襄陽(yáng)大頭菜醬液中酵母菌多樣性分析

趙慧君，董蘊(yùn)，劉偉，胡事成，郭壯*

(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.襄陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北 襄陽(yáng) 441021；3.湖北襄陽(yáng)孔明菜食品有限公司，湖北 襄陽(yáng) 441104)

湖北襄陽(yáng)大頭菜是湖北襄陽(yáng)的農(nóng)家品種[1]，更是我國(guó)四大名腌菜之一。襄陽(yáng)大頭菜歷史悠久，為諸葛亮隱居襄陽(yáng)隆中時(shí)所創(chuàng)，在民間享有“諸葛菜”、“孔明菜”之美稱[2]。但是襄陽(yáng)大頭菜的生產(chǎn)總體處于粗放式加工狀態(tài)，由于雨水和塵土等因素的影響，腌制池或缸表面會(huì)形成一層白色的生物膜。隨著生物膜的出現(xiàn)，大頭菜的脆度明顯降低且產(chǎn)生刺激性氣味，最終導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降直至失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前關(guān)于食品中微生物的研究多集中在傳統(tǒng)純培養(yǎng)手段。胡懷容等[3,4]從袋裝腐敗的大頭菜中分離微生物進(jìn)行純培養(yǎng)，分離出7株細(xì)菌和2株酵母菌，并對(duì)其生理特性進(jìn)行了研究。饒瑜等[5]對(duì)泡菜生物膜中真菌進(jìn)行分離，研究表明Pichiakluyveri和Geotrichumcandidum是導(dǎo)致生物膜形成的主要原因。值得一提的是，徐婷等[6]使用YPD培養(yǎng)基，采用純培養(yǎng)的方法從長(zhǎng)有生物膜的襄陽(yáng)大頭菜鹵水中分離了1株嗜鹽酵母菌，并將其鑒定為Zygosaccharomycesrouxii。葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)生物膜，Volleková等[7]采用純培養(yǎng)的方法從紅酒的表面生物膜中分離到4株酵母菌；Sergio等[8]從巴西葡萄酒中分離得到了6個(gè)種的酵母菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均可以在不同的碳源下形成生物膜。

本研究對(duì)長(zhǎng)膜襄陽(yáng)大頭菜醬液中的微生物多樣性進(jìn)行了研究，不僅能夠了解可能導(dǎo)致襄陽(yáng)大頭菜長(zhǎng)膜的微生物組成和種類，亦可為后續(xù)因形成生物膜而導(dǎo)致大頭菜產(chǎn)品品質(zhì)下降這一產(chǎn)業(yè)化問(wèn)題的解決提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

本試驗(yàn)所用材料采集于襄陽(yáng)孔明菜食品有限公司。分別在3個(gè)正常發(fā)酵大頭菜池和3個(gè)長(zhǎng)膜的大頭菜池里采集醬液和生物膜，采集后低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

PDA固體培養(yǎng)基：北京博奧星生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母提取物：英國(guó)OXOID公司；葡萄糖：天津福星化學(xué)試劑廠；瓊脂粉：上海國(guó)藥集團(tuán)；DNA Marker：Fermentas公司；PCR清潔試劑盒(AXYGEN)：購(gòu)于北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2×PCR Mix：購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTP、pMD18-T vector：購(gòu)于大連寶生物技術(shù)有限公司(TaKaRa)；PCR引物的合成和測(cè)序：由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.3 樣品中酵母菌的分離與純化

在無(wú)菌條件下分別將正常發(fā)酵大頭菜醬液和長(zhǎng)膜大頭菜醬液用生理鹽水進(jìn)行稀釋，稀釋梯度分別為10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，每個(gè)梯度各取0.5 mL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下培養(yǎng)1天左右。取長(zhǎng)出的單菌落劃線，純化2次，進(jìn)行形態(tài)觀察和鏡檢，將純化后的菌株保存在-80 ℃冰箱中待用。

1.4 酵母菌基因組DNA的提取及檢測(cè)

采用消解酶-氯化芐法提取酵母菌DNA[9]，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 酵母菌28S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

以所提取的大頭菜酵母菌總DNA為模板進(jìn)行分離菌株D1/D2可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增，引物為NL1和NL4(序列見(jiàn)表1)[10]。PCR擴(kuò)增體系為2.5 μL10×PCR Buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(2.5 mol/L)，0.5 μL NL1(10 mmol/L)，0.5 μL NL4 (10 mmol/L)，0.5 μL rTaq(5 U/μL)，1 μL DNA模板，18 μL無(wú)菌水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min預(yù)變性，95 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers' names and sequences

1.6 PCR產(chǎn)物的純化、克隆及測(cè)序

將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T vector連接并轉(zhuǎn)化，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，所用的引物為M13F(-47)和M13R(-48)。PCR擴(kuò)增體系為10 μL 2×PCR Mix，0.5 μL M13F(-47)(10 mmol/L)，0.5 μL M13R(-48)(10 mmol/L)，1 μL菌液為模板，8 μL無(wú)菌水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后用1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠檢測(cè)。陽(yáng)性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 測(cè)序產(chǎn)物的比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果除去兩端載體序列，然后利用NCBI Blast從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提取相似度比較高的相似序列，用MEGA 4.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用Neighbor-joining(鄰位相連法)制作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[11]，利用Bootstrap(自展法)檢測(cè)制作的系統(tǒng)樹(shù)[12]，自展數(shù)據(jù)集為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌菌落形態(tài)觀察

