利用重組胰蛋白酶對鰻魚下腳料酶解生產(chǎn)復(fù)合氨基酸及產(chǎn)品中鈣的測定

廖曉峰,于榮

(1.東華理工大學(xué) 化學(xué)與生物材料學(xué)院,南昌 330038；2.東華理工大學(xué) 水資源與環(huán)境工程學(xué)院,南昌 330038)

鰻魚是我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類，近年來由于福建、廣東、江蘇、浙江等鰻魚主產(chǎn)地水質(zhì)惡化，很多養(yǎng)殖企業(yè)轉(zhuǎn)移到江西省，是江西省重要的出口創(chuàng)匯渠道之一。鰻魚養(yǎng)殖與加工企業(yè)在江西省各地都有，年產(chǎn)烤鰻數(shù)萬噸。但鰻魚加工企業(yè)都面臨大量鰻魚加工剩余的下腳料無法處理，下腳料因?yàn)榻魇?nèi)沒有廠方收購，只有賣給沿海一帶收購方處理，但路途遠(yuǎn)，該下腳料又含有高蛋白、高脂肪，外運(yùn)難以保質(zhì)保鮮，很多下腳料沒有得到有效、合理的利用，還會造成環(huán)境污染，浪費(fèi)資源，也影響環(huán)境，因此鰻魚下腳料綜合處理問題日益迫切，目前江西省內(nèi)還是空白。本項(xiàng)目對鰻魚下腳料進(jìn)行綜合處理，生產(chǎn)復(fù)合氨基酸、鰻魚蛋白粉等產(chǎn)品，可以作為食品鮮味劑原料，也可以作為高級醬油原料。鰻魚粉含多種氨基酸，特別是鮮味氨基酸含量高，且鈣含量非常高，適合制作中老年人的強(qiáng)化鈣，兒童的調(diào)味品基料，例如兒童強(qiáng)化醬油、中老年強(qiáng)化醬油、強(qiáng)化鮮味粉、鮮味湯料、鰻魚精等產(chǎn)品，提高資源利用率，保護(hù)環(huán)境[1-4]。

鰻魚下腳料綜合處理研究在江西省還是一個(gè)空白，國內(nèi)外對鰻魚研究主要集中在鰻魚養(yǎng)殖及加工方面?？决犐a(chǎn)后的下腳料由于富含高蛋白，利用蛋白質(zhì)酶解技術(shù)對鰻魚下腳料進(jìn)行酶解，再經(jīng)過均質(zhì)、噴霧干燥等工藝，生產(chǎn)復(fù)合氨基酸、鰻魚蛋白粉等產(chǎn)品，既可以為企業(yè)解決環(huán)境污染的后顧之憂，又可以為企業(yè)帶來新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)，還可以促進(jìn)就業(yè)和帶動(dòng)鰻魚養(yǎng)殖及加工業(yè)的發(fā)展。

1 理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)、研究目的

鰻魚肉蛋白富含賴氨酸及精氨酸，重組胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，可特異切割賴氨酸及精氨酸C末端肽鍵，是由重組大腸桿菌表達(dá)生產(chǎn)，氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶完全一致，重組豬胰蛋白酶具有與動(dòng)物源性豬胰蛋白酶相同的酶學(xué)性質(zhì)。重組胰蛋白酶分子量為24 kD，最適pH為7.0～11.0。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組胰蛋白酶對鰻魚蛋白水解最好，前期實(shí)驗(yàn)通過幾種不同蛋白酶對鰻魚下腳料的酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)胰蛋白酶酶解效率最好。實(shí)驗(yàn)選用上海雅心生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的重組胰蛋白酶為酶解制劑，目的是研究酶解的最佳工藝條件及產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和鈣的含量測定方法。

2 材料與方法

2.1 儀器

CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器 上海梅穎浦儀儀器有限公司；BS223S分析天平 賽多利斯電子天平儀器有限公司；UV751GD紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；WFX-120原子吸收分光光度計(jì) 北京百分瑞利儀器有限公司。

2.2 原料及試劑

鰻魚帶肉骨：選取新鮮無腐敗的鰻魚帶肉骨作原料，江西華誼食品有限公司提供；重組胰蛋白酶：上海雅心生物技術(shù)有限公司(要求酶活在20萬U/g以上)。

2.3 制備工藝[5]

2.3.1 工藝流程

鰻魚帶肉骨→預(yù)處理→凈鰻魚帶肉骨→烘干→干鰻魚帶肉骨→粉碎、均質(zhì)→鰻魚肉骨粉→水提→鰻魚肉骨粉料液→酶解→酶解液→均質(zhì)→噴霧干燥→成品。

