小鼠大腦中動脈近端及遠端阻塞腦缺模型比較

孔德蓮　管樟萌　祖潔　秦敬翠?馬海玲?陸燕?何清

【摘要】目的 建立兩種穩(wěn)定的小鼠大腦中動脈近端和遠端閉塞的腦缺血模型，比較兩種方法在腦梗死體積/行為學等方面的差異。方法 48只C57BL/6J雄性小鼠隨機分為線栓組（傳統(tǒng)的MCAO模型制作，n=18），大腦中動脈遠端永久性閉塞組（p-MCAO，電凝左側大腦中動脈遠端及其兩側分支，n=18），對照組（未予任何手術處理，n=12）。模型制作后進行行為學檢測并計算腦梗死體積，比較各組間差異。

結果 線栓組腦梗死體積較p-MCAO組腦梗死體積明顯增大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；行為學方面，線栓組小鼠上提肢體搖擺試驗評分明顯低于P-MCAO組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而圓柱筒試驗評分明顯高于p-MCAO，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果 相對于線栓法小鼠模型，p-MCAO模型易制作，成功率高，梗死體積較小、以皮質區(qū)損傷為主，對運動功能的影響較線栓法腦缺模型小，相對于腦大小的梗死體積與大多數(shù)人類中風相似，更接近人類腦卒中，存活時間長，適合涉及為期較長的行為學測驗的

實驗。

【關鍵詞】腦缺血；模型；腦梗死體積；行為學

【中圖分類號】R743 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.25..03

人類的缺血性腦卒中是一種具有復雜的病理生理學機制的異質性疾病，所以想要在一個動物模型中模仿人類腦卒中的各個方面是不可行的。目前大部分卒中人群的梗死區(qū)主要在大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）供血區(qū)內，所以大部分卒中模型選擇阻斷MCA或者它的一個分支。傳統(tǒng)的MCAO模型是利用線栓阻塞大腦中動脈近端制作的腦缺血模型，簡稱線栓MCAO。但該方法對術者技術要求高，模型制作難度較大，腦損傷體積大，動物不易長期存活，不利于對腦缺血的長期研究。大腦中動脈永久性閉塞（p-MCAO）模型采取電凝阻斷小鼠一側大腦中動脈血流方法實現(xiàn)同側相應供血區(qū)皮層發(fā)生缺血性損傷，即所謂的“凝血模型”，該模型尚未像線栓法MCAO模型那樣在各實驗室普及。本研究通過比較p-MCAO模型與傳統(tǒng)的MCAO模型在模型制作成功率、模型制作成功后的死亡率、腦梗死體積、神經(jīng)行為學等方面的差異，探討兩種MCAO模型的優(yōu)劣性和應用范圍。

1 實驗大鼠分組及模型制作

野生型C57BL/6J小鼠購自美國Jackson實驗室，飼養(yǎng)并繁殖于徐州醫(yī)科大學神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究所，飼養(yǎng)條件保持室溫22～25℃，予以12 h光照，12 h黑暗。采用隨機數(shù)表方法將48只雄性（8-12周，SPF級）野生型小鼠隨機分為3組：①P-MCAO組（n=18）；②線栓組（n=18）；③對照組（n=12）。

2 遠端大腦中動脈永久性閉塞模型（Permanent

MCAO Model，P-MCAO）制作過程

見圖1[1]。具體步驟為：（1）小鼠用小動物吸入麻醉系統(tǒng)，異氟烷麻醉（2）小鼠右側臥位于手術臺上，應用脫毛劑（8%硫化鈉）將左側眼部至耳部的毛發(fā)脫凈，解剖顯微鏡下在消毒后的區(qū)域切開1 cm的切口。（3）分離皮膚并定位顳肌，掀開肌肉。（4）在透明的顱骨下找到“Y”型大腦中動脈分支的近端及遠端動脈分叉。（5）用骨鉆在血管分叉處打磨顱骨直至顱骨變得薄薄的一層，用精細鑷小心地將動脈上方的顱骨掀開。正確分辨出MCA的分支，分別距離分叉處1 mm電凝三支動脈血管。（6）縫合傷口。

2.1 線栓組傳統(tǒng)的MCAO模型制作[3，4]

