小葉錦雞兒的組織培養(yǎng)

孔冬梅,王興勇,史智敏

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006;2.中國水利水電科學(xué)研究院,北京 100038)

0 引言

小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)是豆科錦雞兒屬的落葉灌木,具有抗旱、抗寒、耐鹽堿和耐瘠薄的生理特性,在防風(fēng)固沙、保持水土和美化環(huán)境等方面具有較強(qiáng)的優(yōu)勢[1-3],同時(shí)富含氮、磷、鉀等元素,既可做良好的灌木綠肥[4-5],又可為畜牧業(yè)提供優(yōu)質(zhì)飼料[6-7],因此具有重要的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。小葉錦雞兒在我國的人工栽培歷史較短,生產(chǎn)上一般以播種育苗為主,易受氣溫、濕度、地勢、蟲害等影響而出苗慢,苗木質(zhì)量參差不齊[8-9]。組織培養(yǎng)是提高優(yōu)良基因型的選擇效率、加速優(yōu)良基因型純合過程的有效手段和途徑。

目前,國內(nèi)對于錦雞兒屬組培快繁的研究以檸條錦雞兒(C.korshinskii)報(bào)道較多[10-14],其次是小葉錦雞兒[15-17]。就現(xiàn)有報(bào)道來看,錦雞兒屬各個種使用外植體材料不同,誘導(dǎo)、繼代、增殖、生根等培養(yǎng)基的濃度配比等也各有所異,究竟哪種外植體和哪種培養(yǎng)體系更適合于小葉錦雞兒的組培擴(kuò)繁還有待于進(jìn)一步的研究。本研究以小葉錦雞兒的離體莖段和種子為起始材料進(jìn)行愈傷組織、芽叢和不定根的誘導(dǎo),以期獲得小葉錦雞兒組培快繁的可行途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

材料采集地點(diǎn)位于山西五寨縣胡會鄉(xiāng)石咀頭村,111.8175°E,38.9771°N,海拔1 400 m,屬于干旱半干旱的丘陵風(fēng)沙區(qū),晝夜溫差大,年平均氣溫4.9 ℃左右,≥10℃的年積溫2 452℃,無霜期120 d左右,平均降雨量478.5 mm,全年降水量主要集中在7～8月。

2016年5月從小葉錦雞兒植株采集幼嫩枝條,用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,盡快滅菌備用;同年秋季采集當(dāng)年成熟的種子,室內(nèi)冰箱保存。

1.2 以幼嫩枝條作為起始材料的培養(yǎng)

1.2.1 外植體制備

將幼嫩枝條在室內(nèi)自來水沖洗30 min后,無菌條件下按如下程序進(jìn)行表面消毒:體積分?jǐn)?shù)70%酒精浸泡10 s-無菌水沖洗數(shù)次-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞浸泡10 min-無菌水清洗數(shù)次。將滅菌后的嫩枝分別當(dāng)年生未木質(zhì)化嫩莖和2年生木質(zhì)化枝條,切成帶1個腋芽的莖段作外植體。

1.2.2 腋芽誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基,調(diào)整其鐵鹽為基本含量的2/3,其中添加0.2或0.5 mg/L 細(xì)胞分裂素(6-BA)和0.01 mg/L 吲哚乙酸(IAA)。

1.2.3 繼代培養(yǎng)

將誘導(dǎo)伸長的腋芽切成帶1個節(jié)的莖段在添加0.5 mg/L 6-BA和0.01 mg/L IAA的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代,之后每4周左右按相同方法進(jìn)行1次繼代。

1.3 以成熟種子作為起始材料的培養(yǎng)

1.3.1 材料的滅菌

選取飽滿健康種子,用蒸餾水沖洗數(shù)遍,70%酒精浸泡10 s,無菌水沖洗數(shù)次,轉(zhuǎn)入0.1%升汞浸泡10 min,再用無菌水清洗數(shù)次,然后將種子在無菌水中浸泡8 h備用。

1.3.2 無菌苗的獲取

在無菌條件下將部分種子去除種殼,另一部分不去除種殼,接種在不含激素的MS培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.3.3 外植體的獲取和培養(yǎng)

從萌發(fā)2周的健康幼苗上切取子葉(0.5 cm×0.5 cm)、真葉(0.5 cm×0.5 cm)、莖段(帶一個節(jié))和下胚軸(0.5 cm),分別培養(yǎng)在附加1.0、1.5或2.0 mg/L萘乙酸(NAA)和0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上。

1.3.4 繼代培養(yǎng)