2.3.2 工藝過程

2.3.2.1 預(yù)處理

鰻魚帶肉骨經(jīng)篩選、整理后,于50 ℃溫水浸泡30 min，去除雜質(zhì)，清水洗凈，瀝干待用。

2.3.2.2 烘干

預(yù)處理后的原料置于干燥箱中干燥，干燥溫度為80 ℃，時(shí)間5～6 h。

2.3.2.3 粉碎、均質(zhì)

干燥好的原料粉碎，粉碎后再加入10倍的蒸餾水調(diào)勻，高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，得到鰻魚骨粉料液。

2.3.2.4 酶解

均質(zhì)后的料液放入酶解器中，預(yù)熱至45 ℃后恒溫，用20%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0～9.0左右，再按2%～5%投料量將重組胰蛋白酶投入(添加胰蛋白酶的目的是利用胰蛋白酶將鰻魚肉蛋白水解成氨基酸，得到高含鈣的復(fù)合氨基酸混合液，再經(jīng)均質(zhì)、噴霧干燥等工藝生產(chǎn)蛋白鈣及蛋白粉產(chǎn)品，通過前期實(shí)驗(yàn)研究表明胰蛋白酶對鰻魚肉的酶解效率高)，攪拌20 min，然后加熱至60～80 ℃(10 min),使原料酶解。

2.3.2.5 噴霧干燥

將均質(zhì)后的酶解液經(jīng)過噴霧干燥，得到產(chǎn)品。

2.3.2.6 蛋白質(zhì)含量的測定[6]

將酶解液在波長為215 nm和225 nm的紫外分光光度計(jì)下分別測定其吸光值，計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。

本次實(shí)驗(yàn)采用215 nm和225 nm的吸收差法測定蛋白質(zhì)，用215 nm和250 nm外光吸收差值與單一波長測定相比，可減少誤差。

蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=0.144×(A215-A225)。

測定區(qū)間：20～100 μg蛋白質(zhì)/mL。

蛋白質(zhì)提取率(%)=原料中蛋白質(zhì)含量/酶解液中蛋白質(zhì)含量×100/100。

3 結(jié)果分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)對酶解結(jié)果的影響[7-11]

3.1.1 加酶量的影響

稱取原料20 g，加入10倍水研磨，后按2%，3%，4%，5%投料量將胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，45 ℃恒溫,反應(yīng)時(shí)間為60 min,將pH調(diào)節(jié)到8.0的條件下進(jìn)行酶解，結(jié)果見表1。

表1 加酶量對酶解過程的影響Table 1 The effect of enzyme dosage on the enzymatic hydrolysis process

由表1可知，隨著加酶量的增加，蛋白質(zhì)的提取率下降，在加酶量為2%時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最高，加入過量的酶可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。經(jīng)測定，原料中蛋白質(zhì)平均含量為32.42%，但在原料預(yù)處理過程中蛋白質(zhì)有所損失，胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，可特異切割賴氨酸及精氨酸C末端肽鍵，故胰蛋白酶在對蛋白質(zhì)酶解過程中酶解不完全，不能完全酶解原料中的蛋白質(zhì)，造成蛋白質(zhì)提取率不是很高，但能滿足生產(chǎn)要求。

3.1.2 溫度的影響

稱取原料20 g，加入10倍水研磨，按3.1.1的最佳結(jié)果按2%投料量將重組胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，恒溫40，45，50，55 ℃,反應(yīng)時(shí)間為30 min,將pH調(diào)節(jié)到8.0的條件下進(jìn)行酶解，結(jié)果見表2。

表2 溫度對酶解過程的影響Table 2 The effect of temperature on the enzymatic hydrolysis process

由表2可知，重組胰蛋白酶活性溫度范圍是40～45 ℃，比一般的酶活性溫度要高，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率最大，溫度再升高，酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子間碰撞加劇，導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)破壞，蛋白質(zhì)的提取率下降。

3.1.3 時(shí)間的影響

稱取原料20 g，加入10倍水研磨，按2%投料量將胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，恒溫45 ℃(3.1.2的最佳結(jié)果),反應(yīng)時(shí)間為1，2，3，4 h,將pH調(diào)節(jié)到8.0的條件下進(jìn)行酶解，結(jié)果見表3。

表3 反應(yīng)時(shí)間對酶解過程的影響Table 3 The effect of reaction time on the enzymatic hydrolysis process

由表3可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)酶解基本完全，此時(shí)的提取率最高。反應(yīng)時(shí)間過長，可能導(dǎo)致水解蛋白質(zhì)變性分解，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)最佳。

