β受體拮抗劑對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)作用

洪澄英，陳懷生，曹靜，杜玉洛，劉雪燕，李威

（暨南大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)院，深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518020）

膿毒癥是嚴(yán)重感染所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征［1］，病情發(fā)展常可引起多臟器功能衰竭，病死率達(dá)20%～30%［2］。研究顯示約60%膿毒癥患者出現(xiàn)心功能不全［3-4］，而合并心功能不全患者病死率高［5］。目前研究［6］認(rèn)為，心肌線粒體功能損傷是膿毒癥患者心功能不全的主要原因之一，修復(fù)心肌線粒體功能可能對(duì)膿毒癥心功能不全有一定緩解作用。有研究［7］表明β受體拮抗劑有助于改善膿毒癥所致的心肌損害。評(píng)估β受體拮抗劑治療膿毒癥患者的療效和安全性的研究表明β受體拮抗劑不增加死亡風(fēng)險(xiǎn)［8］，并有可能有益于患者的預(yù)后［9］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［10］也表明β受體拮抗劑可以抑制膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡、改善血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本研究探討β受體拮抗劑對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1.1 大鼠模型建立和分組

SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量250～350 g，購(gòu)自國(guó)家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)種子中心上海分中心暨上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前 20～25 ℃和60%濕度條件下12 h光照/12 h黑暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。然后按照簡(jiǎn)單隨機(jī)數(shù)字法分為4組，每組5只，分別為對(duì)照組、模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組。對(duì)照組大鼠不做處理。其余3組參考文獻(xiàn)［11］采用小劑量?jī)?nèi)毒素持續(xù)注射誘導(dǎo)建立膿毒癥模型：根據(jù)大鼠體質(zhì)量準(zhǔn)備內(nèi)毒素（ 10 mg/kg） ，加生理鹽水溶解為10 mL，經(jīng)大鼠尾部靜脈注射［0.42 mL/（ kg·h） ］并持續(xù)24 h。建模成功后美托洛爾組經(jīng)尾注射美托洛爾0.05 mg（ 沖擊量） ，然后持續(xù)注射美托洛爾［0.2 mg/（ kg·h） ］［12］；艾司洛爾組經(jīng)尾注射艾司洛爾［15 mg/（ kg·h） ］［13］；模型組注射等量的生理鹽水。各組均持續(xù)治療48 h。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

（1） 模型成功驗(yàn)證：記錄各組大鼠精神狀態(tài)、生活習(xí)慣、體溫，眼眶靜脈取血檢測(cè)白細(xì)胞 （white blood cell，WBC）數(shù) （血常規(guī)分析儀） ，腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6） 水平 （ELISA） 。 （2） 治療前 （0 h） 、治療24 h和48 h后檢測(cè)各組大鼠心率、平均動(dòng)脈血壓； （3） 治療48 h后，處死大鼠，取心肌組織切片行病理學(xué)檢測(cè) （HE染色，電子顯微鏡下觀察各組線粒體）； （4） 治療48 h后，采用qPCR和Western blotting分別檢測(cè)各組線粒體內(nèi)膜特異的腺甘酸轉(zhuǎn)移酶 （adenosine transferase，ANT） mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.2.1 ELISA檢測(cè)：眼眶靜脈取血 （0.3 mL） ，采用離心機(jī)3 000 r/min 4 ℃離心10 min，然后-80 ℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒 （美國(guó)R&D公司） 檢測(cè)各組血清中TNF-α、IL-6表達(dá)水平，所有操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 qPCR檢測(cè)：將大鼠心肌組織在液氮中迅速磨碎，加入1 mL Trizol溶液，上下顛倒混勻，室溫放置10 min使組織充分裂解；加入0.2 mL氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置5 min，溶液分成上下兩層；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；小心吸取上層清液（ 約0.6 mL） 到新的離心管中；加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，輕柔顛倒混勻后室溫放置5 min，觀察白色沉淀析出；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，收集RNA沉淀；加入1 mL 75%乙醇（ DEPC水稀釋） 洗滌RNA，7 500 r/min離心5 min（ 4 ℃）；棄去乙醇，吹干后加入20～100 μ L的RNase-free或高溫滅菌的DEPC水溶解；取1 μ L樣品測(cè)定樣品濃度以及純度，260/280在1.8～2.0之間，260/230在2.0～3.0之間為佳；取約100 ng RNA用于瓊脂糖膠電泳，檢測(cè)其是否降解；RNA樣品-80 ℃保存?zhèn)溆?。去除DNA雜質(zhì)，在RNase-free或DEPC處理過的200 μ L離心管中，配制如下反應(yīng)體系，95 ℃處理3 min或70 ℃處理15 min，使RNA聚合酶失活，合成獲得cDNA第一鏈。分別制作上游引物（5’-GTATCTGTCATCAAAGAAGGCTG-3’） 和下游引物（ 3’-CTACCATCGGTTGTCAGACTT-5’） ，采用PCR檢測(cè)儀進(jìn)行定量擴(kuò)增，并定量檢測(cè)各指標(biāo)。RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?2 ℃ 預(yù)處理5 min； 94 ℃度熱變性10 s； 94 ℃熱處理 5 s，60 ℃延伸35 s，循環(huán)40次； 72 ℃5 min。以β-actin為內(nèi)參，利用定量PCR儀自帶軟件算法2-ΔΔCt獲得各指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)：心肌勻漿收集細(xì)胞，RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，測(cè)定蛋白濃度，按50 μ g/mL蛋白含量配制上樣蛋白樣品。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 （NC膜） 上，5%脫脂牛奶封閉蛋白，依次孵育一抗、二抗，Bradford法進(jìn)行組織勻漿的蛋白定量，以GAPDH為內(nèi)參照，比較ANT蛋白表達(dá)情況。最后用底物發(fā)光法進(jìn)行顯色，膠片曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.01進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用x-±s表示。組間比較采用t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠模型建立

