入侵植物互花米草上的蚜蟲(chóng)新紀(jì)錄：一條蚜及其種群分化

李 強(qiáng),李俊潔,吳楊雪,張宜輝,黃曉磊?

(1.閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002；2.廈門(mén)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建廈門(mén)361102)

互花米草(Spartina alterniflora)起源于美洲大西洋海岸,為多年生草本植物,隸屬于禾本科Poaceae米草屬Spartina。互花米草莖稈粗壯,地下根系發(fā)達(dá),具有很強(qiáng)的生產(chǎn)力、繁殖力以及抗鹽堿等生物學(xué)特性。二十世紀(jì)七十年代,美國(guó)本土的互花米草被廣泛應(yīng)用于沿海地區(qū)固沙促淤、減浪護(hù)堤、重建灘涂鹽沼生態(tài)系統(tǒng)(Knutson et al.,1982；方民杰,2012；欽佩等,2012；楊東等,2014)。1979年,我國(guó)分別從美國(guó)北卡羅來(lái)納州、佐治亞州和佛羅里達(dá)州引進(jìn)了三種不同生態(tài)型的互花米草。雖然引種前期產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益,但由于互花米草的快速擴(kuò)張,嚴(yán)重危害了沿海地區(qū)鹽沼生態(tài)系統(tǒng),因此2003年被中國(guó)環(huán)境保護(hù)部列為入侵物種(王卿等,2006)。

目前已知僅少數(shù)蚜蟲(chóng)物種可寄生米草屬植物,包括：Anoecia corni取食S.cynosuroides,Sipha littoralis取食S.maritima及S.townsendii,Prociphilus erigeronensis取食S.patens(Blackman et al.,2018)。但互花米草上尚無(wú)蚜蟲(chóng)紀(jì)錄,不管是在其原產(chǎn)地美國(guó)(Gary Miller,USDA,personal communication),還是在其入侵地區(qū)。然而在近期調(diào)查中,我們于廈門(mén)大學(xué)翔安校區(qū)的互花米草培育溫室中發(fā)現(xiàn)大量取食該植物的蚜蟲(chóng),經(jīng)形態(tài)鑒定確定為一條蚜Hysteroneura setariae。

一條蚜隸屬于半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)蚜族(Aphidini),被認(rèn)為起源于北美洲,并在北美溫帶地區(qū)周期性孤雌生殖,一般在歐洲李(Prunus domestica)完成有性世代。1940年,北非地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了該蚜蟲(chóng)的存在。1976年,澳大利亞李屬植物P.persica上發(fā)現(xiàn)了一條蚜的性蚜和卵,但其是否在澳大利亞進(jìn)行全周期生活尚未可知(Carver,1976)。一條蚜在1960年代中后期經(jīng)歷了一個(gè)快速擴(kuò)散的過(guò)程,其無(wú)性生殖世代已經(jīng)廣泛的分布在世界范圍內(nèi)較為溫暖的地區(qū),包括印度、澳大利亞、南非、東南亞等地區(qū)(Blackman et al.,2018)。一條蚜主要取食禾本科植物,如水稻、甘蔗和玉米等,一般在穗的基部聚集為害,有時(shí)還會(huì)取食葉片以及未成熟的種子,造成谷物表面壞死斑點(diǎn)甚至空殼(Akibobetts et al.,1978；Noordam,2004)。Jahn等人(2005)曾報(bào)道在大豆(soybean)上發(fā)現(xiàn)一條蚜。另外在一些莎草科(Cyperaceae)以及油棕和椰子的幼苗上也偶見(jiàn)發(fā)生(Stoetzel et al.,2001；Blackman et al.,2018)。一條蚜還是重要的植物病毒攜帶者,比如南瓜花葉病毒(WMV)(Coudriet,1962)、甘蔗花葉病毒(SCMV)(Harborne,1988)以及大豆花葉病毒(SMV)(Quimio et al.,1993；Wijerathna et al.,1995)等,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。

本研究在對(duì)華南地區(qū)不同寄主植物上的一條蚜廣泛采樣的基礎(chǔ)上,基于DNA條形碼技術(shù)和分子系統(tǒng)發(fā)育分析,期望對(duì)互花米草上的一條蚜種群開(kāi)展進(jìn)一步的分子鑒定,并探究互花米草上一條蚜種群的來(lái)源。通過(guò)整合中國(guó)華南、印度、巴基斯坦、美國(guó)等地區(qū)一條蚜樣品的序列數(shù)據(jù),探討不同地區(qū)或寄主植物一條蚜種群的遺傳分化格局。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015-2018年,對(duì)中國(guó)華南地區(qū)(福建、廣東、云南、海南、廣西)進(jìn)行了廣泛的野外采樣,每號(hào)樣品保證為同一寄主同一生態(tài)位上的單克隆。采集到的樣品均放入裝有95%酒精的凍存管并置于-20℃環(huán)境中保存。共有62號(hào)一條蚜樣品用來(lái)進(jìn)行分子生物學(xué)試驗(yàn)以及系統(tǒng)發(fā)育分析,其中HL_20160302_Y1為采自互花米草上的樣品。詳細(xì)的樣品編號(hào)、GenBank登錄號(hào)、單倍型信息、寄主以及地理信息見(jiàn)表1,憑證標(biāo)本均放置于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院。