從正常發(fā)酵大頭菜醬液(標(biāo)號(hào)為N)中和長(zhǎng)膜大頭菜醬液(標(biāo)號(hào)為M)中共20株酵母菌株培養(yǎng)于YPD液體培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)1天，肉眼觀察菌落形態(tài)為：部分試管內(nèi)溶液澄清，表面無(wú)膜生成，底部沒(méi)有沉淀；部分試管液體表面有膜形成，底部有沉淀存在，溶液有一定程度的渾濁。將20株酵母菌劃線在PDA瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1天，菌落形態(tài)為：菌落顏色呈乳白色；菌落從側(cè)面觀察有凸起也有扁平，表面粗糙有褶皺，也有表面光滑；菌落邊緣有長(zhǎng)出毛邊，也有呈現(xiàn)鋸齒狀，或者整齊無(wú)邊。分離菌株菌落形態(tài)觀察結(jié)果匯總?cè)氡?，菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。

表2 菌落形態(tài)觀察Table 2 Observation of colonial morphology

續(xù) 表

圖1 酵母分離菌株在PDA上的培養(yǎng)Fig.1 Culture of yeasts isolated strains on PDA

2.2 顯微鏡下大頭菜分離菌株的觀察結(jié)果

分離到的20株酵母菌用結(jié)晶紫染色后進(jìn)行鏡檢，在顯微鏡下可以看到分離菌株的細(xì)胞形態(tài)：存在桿狀，球狀，橢圓形，見(jiàn)圖2。

圖2 大頭菜分離菌株在顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)(10×100)Fig.2 Cell morphology of strains isolated from mustard root under microscope (10×100)

2.3 酵母菌的DNA提取及28S rDNA擴(kuò)增

提取的酵母菌DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后為單一條帶，無(wú)拖尾。說(shuō)明提取的DNA完整無(wú)降解，可用于下一步酵母菌28S rDNA的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在650 bp左右位置有一條明亮清晰的條帶，與目的條帶相符。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化與T-A克隆，并將陽(yáng)性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.4 NCBI比對(duì)結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

大頭菜20株酵母分離菌株經(jīng)28S r DNA D1/D2區(qū)測(cè)序后，將結(jié)果在NCBI用Blast進(jìn)行比對(duì)，具體對(duì)比結(jié)果及序列相似性見(jiàn)表3。

表3 分離菌株的比對(duì)結(jié)果Table 3 Comparison results of the isolated strains

由表3可知，除了Cystobasidiumcalyptogenae(FJ515245)只有94%相似度(可能為新種，目前實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行驗(yàn)證)，其他分離菌株相似度≥99%。從3份正常發(fā)酵襄陽(yáng)大頭菜醬液中分離出13株酵母菌，其中2株Zygosaccharomyces屬，3株Cystobasidium屬，3株Erythrobasidium屬，2株Acremonium屬，1株Rhodotorula屬，1株Bulleromyces屬，1株Issatchenkia屬。從3份長(zhǎng)膜襄陽(yáng)大頭菜醬液中共分離出7株酵母菌，其中5株Zygosaccharomyces屬，1株Yamadazyma屬，1株Rhodotorula屬。

根據(jù)20株酵母菌在NCBI上的比對(duì)結(jié)果選取相似度高的已知序列菌株，利用MEGA 4.0做出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，找出待測(cè)菌株與已知酵母種屬菌株的關(guān)系。

2.5 正常發(fā)酵大頭菜與長(zhǎng)膜大頭菜醬液中酵母菌的比較

圖3 28S rDNA D1/D2 區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 28S rDNA D1/D2 region sequence

20株酵母菌中7株是從長(zhǎng)膜大頭菜醬液中分離的，13株是從正常發(fā)酵大頭菜醬液中分離的。長(zhǎng)膜大頭菜醬液中分離的酵母菌5株屬于Zygosaccharomyces屬，占總分離菌株的71.4%，為長(zhǎng)膜大頭菜中酵母菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，其中3株在培養(yǎng)1天后可以看到在YPD培養(yǎng)基的表面長(zhǎng)膜，推測(cè)可能是引起大頭菜長(zhǎng)膜的酵母菌株。泡菜中也存在長(zhǎng)膜的現(xiàn)象，俗稱“生花”。從泡菜中分離的腐敗真菌主要為畢赤酵母(Pichiamembranefaciens)[13,14]，這與襄陽(yáng)大頭菜中分離的酵母是不同的，兩者的腐敗機(jī)制可能存在著差異，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。正常發(fā)酵大頭菜醬液中13株酵母菌屬于9個(gè)屬，多樣性高于長(zhǎng)膜大頭菜醬液。Zygosaccharomyces屬菌株也存在于正常發(fā)酵大頭菜醬液中，占分離菌株的15.3%，非優(yōu)勢(shì)菌株。

3 結(jié)論

本研究分別從3份正常發(fā)酵大頭菜醬液和3份長(zhǎng)膜大頭菜醬液中進(jìn)行了酵母菌的分離，共分離20株菌。通過(guò)28S rDNA D1/D2可變區(qū)同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，20株菌屬于10個(gè)屬2個(gè)門(mén)。從比對(duì)結(jié)果可以看出，正常發(fā)酵大頭菜醬液中的酵母菌多樣性高于長(zhǎng)膜大頭菜醬液，其中長(zhǎng)膜大頭菜醬液中的優(yōu)勢(shì)菌屬為Zygosaccharomyces，推測(cè)是引起大頭菜醬液長(zhǎng)膜的酵母菌屬。

在泡菜和肉類的腐敗過(guò)程中，細(xì)菌起到了重要的作用[15-17]，但是在襄陽(yáng)大頭菜中細(xì)菌對(duì)大頭菜長(zhǎng)膜的貢獻(xiàn)目前還沒(méi)有人研究，這是本實(shí)驗(yàn)室下一步要進(jìn)行的工作。