內(nèi)霉素建模后，模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠均出現(xiàn)精神萎靡不振、豎毛、嗜睡、眼鼻滲血、稀便等膿毒癥癥狀，而對(duì)照組未有上述癥狀。與對(duì)照組比較，模型組、美托洛爾組和艾司洛爾組體溫和和WBC顯著降低 （均P ＜ 0.001） ，而血清TNF-α及IL-6表達(dá)水平都顯著升高 （均P ＜ 0.05） ，表明膿毒癥模型建立成功。見表1。

2.2 各組大鼠治療前 （0 h） 、治療24、48 h 后心率和平均動(dòng)脈壓比較

表1 建模后各組體溫、白細(xì)胞、血清TNF-α及IL-6表達(dá)水平比較Tab.1 Body temperature，white blood cell count，and serum TNF-α and IL-6 expression in the four groups after modeling

結(jié)果顯示，治療前美托洛爾組、艾司洛爾組與模型組比較心率和平均動(dòng)脈壓沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P ＞ 0.05）；治療48 h后與模型組比較，美托洛爾組 （P = 0.034） 與艾司洛爾組 （P = 0.027） 心率顯著降低，而美托洛爾組 （P = 0.040） 與艾司洛爾組 （P =0.038） 平均動(dòng)脈壓顯著升高。見表2。

2.3 各組大鼠治療48 h后心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果

表2 各組大鼠治療前 （0 h） 、治療24、48 h 后心率和平均動(dòng)脈壓比較Tab.2 Heart rate and mean arterial pressure in the four groups after modeling

結(jié)果顯示，治療48 h后對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞組織致密，未見明顯血管擴(kuò)張；電鏡下可見肌纖維排列有序，線粒體、肌漿網(wǎng)規(guī)則可見。模型組大鼠心肌細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；電鏡下細(xì)胞肌纖維斷裂，線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)辨認(rèn)困難。美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)接近對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞，但仍見充血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；電鏡下可見心肌細(xì)胞肌纖維束排列有序，線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)可見但有部分異常。表明β受體拮抗劑可以一定程度恢復(fù)膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞線粒體的損傷。見圖1。

2.4 各組大鼠心肌組織線粒體內(nèi)膜ANT mRNA及蛋白表達(dá)比較

結(jié)果顯示，治療48 h后，心肌組織線粒體內(nèi)膜ANT的表達(dá)水平與模型組 （0.7±0.3） 比較，美托洛爾組 （1.6±0.6，P = 0.017） 和艾司洛爾組 （1.7±0.7，P = 0.018） ANT mRNA表達(dá)水平顯著增高；Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組比較，美托洛爾組和艾司洛爾組ANT蛋白水平也增高 （圖2） 。表明β受體拮抗劑對(duì)治療膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體具有一定保護(hù)作用。

3 討論

圖1 各組大鼠治療48 h后心肌HE染色及線粒體觀察Fig.1 Appearance of the mitochondria at 48 h after treatment visualized by HE staining