手術分離頸總動脈、頸外動脈，微動脈夾暫時關閉頸總動脈，由頸外動脈注入栓子后將頸外動脈結扎，開放頸總動脈，使栓子自頸內動脈進入MCA而建立MCAO模型。

2.2 對照組

正常飼養(yǎng)，未予任何手術處理。

2.3 小鼠腦缺血模型制作成功標準

按照參考文獻[5]評定，在造模后18 h進行神經(jīng)功能缺損程度的評價：0級=無缺陷； l級=對側前肢不能伸展；

2級=對側前肢屈曲； 3級=輕度向對側轉圈；4級=嚴重的轉圈；5級=對側癱瘓。

2.4 TTC染色測定腦梗死體積[6]

分別取各組術后（或者假手術后）24小時的小鼠，取腦，制作冰凍切片，將切片置于TTC染液中，用錫箔紙蓋住后（避光），放入37℃保溫箱中15～30 min。將數(shù)碼相機固定于腦片垂直上方30 cm處拍照。正常腦組織中線粒體內的琥珀酸脫氫酶與TTC反應呈鮮紅色，梗死區(qū)由于缺少線粒體而不著色。拍照后利用Image Pro Plus 6.0軟件分別測出梗死側非梗死區(qū)的面積和對側半球的面積。兩者之差即為腦梗死面積，再除以對側半球面積，即為相對腦梗死面積比，依次得出5個相對腦梗死面積比，乘以2 mm即為相對腦梗死體積比[8]。

2.5 大鼠神經(jīng)行為學檢測比較

模型建立后，進行兩項行為學檢測比較，包括上提肢體搖擺實驗（elevated body swing test，EBST）[7]和圓柱筒實驗[8，9]。行為學檢測采用雙盲法。術前24小時對小鼠進行行為學訓練，只有行為學表現(xiàn)符合要求的才可入組并繼續(xù)后續(xù)實驗。術后24 h再次進行行為學測驗。

2.5.1 EBST

主要用于評價小鼠的肢體翻轉功能及前肢運動對稱性。術后24小時，觀察者提起小鼠尾巴根部，距離地面約10 cm，記錄小鼠向左右搖擺的次數(shù)，搖擺角度需>10度，<10度則不計入總數(shù)，20次為限。該方法主要用來觀察小鼠肢體運動的對稱性。計算小鼠左右搖擺的比例并加以統(tǒng)計。

2.5.2 圓柱筒試驗

正式實驗前3天內對動物進行一次行為學訓練，訓練時情緒過于緊張/躍出筒內者，或者10 min內貼壁次數(shù)小于5次者，不參與后續(xù)實驗。分別在術前1天、術后1天用攝像機記錄，每次記錄10分鐘，每只小鼠每個時間點記錄2次，2次的時間間隔至少為30分鐘。應用視頻軟件慢放的功能，分別計數(shù)每只小鼠每個時間點左前肢觸壁（L），右前肢觸壁（R）及雙側前肢同時觸壁（D）次數(shù)，最終取每一小鼠同一時間點的兩次計數(shù)的均值帶入公式計算：行為學得分/score=（R+D/2）/（R+L=D）×100%。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，分別進行t檢驗、方差分析及相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 腦卒中小鼠24 h存活率、腦梗死體積統(tǒng)計結果

（1）建模后24 h內，P-MCAO組死亡1只，余17只繼續(xù)進行行為學觀察。線栓法組死亡5只，余13只繼續(xù)行為學觀察。線栓組死亡率>p-MCAO組。對照組未出現(xiàn)死亡。（2）TTC染后，p-MCAO組和線栓組，均清晰可見腦梗死區(qū)域（白色區(qū)域為梗死區(qū)域） ，但梗死區(qū)域在線栓組明顯大于p-MCAO組（圖2）。兩組腦梗死體積比較較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。表1，圖2。

3.2 腦卒中行為學觀測統(tǒng)計結果

①EBST實驗：p-MCAO組、線栓組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；p-MCAO組與線栓組比較，無顯著差異（表2）。

②玻璃圓筒貼壁實驗：p-MCAO組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；線栓組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；p-MCAO組與線栓組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

4 討 論

腦缺血是以腦循環(huán)血流量減少為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點，嚴重地影響人類的生存質量。目前我國腦血管疾病占人群死亡病因的第二位。因此，模擬人類缺血性腦血管病的發(fā)病過程，建立重復性好、觀測指標易于控制的腦缺血動物模型一直是人們普遍關注的課題。因此，在過去的幾十年中，本著研究腦缺血的機制以及尋找更有效的治療藥物，研究者們開發(fā)了許多腦缺血的動物模型。

腦缺血動物模型按部位分為局灶性腦缺血模型和全腦缺血模型；臨床上，缺血性腦血管病多為局灶性，以大腦中動脈（middle cerebral anery，MCA）及其分支閉塞（middle cerebral artery occlusion，MACO）多見，約占腦梗死的70%。因此，制作MCA缺血并且可實現(xiàn)再灌注的動物模型更接近臨床。MCA模型被公認為標準的局灶性腦缺血動物模型。其中，電凝法在1981年由Tamura等首先建立，并經(jīng)Bederson，Osborne、Shigeno等進一步改良，2014年由Llovera[10，11]等改良后建立了電凝經(jīng)顱永久性遠端大腦中動脈閉塞模型（P-MCAO），本模型的優(yōu)勢在于造模的死亡率低，重復性好。同時梗死區(qū)主要在皮層，梗死面積的大小與大部分卒中患者的梗死體積具有一致性[11]。線栓塞法是手術分離頸總動脈、頸外動脈，微動脈夾暫時關閉頸總動脈，由頸外動脈注入栓子后將頸外動脈結扎，開放頸總動脈，使栓子自頸內動脈進入MCA而建立MCAO模型。

