151.1)。從圖3可以看出，哺乳類(如人)、鳥類(如原雞)和爬行類(如沼澤鱷)的Sox9聚在了一起，圓斑星鰈Sox9與牙鲆、青鳉等其他硬骨魚類的Sox9聚在了一起。

圖1 圓斑星鰈sox9基因核苷酸序列

大寫字母：編碼區(qū)；小寫字母：非編碼區(qū)

Uppercase letters: Coding regions; Lowercase letters: Untranslated regions (UTR)

圖2 魚類Sox9蛋白序列比對(duì)分析

人(, CAA86598.1)、原雞(, AAB09663.1)、鼠(, NP_035578.3)、非洲爪蟾(, NP_001084276.1)、紅鰭東方鲀(, Sox9a: AAQ18507.1, Sox9b: AAQ18508.1)、大菱鲆(, ART89197.1)、牙鲆(, ACO40490.1 )、赤點(diǎn)石斑魚(, AAT77677.1)和青鳉(, Sox9a: NP_001098556.1, Sox9b: AAX62151.1)

圖3 多個(gè)物種Sox9蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

人(, CAA86598.1)；原雞(, AAB09663.1)；鼠(, NP_035578.3)； 沼澤鱷(, ACU12296.1)；紅鰭東方鲀(, Sox9a: AAQ18507.1, Sox9b: AAQ18508.1)； 大菱鲆(, ART89197.1)；牙鲆(, ACO40490.1)；斑馬魚(, Sox9a: AAG09814.1, Sox9b: AAG09815.1)；赤點(diǎn)石斑魚(, AAT77677.1)；青鳉(, Sox9a: NP_001098556.1, Sox9b: AAX62151.1)

2.2 sox9基因在成體各組織中的表達(dá)分析

熒光定量PCR測(cè)定圓斑星鰈9基因在成體各組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，圓斑星鰈9 mRNA普遍存在于成體各組織中(腦、眼、鰓、心、肝、腸、膽、精巢、卵巢、腎和肌肉)(圖4)。比較雌雄個(gè)體相同組織的表達(dá)水平，可以發(fā)現(xiàn)9基因在鰓和性腺組織中的表達(dá)顯示出性別兩相性差異(<0.05)，雄魚的表達(dá)水平要顯著高于雌魚；比較不同組織的表達(dá)水平，可以發(fā)現(xiàn)9基因在雌魚鰓、腦和腸組織中表達(dá)水平較高，在卵巢、肌肉、心和腎臟組織中表達(dá)水平較低，在雄魚鰓、腦和精巢組織中表達(dá)水平較高，在肌肉、心和腎臟中表達(dá)水平較低。

2.3 sox9基因在仔魚發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

熒光定量PCR測(cè)定圓斑星鰈9 mRNA在仔魚各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，9基因在仔魚20~50日齡表達(dá)量逐漸下降，在60日齡表達(dá)量上升，在70日齡之后表達(dá)量下降(圖5)。

3 討論

本研究克隆了圓斑星鰈9基因，并通過RACE技術(shù)得到了9基因的全長(zhǎng)。9 mRNA全長(zhǎng)為3287 bp，編碼477個(gè)氨基酸。將其蛋白序列與其他物種Sox9蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其103~173 aa為高度保守的HMG結(jié)構(gòu)域。利用已知物種的Sox9蛋白序列構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)圓斑星鰈Sox9與牙鲆等硬骨魚類的Sox9聚在一起，說明9基因在魚類中是比較保守的。而且其與牙鲆Sox9在同一分支，則說明二者親緣關(guān)系最近。同時(shí)，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹可發(fā)現(xiàn)，在人、鼠和原雞等較高等的脊椎動(dòng)物中只出現(xiàn)一種9基因，而在斑馬魚、青鳉和紅鰭東方鲀等魚類中出現(xiàn)2種類型的9基因，即9a和9b。斑馬魚的Sox9a和原雞在同一分枝上，而斑馬魚Sox9b卻在另一分支，這說明斑馬魚Sox9a與鳥類等較高等脊椎動(dòng)物Sox9親緣關(guān)系較近，功能也會(huì)更相似，這一點(diǎn)與Rodríguez-Marí等(2005)的研究發(fā)現(xiàn)相吻合。Rodríguez-Marí等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚9a基因在精巢組織的Sertoli細(xì)胞中表達(dá)，而9b基因則在卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，圓斑星鰈也存在2種類型的9基因，但只成功克隆出1種類型的9基因，因9亞型的劃分沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，暫時(shí)將其命名為9基因。