1.2 DNA提取、PCR和測(cè)序

本研究使用DNeasy Blood＆Tissue Kit(QIAGEN,GERMANY)試劑盒來(lái)提取單個(gè)蚜蟲(chóng)的基因組DNA。選用的分子標(biāo)記為線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶I亞基(cytochrome oxidase subunit I,COI),并由 COI的通用引物 LepF(5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG-3′) 和 LepR(5′-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3′)(Foottit et al.,2008)進(jìn)行目標(biāo)片段的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：20 μL ddH2O,3 μL 10×buffer,2.4 μL dNTP,0.6 μL 前后引物 (10 μmol·L-1),0.4 μL Taq DNA聚合酶 (5 U·μL-1)and 3 μL DNA模板。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s,50℃退火30 s,72℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán)；最后,72℃的終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),目的條帶清晰的樣品寄送到上海生工生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用BioEdit軟件(Hall,1999)對(duì)所獲得的序列進(jìn)行匯總,依據(jù)每號(hào)樣品的峰圖對(duì)其雙向序列進(jìn)行校正。另外從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了15條一條蚜的COI序列(表1)。將整合自測(cè)序列以及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的序列,進(jìn)行下一步的系統(tǒng)發(fā)育分析。用MAFFT(Katoh et al.,2013)對(duì)序列進(jìn)行對(duì)齊,并用BioEdit將序列切成相同的長(zhǎng)度。準(zhǔn)備好的序列文件使用MEGA 7.0(Kumar et al.,2016)基于Kimura 2-parameter(K2P)(Kimura,1980)模型計(jì)算遺傳距離并分析序列的堿基的組成以及位點(diǎn)的變異情況?；贏kaike Information Criterion(AIC)使用jModelTest 2.1.7(Darriba et al.,2012)計(jì)算最佳核苷酸替換模型。選擇同為蚜族的棉蚜Aphis gossypii和竹色蚜Melanaphis bambusae作為外群,使用MEGA 7.0、RaxML以及MrBayes 3.2.6等軟件,使用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)、最大似然法(Maximum likelihood,ML)和貝葉斯法(Bayesian inference,BI)分別對(duì)一條蚜的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。另外對(duì)獲得的COI序列進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,以探究一條蚜不同地理種群之間的種群遺傳結(jié)構(gòu)。首先將COI序列導(dǎo)入到DNAsp v5(Librado et al.,2009)來(lái)分析單倍型的組成,之后用NETWORK 5.0.0.3(Bandelt et al.,1999)來(lái)構(gòu)建Median-joining單倍型網(wǎng)絡(luò)。

表1 樣品的采集信息、單倍型及GenBank登錄號(hào)信息1)Table 1 Samples used in this study,with collection information,haplotype number and GenBank accession number

續(xù)表1Table 1(Continued)

續(xù)表1Table 1(Continued)

續(xù)表1Table 1(Continued)

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

本研究所獲得的62條序列最終統(tǒng)一截齊為560 bp,共包含554個(gè)保守位點(diǎn),6個(gè)可變位點(diǎn)以及3個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。序列核苷酸組成呈現(xiàn)很明顯的A+T偏向(T：40.2%,C：14.8%,A：35.7%,G：9.3%)。加上NCBI下載的15條一條蚜序列最終共77條序列,包含546個(gè)保守位點(diǎn),14個(gè)可變位點(diǎn)和4個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。序列核苷酸堿基T、C、A、G的占比分別為40.2%、14.8%、35.7%和9.3%,依然呈現(xiàn)非常明顯的A+T偏向。

2.2 遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

基于K2P模型計(jì)算的自測(cè)樣品序列的遺傳距離范圍為0%-0.7%,平均遺傳距離為0.2%；加上NCBI下載的一條蚜序列后,遺傳距離范圍0%-1.6%,平均遺傳距離0.7%。值得注意的是,序列間最大遺傳距離(1.6%)來(lái)自于美國(guó)的樣品(表2)。jModelTest軟件所計(jì)算的最佳核苷酸替換模型為GTR+I,基于此模型構(gòu)建的BI和ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以及基于K2P模型計(jì)算的NJ樹(shù)均顯示相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖1,附圖1、2)。中國(guó)、巴基斯坦以及印度的一條蚜樣品在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上很好的聚成一支,但是來(lái)自美國(guó)的兩號(hào)樣品(CNC?HEM028532和 CNC?HEM055851)很明顯的聚成了獨(dú)立于其他分支的兩個(gè)單獨(dú)分支,并且均具有很高的支持率以及后驗(yàn)概率。在廈門(mén)地區(qū)取食互花米草的一條蚜樣品與其他不同地區(qū)、不同寄主的一條蚜聚在同一分枝。