3.1.4 pH值的影響

稱取原料20 g，加入10倍水研磨，后按3.1.1的最佳結(jié)果按2%投料量將重組胰蛋白酶投入，按3.1.2的方法恒溫45 ℃(3.1.2的最佳結(jié)果),反應(yīng)時(shí)間為3 h(3.1.3的最佳結(jié)果),將pH調(diào)節(jié)到6.0，7.0，8.0的條件下進(jìn)行酶解，結(jié)果見表4。

表4 pH值對酶解過程的影響Table 4 The effect of pH on the enzymatic hydrolysis process

由表4可知，pH值在8.0時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最大，隨著pH值再增大，重組胰蛋白酶結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，導(dǎo)致重組胰蛋白酶活性減小。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表5，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表5 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 5 Table of experimental factors and levels

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The experimental results

由表6可知，極差值R為因素A(0.25)，B(0.33)，C(0.26)，故影響蛋白質(zhì)提取量的因素的主次關(guān)系為B(反應(yīng)溫度)>C(pH值)>A(反應(yīng)時(shí)間)。比較這9次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果， 第5次實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)的提取率29.7%最大，因此A2B2C3是最好的搭配。

3.3 酶解液鈣含量的測定

方法:石墨爐火焰原子吸收分光光度法。

儀器：WFX-200石墨爐火焰原子分光光度儀，北京百分瑞利儀器有限公司。

3.3.1 原理

樣品經(jīng)濕法消化后，導(dǎo)入原子吸收分光光度計(jì)中，經(jīng)火焰原子化后，吸收422.7 nm處的共振線，其吸收量與含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。

3.3.2 主要試劑

混合酸消化液：硝酸與高氯酸比為4∶1。

2%氧化鑭溶液：稱取25 g氧化鑭(純度>99.99%)，加75 mL鹽酸于1000 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度。

鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取1.2486 g碳酸鈣(純度>99.99%),加50 mL去離子水，加鹽酸溶解，移入1000 mL容量瓶中，加2%氧化鑭稀釋至刻度。貯存于聚乙烯瓶內(nèi)，4 ℃保存。此溶液每毫升相當(dāng)于500 μg鈣。

鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液：鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制見表7。

表7 鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液配制Table 7 The preparation of calcium standard liquid

鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液配制后，貯存于聚乙烯瓶內(nèi)，4 ℃保存。

3.3.3 測定

將鈣標(biāo)準(zhǔn)使用液分別配制不同濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液(見表8)，測定操作參數(shù)見表9。

表8 不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的配制方法Table 8 The preparation method of different concentration series of standard diluent

表9 測定操作參數(shù)Table 9 Measurement of operating parameters

3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以各濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液與對應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,鈣離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表10和圖1。

表10 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 10 The standard curve of calcium ion

圖1 鈣離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of calcium ion

由圖1可知，線性相關(guān)系數(shù)為0.9996。測定樣品液及空白液A,由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出濃度值(c及c0)，再按下式計(jì)算。

式中：X為樣品中元素的含量，mg/100 g；c為測定用樣品中元素的濃度，μg/mL；c0為試劑空白液中元素的濃度，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量。

3.3.5 樣品中鈣離子含量的測定

將酶解液定容至50 mL，從中取1 mL稀釋至10 mL，用原子吸收法測定鈣離子，所得數(shù)據(jù)見表11。

表11 鈣離子含量的測定Table 11 The determination of calcium ion content

由表11可知，數(shù)據(jù)計(jì)算可以得出鈣的平均含量為47.98 μg/mL。

4 結(jié)論

采用鰻魚帶肉骨作為原料，預(yù)處理后用胰蛋白酶水解法提取生物蛋白鈣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：酶解的最佳條件是在pH為8.0、溫度為45 ℃、加酶量為2%、酶解時(shí)間為3 h的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用紫外分光光度法在215 nm和225 nm的差值下測定產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的含量，用石墨爐原子吸收法測定產(chǎn)品中鈣的含量，產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量可達(dá)29.7%，鈣的含量為4.79%。

鰻魚骨是一種廉價(jià)的可再生資源, 從鰻魚骨中提取復(fù)合氨基酸有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量可達(dá)27.5%～35%左右，鈣的含量也非常高，并且是生物鈣，有利人體的吸收。產(chǎn)品可以作為食品鮮味劑原料，也可以作為高級醬油原料，含多種氨基酸，特別是鮮味氨基酸含量高，且鈣含量非常高，適合制作中老年人的強(qiáng)化鈣、兒童的調(diào)味品基料，例如兒童強(qiáng)化醬油、中老年強(qiáng)化醬油、強(qiáng)化鮮味粉、鮮味湯料、鰻魚精等產(chǎn)品。