圖2 各組心肌組織 ANT蛋白表達(dá)比較Fig.2 Myocardial ANT protein expression in each group

膿毒癥可以導(dǎo)致明顯的心肌損傷，本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞疏松，排列出現(xiàn)紊亂，細(xì)胞間可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡下可以見到明顯的肌纖維斷裂，線粒體結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞。而美托洛爾組和艾司洛爾組大鼠心肌細(xì)胞排列恢復(fù)有序，電鏡下可見線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)恢復(fù)接近正常形態(tài)。美托洛爾組和艾司洛爾組心肌組織ANT mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于模型組 （均P ＜0.05） ，表明β受體拮抗劑對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體的損傷具有一定緩解或者保護(hù)作用。

革蘭陰性桿菌感染是引起膿毒癥的主要原因，細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)菌壁成分，在敗血癥、多臟器功能衰竭 （multiple organ failure，MOF） 發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。膿毒癥、感染性休克患者的心肌存在Toll樣受體 （Toll-like receptor，TLR） 表達(dá)，內(nèi)毒素可引起心肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-1 β和TNF-α增加，上調(diào)TLR mRNA水平，并降低心肌的收縮性［14］。相反心肌TLR4表達(dá)缺乏的動(dòng)物則對(duì)內(nèi)毒素反應(yīng)減弱，心肌功能影響減少［15］，敲除TLR4基因的大鼠注射內(nèi)毒素后也可觀察到心臟功能障礙弱于野生型［15］。此外TLR4可還可以通過激活MyD88和IFN-β，調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［16］，而PI13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可調(diào)整心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存，該通路的活化可抑制心肌細(xì)胞凋亡。TLR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致血清TNF-α、IL-1 β濃度增加，并引起心肌線粒體功能障礙。另一方面，TNF-α與心肌細(xì)胞膜特異受體結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放過多鈣離子，心肌線粒體鈣離子內(nèi)流增加，鈣離子在線粒體內(nèi)積聚、鈣超負(fù)荷，最終可導(dǎo)致線粒體腫脹、破壞，在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到存在相似的過程［17］。TNF-α還可通過啟動(dòng)心肌線粒體凋亡信號(hào)，使患者心肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔呈高通透狀態(tài)，H+內(nèi)流，導(dǎo)致線粒體膜電位缺失，線粒體腫脹、破裂［18］。以上研究表明心肌細(xì)胞線粒體可能在膿毒癥心臟功能損傷中發(fā)揮重要作用，與本研究結(jié)果一致。

美托洛爾、艾司洛爾是常用的β受體拮抗劑，研究［19］發(fā)現(xiàn)β受體拮抗劑可以促進(jìn)重度膿毒癥患者心率控制、降低死亡率并有效調(diào)節(jié)酸堿常數(shù)。另外一項(xiàng)近期的基于醫(yī)療護(hù)理數(shù)據(jù)的回顧性研究［9］表明β受體拮抗劑可以降低膿毒癥患者31%醫(yī)院死亡率以及41%的30 d死亡率。以上研究說明β受體拮抗劑有利于緩解膿毒癥患者的心臟功能損傷。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用美托洛爾和艾司洛爾可以緩解膿毒癥大鼠的心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)損傷，使ANT的表達(dá)水平增高，表明β受體拮抗劑對(duì)于膿毒癥心肌細(xì)胞線粒體的損傷有保護(hù)作用。這可能的機(jī)制包括：（1） 慢性心力衰竭患者可出現(xiàn)心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶 （SERCA）和Na+/Ca2+泵 （NCX） 表達(dá)異常，可能影響攝取和釋放Ca2+，導(dǎo)致心肌收縮、舒張功能異常，而β受體拮抗劑可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Ca2+調(diào)整蛋白的表達(dá)，從而改善心肌細(xì)胞Ca2+動(dòng)力學(xué)，提高心肌細(xì)胞功能［18］；針對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞，β受體拮抗劑也有可能通過對(duì)SERCA和NCX的保護(hù)作用來減少線粒體Ca2+超負(fù)荷的發(fā)生，從而達(dá)到保護(hù)線粒體的作用； （2） β受體拮抗劑可以降低膿毒癥心肌線粒體的不飽和脂肪酸指數(shù)以及氧化應(yīng)激，從而影響線粒體功能［20-21］。

綜上所述，β受體拮抗劑對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷具有一定保護(hù)作用，這將為膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體損傷的預(yù)防和治療提供新的研究方向。本研究不足之處：（1） β受體拮抗劑對(duì)于膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用的分子機(jī)制未進(jìn)一步深入闡明； （2） 本實(shí)驗(yàn)觀察周期較短。因此，以后將進(jìn)一步探索β受體拮抗劑對(duì)于膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞線粒體的長(zhǎng)期保護(hù)作用以及具體的分子機(jī)制。