圖1 基于COI序列構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(BI)Figure 1 The BI phylogenetic tree based on COI

表2 一條蚜不同樣品組成的遺傳距離范圍以及平均遺傳距離Table 2 The genetic distances for different sequence sets of Hysteroneura setariae

2.3 單倍型與單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

本研究所涉及的77號(hào)樣品中,共包含9個(gè)COI單倍型(表1)。根據(jù)單倍型網(wǎng)絡(luò)分析可以看出(圖2),H_1包含了 77.9%的樣品(60號(hào)),覆蓋了 Guangdong、Yunnan、Fujian、Hainan、Guangxi、Pakistan、India等地。相較于其他單倍型,H_6和H_7呈現(xiàn)了較大的分化,這兩條序列分別代表美國(guó)的兩號(hào)樣品。

圖2 基于COI序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Haplotype networks based on COI sequences

3 討論

由一條蚜的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以及單倍型組成可以看出,采自廈門(mén)溫室中互花米草上的一條蚜與同域分布但取食其他寄主植物(馬唐屬、屬以及芒屬等)的很多一條蚜樣本具有同一單倍型,并位于系統(tǒng)樹(shù)的同一分支?？紤]到廈門(mén)大學(xué)翔安校區(qū)溫室中的互花米草均為采自各地的種子種植而來(lái),不存在一條蚜隨植株遠(yuǎn)距離擴(kuò)散的可能,因此取食互花米草的一條蚜應(yīng)該由周邊其他寄主種群擴(kuò)散而來(lái)。

在DNA條形碼研究中,判別為不同物種的遺傳距離閾值在不同類(lèi)群中有所差別。Weigand等人(2013)在關(guān)于Carychiidae的研究中表明,3.2%可以用來(lái)區(qū)分不同的物種。在鱗翅目中,2%常用區(qū)分不同的物種(Hajibabaei et al.,2006)。在蚜蟲(chóng)相關(guān)研究中,2%也被用來(lái)作為區(qū)分種內(nèi)與種間關(guān)系閾值(Foottit et al.,2008；Liu et al.,2013；Zhu et al.,2017)。在本研究中,自測(cè)樣品覆蓋了中國(guó)華南地區(qū),其樣品之間最大遺傳距離僅0.7%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于種間距的閾值。自測(cè)樣品與從GenBank下載的巴基斯坦和印度的序列之間遺傳距離也為0.7%,表明中國(guó)華南及東南亞地區(qū)分布的一條蚜遺傳分化不大。一條蚜原產(chǎn)地北美洲的序列與其他樣品間遺傳距離非常顯著,最大達(dá)到1.6%,暗示一條蚜從原產(chǎn)地北美向世界其他地區(qū)擴(kuò)散后,在不同的地理區(qū)域已形成一定的遺傳分化。然而,北美種群與亞洲種群明顯的遺傳分化主要由地理因素還是寄主植物因素所導(dǎo)致,尚需要基于更多樣品的深入分析。

目前防控互花米草的主要方法有物理清除、化學(xué)農(nóng)藥和生物防治等方法(Hedge et al.,2003)。物理防治主要通過(guò)手工拔除、遮陰、刈割等(李艷麗等,2009),有研究表明,圍堤浸泡互花米草使其缺氧而亡也是一種相對(duì)有效的防治方法(Aberle,1990),使用物理的方法雖然暫時(shí)有效,但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力高成本。而且互花米草的根系比較發(fā)達(dá),使用物理的方法常常達(dá)不到根除的效果(李賀鵬等,2007)?；瘜W(xué)防治主要是通過(guò)施用一些除草劑(草甘膦、咪唑煙酸以及米草敗育靈),施用除草劑會(huì)對(duì)其周邊生態(tài)系統(tǒng)造成非常大的傷害,并且受季節(jié)和天氣的影響(Norman et al.,1994)。關(guān)于對(duì)互花米草的生物防治學(xué)術(shù)界持保守態(tài)度。主要是由于互花米草的天敵作用比較復(fù)雜,因?yàn)橛行┨鞌巢粌H作用于互花米草,有時(shí)還會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物造成危害,更有甚者會(huì)導(dǎo)致新的生物入侵。一些有益的探索,例如大豐王港用蘆葦替代互花米草的生態(tài)工程(張茜等,2007),以及利用真菌(麥角菌Claviceps purpurea)和植食性昆蟲(chóng)(飛虱Prokelisia marginata以及蝗蟲(chóng)Melanoplus sp.等的寄生或取食,暗示生物防控或可作為有效控制互花米草擴(kuò)散的方法(Johnson et al.,2008；Grevstad et al.,2012)。本研究首次發(fā)現(xiàn)一條蚜取食互花米草的紀(jì)錄,將為后期研究互花米草的生物防控提供有效參考。

圖1 基于COI序列構(gòu)建的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(ML)
Figure 1 The ML phylogenetic tree based on COI

圖2 基于COI序列構(gòu)建的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(NJ)
Figure 2 The NJ phylogenetic tree based on COI