應(yīng)用菌刺洗脫法高效分離猴頭菇單孢

龔文兵 謝純良 周映君 朱作華 王亞惠 彭源德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

猴頭菇[Hericium erinaceus(Bull.) Pers]，是一種極為重要的食藥用菌，因外形酷似猴頭而得名。猴頭菇進(jìn)入人們的飲食由來已久，《臨海水土異物志》中稱：“民皆好啖猴頭羹，雖五肉臛不能及之。”猴頭菇栽培起源于中國，是我國目前常規(guī)栽培的食藥用菌之一[1]。

自1994年Kawagishi等[2]從猴頭菇菌絲體中發(fā)現(xiàn)一類鳥巢烷型二萜類化合物（猴頭菌素），并報道該類化合物具有促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成活性以來，猴頭菇中的二萜類化合物受到了廣泛的關(guān)注。目前已經(jīng)從猴頭菇中分離到 25種鳥巢烷型二萜類化合物[3-4]。此外，猴頭菇中還含有其他類型的活性成分，包括多糖、甾體化合物、生物堿類化合物等，具有保肝護(hù)胃、抗癌、抗氧化等多種功效[4]。多年來圍繞猴頭菇的研究報道主要集中于活性物質(zhì)的提取與鑒定[5]，而對其遺傳育種的研究嚴(yán)重滯后，導(dǎo)致新品種選育進(jìn)程緩慢，嚴(yán)重影響了猴頭菇產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

優(yōu)良的菌種是食藥用菌產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，雜交育種是食藥用菌品種選育中應(yīng)用最廣泛、成效最顯著的育種方法之一[6]。猴頭菇是異宗結(jié)合擔(dān)子菌，減數(shù)分裂后產(chǎn)生有性擔(dān)孢子[7-8]?？梢岳脝捂呔昱鋵M(jìn)行猴頭菇雜交育種，獲得性狀優(yōu)良的新品種。雜交育種中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是通過單孢分離獲得單核體。與香菇等傘菌一樣，在猴頭菇中通常采用子實體懸掛法分離單孢[7,9]。其方法是將整個子實體置于無菌的孢子收集器中彈射孢子1天左右，制備孢子懸浮液，連續(xù)稀釋后接種于培養(yǎng)基，再獲得單孢菌株。由于猴頭菇子實體表面不光滑，擔(dān)孢子著生于裸露的菌刺上，采用子實體懸掛法分離單孢污染率較高，并且操作時間長。本試驗建立一種簡單快速的單孢分離方法，旨在推動猴頭菇的遺傳育種研究。

1 試驗材料

1.1 供試菌株

供試菌株為猴頭菇雜交子HeC9，由‘常山猴頭菇’和‘猴頭911’的單核體菌株配對獲得?！Ｉ胶镱^’和‘猴頭 911’菌株由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所王波老師提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

MEA培養(yǎng)基：麥芽浸粉 30.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，瓊脂15.0 g，水1 000 mL。

100 mg/mL氨芐青霉素配置：稱取5 g氨芐青霉素置于50 mL 離心管中，加入40 mL無菌水，充分混勻后定容至50 mL。采用0.22 μm 濾膜過濾，滅菌，分裝后置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗方法

2.1 孢子采集

參照于海龍等[10]的方法進(jìn)行猴頭菇栽培，子實體八成熟時采收。在超凈工作臺上，用75%的酒精對猴頭菇子實體進(jìn)行消毒。分兩種方法收集單孢，一為子實體懸掛彈射法。選擇9個猴頭菇子實體進(jìn)行單孢分離，用滅菌的500 mL 燒杯作為孢子收集器收集單孢，孢子彈射時間為24 h。另一為菌刺洗脫法。將2 μL 100 mg/mL氨芐青霉素加入含有2 mL無菌水的離心管中，用無菌的鑷子挑取1個猴頭菇子實體上的9根菌刺，放入上述氨芐青霉素溶液中清洗數(shù)次，再將清洗后的菌刺放入含有2 mL 無菌水的離心管中搖晃數(shù)次，即制成猴頭菇孢子懸浮液（菌刺洗脫法）。每根菌刺制備1管孢子懸浮液。

2.2 單孢分離

采用連續(xù)稀釋法進(jìn)行猴頭菇孢子的分離。通過連續(xù)稀釋孢子液，使孢子分散到較低濃度，再取200 μL稀釋后的猴頭菇孢子懸浮液，用玻棒均勻涂布于含有氨芐青霉素的MEA培養(yǎng)基中（20 mL培養(yǎng)基中加入20 μL 100 mg/mL氨芐青霉素），然后將培養(yǎng)皿置于恒溫箱內(nèi)，25 ℃避光培養(yǎng)。

2.3 單核菌絲鑒定

待孢子萌發(fā)至肉眼可見，即刻挑取單菌落，置于新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿中的菌落長到1～2 cm時，置于顯微鏡下觀察，沒有鎖狀聯(lián)合即是由擔(dān)孢子萌發(fā)而生成的單核菌絲。

采用子實體懸掛彈射法分離單孢作為對照，選取整個猴頭菇子實體制備孢子懸浮液，再用無菌水連續(xù)稀釋進(jìn)行單孢分離[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩種單孢分離方法的比較