圖4 sox9基因在圓斑星鰈成魚不同組織中表達(dá)的定量分析

1：腦；2：眼；3：鰓；4：心；5：肝；6：腸；7：膽；8：性腺；9：腎；10：肌肉 a、b、c、d表示組間具有顯著性差異(<0.05)，ce、cd、de含相同字母表示組間差異不顯著

1: Brain; 2: Eye; 3: Gill; 4: Heart; 5: Liver; 6: Intestine; 7: Gallbladder; 8: Gonad; 9: Kidney; 10: Muscle a, b, c, and d indicated the expression levels are significantly different among tissues (<0.05), ce, cd and de which have one identical letter indicated the expression levels are not significantly different among tissues

圖5 sox9基因在仔魚發(fā)育時(shí)期表達(dá)的定量分析

通過熒光定量PCR分析圓斑星鰈9基因在成體各組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在圓斑星鰈成魚的各組織中都有不同程度的表達(dá)，這與牙鲆和許氏平鲉()9基因的研究結(jié)果一致(文愛韻等, 2011; 馬麗曼, 2014)。9在精巢中的表達(dá)量要顯著高于卵巢，顯示出性別兩相性差異，與裸蓋魚()、點(diǎn)帶石斑魚()、尼羅羅非魚和斜帶石斑魚()9基因的表達(dá)情況一致(Smith, 2013; Luo, 2010; Kobayashi, 2008; Xia, 2007)，說明9基因與雄性性別相關(guān)，推測(cè)9基因可能參與了圓斑星鰈精巢發(fā)育過程。9基因除在精巢中表達(dá)最高，在鰓和腦組織中也有較高表達(dá)，說明9在其他組織的發(fā)育過程中也發(fā)揮了作用。如Dong等(2011)發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨()9a基因在雄性的腦、垂體和性腺中的表達(dá)都顯著高于雌性，且9月齡的半滑舌鰨精巢中的表達(dá)量達(dá)到峰值，在原腸胚期的表達(dá)量高于其他時(shí)期，說明9a基因?qū)Π牖圉嵉哪X-垂體-性腺軸及精原細(xì)胞的形成起重要作用。青鳉9b基因的突變會(huì)導(dǎo)致雌性個(gè)體出現(xiàn)雄性表型，可能與生殖細(xì)胞數(shù)目的減少相關(guān)，表明在硬骨魚類中可能具有新的功能，在生殖細(xì)胞系維持和存活方面發(fā)揮了重要作用(李永婧等, 2017)。此外，在斑馬魚、黃鱔()和黃顙魚()等魚類中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)9基因(Rodríguez-Marí, 2005; Zhou, 2003; 俞菊華等, 2005)。Rodríguez-Marí等(2015)在斑馬魚中篩選到9a和9b兩個(gè)9基因。9a在精巢和腦等多個(gè)組織中表達(dá)，在卵巢中不表達(dá)；9b僅在卵巢中表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)。而Zhou等(2003)在黃鱔中發(fā)現(xiàn)9a1和9a兩個(gè)基因，其在精巢、卵巢和間性性腺(精卵巢)中都表達(dá)。這說明9基因的2個(gè)分型的功能是不同的。Volff等(2005)指出，在硬骨魚類中存在2種類型的9基因，也許是由魚類特有的基因組復(fù)制導(dǎo)致的。

熒光定量PCR測(cè)定了圓斑星鰈9基因在仔魚各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，9基因在仔魚20~50日齡表達(dá)量逐漸下降，而在60日齡時(shí)表達(dá)量上升，這與許氏平鲉9基因在其仔魚不同發(fā)育階段的表達(dá)模式相同，即在孵化后5 d和10 d表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，15 d和25 d的表達(dá)量逐漸上升，許氏平鲉在孵化后約25~35 d性腺開始分化，因此，許氏平鲉9基因在25日齡表達(dá)量達(dá)到較高的水平可能與性腺的分化有關(guān)(馬麗曼等, 2014)。圓斑星鰈性腺分化的研究未見報(bào)道，而條斑星鰈()在60~70日齡性腺開始分化(李忠紅, 2009)，這與圓斑星鰈9基因表達(dá)量上升的時(shí)間接近，因此，推測(cè)表達(dá)量上升可能與幼魚性腺分化有關(guān)。