本實驗通過TTC染色后對實驗性大鼠進行梗死面積分析，獲得直接測定結果數(shù)據(jù)，兩種不同造模方法所造成的腦梗死體積明顯不同。線栓法MCAO梗死區(qū)域主要局限于一側半球皮質區(qū)和紋狀體（圖2A），p-MCAO組梗死區(qū)域主要局限于一側皮質區(qū)（圖2B），且兩者之間梗死體積的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明MCA損傷段不同，產(chǎn)生的腦梗死體積也不同。線栓法腦缺血模型主要阻塞MCA起始段，同時影響CCA，ICA的部分灌注，所以產(chǎn)生的梗死區(qū)域較大，影響也比較廣泛。而p-MCAO法直接電凝MCA遠端，對CCA，ICA等無影響，所以梗死區(qū)域局限于MCA遠端供血區(qū)，對大鼠的神經(jīng)功能影響也較局限。

行為學研究在神經(jīng)病學神經(jīng)功能研究中占有舉足輕重的地位，本實驗中小鼠的兩種不同的缺血模型對神經(jīng)功能的影響是不同的，且不同的行為學實驗對神經(jīng)功能的評定的側重點也是不同的。通過EBST，圓柱筒試驗兩種行為學功能的檢測比較，表面在腦卒中幾星期p-MCAO會對小鼠造成一定的神經(jīng)功能的損傷，但不及線栓法腦缺血模型對小鼠造成的神經(jīng)功能缺損嚴重。

綜上，p-MCAO由于對MCA的損傷位于遠端，造成的腦梗死面積較小，腦梗死局限于大腦皮質前側面及少量皮質下腦組織，模型制作完成后小鼠存活時間較長，適合涉及為期較長的行為學測驗的實驗。許多研究，像對藥物的評價研究，干細胞治療后的長期療效研究等等，需要長期觀察才能得出結論，應用此模型較為合適。而線栓法腦缺血模型對動物損傷大，模型制作完成后小鼠存活時間較短，適宜短期的腦缺血后的行為學及生理/病理/機制等的研究。

參考文獻

[1] Jin K，Mao X，Xie L，et al.Transplantation of humanneural precursor cells in Matrigel scaffolding improves outcome from focal cerebral ischemia after delayed postischemic treatment in rats[J].J Cereb Blood Flow Metab，2010，30：534-544.

[2] Llovera G，Roth S，Plesnila N，et al.Modeling stroke in mice： permanent coagulation of the distal middle cerebral artery[J].J Vis Exp，2014，（89）：e51729.

[3] Zhao H，Mayhan WG，Sun H.A modifield suture technique produces consistent cerebral infarctionin rats[J].Brain Res，2008，1246：158-166.

[4] Guan Y，Wang Y，Yuan F，Effect of suture properties on stability of middle cerebral artery occlusion evaluated by synchrotron radiation angiography[J]. Stroke， 2012，43：888-891.

[5] Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M， et al. Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17：472-476.

[6] Li Z，Bishop N，Chan SL Cipolla MJ.Effect of TTC Treatment on Immunohistochemical Quantification of Collagen IV in Rat Brains after Stroke[J]. Transl Stroke Res.2018， doi： 10.1007/s12975-017-0604-9.

[7] Edvin I，Johanna Gudjinsdottir，et al. Elevated body swing test after focal cerebral ischemia in rodents：methodological considerations.BMC Neurosci （2015）16：50.

[8] Roome RB，Vanderluit JL.（2015）.Paw-dragging： a novel， sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp （98）：e52701.

[9] Rattka M，F(xiàn)luri F，Krstic M，Asan E，Volkmann J.（2016）.A Novel Approach to Assess Motor Outcome of Deep Brain Stimulation Effects in the Hemiparkinsonian Rat： Staircase and Cylinder Test.J Vis Exp 2016 May 31；111.

[10] Atif F，Yousuf S，Sayeed I，Ishrat T，Hua F，Stein DG. 2013）. Combination treatment with progesterone and vitamin D hormone is more effective than monotherapy in ischemic stroke： the role of BDNF/TrkB/Erk1/2 signaling in neuroprotection.Neuropharmacology. 67：78-87.

[11] Llovera G， Roth S，Plesnila N，Veltkamp R，Liesz A. （2014）.Modeling stroke in mice： permanent coagulation of the distal middle cerebral artery.J Vis Exp （89）：e51729.

本文編輯：趙小龍