試驗結(jié)果表明，子實體懸掛彈射法中，2個子實體在孢子收集器中感染真菌，棄用；4個子實體獲得了孢子懸浮液，經(jīng)連續(xù)稀釋后涂布于MEA培養(yǎng)基，所有的平皿全部感染細(xì)菌；僅有3個猴頭菇子實體獲得了單菌落，成功率為33.3%。在菌刺洗脫法中，隨機(jī)選擇1個猴頭菇子實體上的9根菌刺制備了9組孢子懸浮液，經(jīng)過稀釋、涂平皿后，有1組孢子懸浮液平皿感染細(xì)菌，其余8組獲得了單菌落，成功率為88.9%。

單孢分離能否成功，與操作難易程度、操作者的分離技術(shù)等相關(guān)。新鮮猴頭菇從開放的環(huán)境中采收，子實體上的雜菌較多，尤其是細(xì)菌。子實體懸掛彈射法中，雖然用75%的酒精對猴頭菇子實體進(jìn)行了消毒，但由于子實體較大，表面不光滑，菌刺較多，難以消毒徹底。而菌刺洗脫法只需對挑取的單根菌刺進(jìn)行抑菌消毒處理，消毒效果要好得多，這是菌刺洗脫法能夠顯著降低污染率的主要原因。此外，與子實體懸掛彈射法比較，菌刺洗脫法無需專門的孢子收集器，直接用無菌水將猴頭菇菌刺上的孢子洗下來，操作簡單，也不用等待孢子彈射，縮短了單孢分離的時間。

3.2 稀釋濃度對挑取單菌落的影響

獲得孢子懸浮液后，采用連續(xù)稀釋法進(jìn)行猴頭菇孢子的分離。菌刺洗脫法中，稀釋了3個濃度梯度（10-1、10-2、10-3）。在子實體懸掛彈射法中，稀釋了 6 個濃度梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）。每種濃度孢子懸浮液涂布5個含有MEA培養(yǎng)基的平皿。涂皿結(jié)果（表 1）表明，菌刺洗脫法中，10-1濃度的孢子懸浮液所涂平皿，萌發(fā)的單菌落很密集，單個平皿中的單菌落數(shù)大于等于100個，難以挑取單菌落到新的培養(yǎng)基上。10-2濃度的孢子懸浮液，孢子萌發(fā)的單菌落數(shù)量比較適中，單個平皿的單菌落數(shù)多介于 10～50個之間，易于挑取單菌落。10-3濃度的孢子懸浮液所涂平皿單菌落偏少，單個平皿單菌落不足10個。子實體懸掛彈射法中，4個稀釋濃度（10-1、10-2、10-3、10-4）的孢子懸浮液所涂平皿上單菌落密集，難以挑取單菌落。10-5濃度的孢子懸浮液所涂平皿，孢子萌發(fā)的單菌落數(shù)量比較適中。10-6濃度的孢子懸浮液所涂的平皿上單菌落較少（表1）。這可能是由于猴頭菇單根菌刺上的孢子數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其整個子實體上的孢子數(shù)量。孢子懸浮液的稀釋倍數(shù)影響后續(xù)挑取單菌落的難易程度?？梢栽谕棵笄埃℃咦討腋∫哼M(jìn)行鏡檢，視野中有3～5個孢子的懸浮液濃度較適宜。

表1 稀釋濃度與單菌落數(shù)量的關(guān)系

3.3 單核菌絲鏡檢結(jié)果

利用菌刺洗脫法，總共獲得了240個單菌落。對這些萌發(fā)的菌株進(jìn)行顯微鏡觀察鑒定，若無鎖狀聯(lián)合的可初步認(rèn)為是單孢萌發(fā)而生成的單核菌絲，有鎖狀聯(lián)合的為雙核菌絲。結(jié)果顯示，單核菌絲較雙核菌絲細(xì)，挑取的240個菌株中，222個是單核菌株（圖1），其余18個菌株是具有鎖狀聯(lián)合的雙核菌株（圖2），采用菌刺洗脫法分離獲得的單核菌株比例為92.5%。萌發(fā)的雙核菌絲可能是由于挑取的菌落中包含了可以配對的單孢。

圖1 猴頭菇單核菌絲

圖2 猴頭菇雙核菌絲

4 結(jié) 論

由于猴頭菇子實體表面布滿菌刺，而擔(dān)孢子著生于裸露的菌刺上，采用傳統(tǒng)的子實體懸掛法分離單孢成功率不高。本研究建立了一種簡單易行的猴頭菇單孢分離方法，對推動猴頭菇遺傳育種研究具有積極意義。與子實體懸掛彈射法相比，最大的不同在于本方法是利用易于消毒的猴頭菇菌刺，將菌刺上的單孢直接洗下來，非常簡單、方便，不需專門的孢子收集器。在降低污染率的同時，也縮短了單孢分離的時間，是一種切實可行的單孢分離手段。除了猴頭菇，本方法還可以推廣到其他食藥用菌品種，挑取小塊著生孢子的組織進(jìn)行消毒抑菌處理，將孢子沖洗下來后再分離單孢，尤其適合子實體表面不光滑，難以進(jìn)行消毒的菇類。