Adolfi MC, Carreira AC, Jesus LW,. Molecular cloning and expression analysis of dmrt1 and sox9 during gonad development and male reproductive cycle in the lambari fish,. Reproductive Biology and Endocrinology, 2015, 13: 2

Berbejillo J, Martinez-Bengochea A, Bedó G,. Expression ofandduring gonadal development in the Siberian sturgeon (). Fish Physiology and Biochemistry, 2013, 39(1): 91?94

Dong T, Liu FJ, Hu HX,. Research progress on sex differentiation related genes on sturgeon. Biotechnology Bulletin, 2015, 31(10): 62?70 [東天, 劉鳳嬌, 胡紅霞, 等. 鱘魚性別分化相關(guān)基因研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31(10): 62?70]

Dong XL, Chen SL, JI XS,. Molecular cloning, charactcrization and expression analysis ofandgenes in half-smooth tongue sole (). Acta Oceanologica Sinica, 2011, 30(1): 68?77

Fernandino JL, Guilgur LG, Strobl-Mazzulla PH,. Molecular cloning of SOX9, DMRT1 and SF1 cDNA partial sequences in the pejerrey fish(Atheriniformes). Fish Physiology and Biochemistry, 2003, 28(1?4): 145?146

Foster JW, Dominguez-Steglich MA, Guioli S,. Campomelic dysplasia and autosomal sex reversal caused by mutations in an SRY-related gene. Nature, 1994, 372(6506): 525?530

Ge J, Chen S, Liu C,. Characterization of the global transcriptome and microsatellite marker information for spotted halibut. Genes and Genomics, 2017, 39(3): 307?316

Hou L, Cui YX, Yao B. Progress in sexual determination related SOX9. Chinese Journal of Birth Health and Heredity, 2007, 15(8): 1?2, 9 [侯林, 崔英霞, 姚兵. 性別決定相關(guān)基因SOX9研究進(jìn)展. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志, 2007, 15(8): 1?2, 9]

Kobayashi T, Kajirua- Kobayashi H, Guan G,. Sexual dimorphic expression ofandduring gonadal differentiation and hormone-induced sex reversal in the teleost fish Nile tilapia (). Developmental Dynamics, 2008, 237(1): 297?306

Li YJ，Wu LM, Li XJ. A review on the genes related with sex determination and differentiation in teleosts. Journal of Henan Normal University (Natural Science Edition), 2017, 45(4): 72?78 [李永婧, 吳利敏, 李學(xué)軍. 硬骨魚類性別決定與分化相關(guān)基因研究進(jìn)展. 河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 45(4): 72?78]

Li ZH. Gynogenesis induced and histological observation on gonadal sex differentiation in barfin flounder ().Master’s Thesis of Northeast Agricultural University, 2009, 28?34 [李忠紅. 條斑星鰈雌核發(fā)育誘導(dǎo)及性別分化過程的初步研究. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2009, 28?34]

Luo YS, Hu W, Liu XC,. Molecular cloning and mRNA expression pattern ofduring sex reversal in orange-spotted grouper (). Aquaculture, 2010, 306(1–4): 322?328

Ma LM. Study on sex related genes,andin black rockfish,. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2014, 79?91 [馬麗曼. 許氏平鲉性別相關(guān)基因、和的研究. 中國(guó)海洋大學(xué)博士研究生學(xué)位論文, 2014, 79?91]

Nakamura S, Watakabe I，Nishimura T,. Analysis of medakaorthologue reveals a conserved role in germ cell maintenance. PLoS One, 2012, 7(1): e29982

Rodríguez-Marí A, Yan YL, BreMiller RA,. Characterization and expression pattern of zebrafish() relative to,, and, during gonad development. Gene Expression Patterns, 2005, 5: 655?667

Smith EK，Guzmán JM，Luckenbach JA. Molecular cloning, characterization, and sexually dimorphic expression of five major sex differentiation-related genes in a Scorpaeniform fish, sablefish (). Comparative Biochemistry and PhysiologyPart B: Biochemistry and Molecular Biology, 2013, 165(2): 125?137

Volff JN. Genome evolution and biodiversity in teleost fish. Heredity, 2005, 94(3): 280–294

Wen AY，You F，Sun P，. Study on cloning and expression of gene sox9 in olive flounder (). Advances in Marine Science, 2011, 29(1): 97?104 [文愛韻, 尤鋒, 孫鵬, 等. 牙鲆9基因的克隆與表達(dá)研究. 海洋科學(xué)進(jìn)展, 2011, 29(1): 97?104]

Xia W, Zhou L, Yao B,. Differential and spermatogenic cell-specific expression ofduring sex reversal in protogynous hermaphroditic groupers. Molecular and Cellular Endocrinology, 2007, 263(1?2): 156?172

Ye JS, Wang XQ, Ma S,. Studies on biological and advances of. Fisheries Economy Research, 2006(6): 5?7 [葉建生, 王興強(qiáng), 馬甡, 等. 圓斑星鰈的生物學(xué)特性及其研究進(jìn)展. 漁業(yè)經(jīng)濟(jì)研究, 2006(6): 5?7]

Yu JH, Li JL, Cao LP,. Isolation and analysis ofderived from yellow catfish (). Journal of Agricultural Biotechnology, 2005, 13(5): 620? 623[俞菊華, 李建林, 曹麗萍, 等. 黃顙魚基因的分離及分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2005, 13(5): 620?623]

Zhou R, Liu L, Guo Y,. Similar gene structure of twogenes and their expression patterns during gonadal differentiation in a teleost fish, rice field eel (). Molecular Reproduction and Development, 2003, 66(3): 211?217

Cloning and Expression of the9 Gene in Spotted Halibut ()

ZHANG Lele1,2, BIAN Li2, CHANG Qing2, HOU Jilun3, CHEN Siqing2①, ZHAO Qing1,2, LIU Kun1,2, GE Jianlong2, LIU Changlin2

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Beidaihe Central Experiment Station, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qinhuangdao 066100)

Significant differences exist in the growth rate and body size of male and female spotted halibut (), with the females being significantly larger than the males. All-female cultivation can improve breeding efficiency. Studies investigating the mechanism of sex determination and features of sex differentiation may provide valuable information for all-female cultivation. In this study, we successfully identified the9 gene of spotted halibut. The total length is 3287 bp, including a 1431 bp ORF, encoding 477 amino acids; the 5￠UTR is 368 bp and the 3￠UTR is 1488 bp. Polyadenylic acid tails and AATAAA caudal signals were identified in the 3￠UTR. The expression of the9 gene differed in the brain, eye, gills, heart, liver, gallbladder, intestine, testis, ovary, kidney, and muscle in spotted halibut. Transcript levels were high in the gill, brain, and testis, and were significantly higher in the testis than in the other tissues. A two-phase gender difference was observed in the gonads;9 expression was significantly higher in the testis than in the ovary, indicating that9 might be associated with male gonad development. The dynamic expression patterns of the9 gene in spotted halibut larvae gradually declined from 20 to 50 d after hatching, with a sudden rise observed after 60 d. This increased expression might be associated with differentiation of larval gonad.

;9; Sex genes; mRNA expression

CHEN Siqing, E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

張樂樂, 邊力, 常青, 侯吉倫, 陳四清, 趙慶, 劉琨, 葛建龍, 劉長(zhǎng)琳. 圓斑星鰈9基因的克隆與表達(dá). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(6): 72–80

Zhang LL, Bian L, Chang Q, Hou JL, Chen SQ, Zhao Q, Liu K, Ge JL, Liu CL. Cloning and expression of the9 gene in spotted halibut (). Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(6): 72–80

* 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022016005)和天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目(201604100)共同資助[This work was supported by Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (20603022016005), and Agriculture Science and Technology Achievement Transformation and Generalization Project in Tianjin (201604100)]. 張樂樂，E-mail: 2459823080@qq.com

陳四清，研究員，E-mail: chensq@ysfri.ac.cn

2017-10-10,

2017-10-30

10.19663/j.issn2095-9869.20171010001

S917.4

A

2095-9869(2018)06-0072-09

(編輯 馬璀艷)