對誘導(dǎo)出來的愈傷組織,切割成0.5 cm見方的小塊,在添加1.0或2.0 mg/L NAA和6-BA組合,或只添加0.5 或1.0 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代,以后每4周轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。對誘導(dǎo)出的芽叢,每4周將其切割成帶一個節(jié)的莖段在相同培養(yǎng)基上繼代。

1.4 生根培養(yǎng)

將MS培養(yǎng)基中大量元素調(diào)整為基本含量的1/2、1/4和1/8,并分別添加0.5 mg/L吲哚丁酸(IBA)、NAA、IAA,或同時(shí)添加0.5 mg/L IBA和NAA,將伸長至2.0 cm以上的芽接種于這些培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)。

1.5 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件及數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)基均添加蔗糖1.5%、瓊脂0.6%,pH值5.8,在121℃、1.1 kg/cm2壓力下滅菌20 min。培養(yǎng)室溫度(25±2)℃, 光照16 h/d、光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx。

所有培養(yǎng)均重復(fù)3次,結(jié)果用平均值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SE)表示,用Prism6軟件來進(jìn)行方差分析和差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 以幼嫩枝條作為起始材料的培養(yǎng)

2.1.1 腋芽誘導(dǎo)

觀察發(fā)現(xiàn),2年生木質(zhì)化莖段在兩種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上無生長跡象,并在數(shù)天內(nèi)陸續(xù)死亡。未木質(zhì)化的當(dāng)年生莖段在兩種培養(yǎng)基上均有少量腋芽萌發(fā),培養(yǎng)40 d時(shí),添加0.5 mg/L 6-BA和0.01 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上有31.54%的腋芽誘導(dǎo)率,顯著高于添加0.2 mg/L 6-BA和0.01 mg/L IAA的培養(yǎng)基(p<0.05)(表1)。

表1 莖段腋芽誘導(dǎo)效果

2.1.2 芽增殖

繼代培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn),在第二次繼代以后陸續(xù)有一些莖段發(fā)生了增殖,一般1個外植體上芽增殖到2～3個,但增殖率很低,只有約20%。第三次繼代后,生長勢逐漸減弱,并且出現(xiàn)白化現(xiàn)象。

2.2 以種子作為起始材料的培養(yǎng)

2.2.1 無菌發(fā)芽

無菌條件下種子1周后陸續(xù)發(fā)芽。觀察發(fā)現(xiàn),完整種子均可正常萌發(fā),且出芽快而整齊,但去殼種子萌發(fā)率低,究其原因是因?yàn)槿?dǎo)致部分種子的胚受到損壞。

2.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

培養(yǎng)4周時(shí),對來自幼苗的不同外植體在3種不同激素組合的MS培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由表2可看出,4種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率均較高,其中下胚軸和帶節(jié)莖段在3種培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率均為100%。而不同激素組合對子葉和真葉的愈傷組織誘導(dǎo)率影響顯著(P<0.05),二者在1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上,愈傷組織誘導(dǎo)率分別為85.56%和78.66%,隨著NAA濃度逐漸增高,誘導(dǎo)率明顯提高,當(dāng)NAA濃度達(dá)到2.0 mg/L時(shí),子葉和真葉的愈傷組織誘導(dǎo)率也分別達(dá)到或接近100%。由此表明,小葉錦雞兒實(shí)生苗外植體均適合愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)

觀察發(fā)現(xiàn),愈傷組織每次繼代后均有明顯的增殖現(xiàn)象,但只在第一次繼代后有0.67%-15.33%的不定芽誘導(dǎo)率,之后的繼代不僅無不定芽發(fā)生,愈傷組織的的活力也逐漸減弱,甚至褐化死亡。這表明實(shí)生苗的愈傷組織容易獲得,但愈傷組織的進(jìn)一步培養(yǎng)還需要尋找更合適的培養(yǎng)條件。

表2 4種外植體愈傷組織誘導(dǎo)率

表3 愈傷組織分化

2.2.4 腋芽誘導(dǎo)與繼代

所有帶節(jié)莖段在3種激素組合的培養(yǎng)基上,在基部形成愈傷組織的同時(shí),上部也在不斷生長,同時(shí)有大量芽叢發(fā)生,這些芽叢是節(jié)部腋芽萌發(fā)并增殖所致。在添加2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后,芽叢增值率高達(dá)98.92%,顯著高于另外兩組處理(P<0.05)(表4)。在該培養(yǎng)基上3次繼代后腋芽誘導(dǎo)和增殖效果都能達(dá)到或接近100%。

表4 無菌苗莖段初代培養(yǎng)效果

2.2.5 生根培養(yǎng)

在所設(shè)計(jì)的12種生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn),只在1/8MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基上,有少量不定根發(fā)生,生根率為12.41%(表5),根系白色健康。

3 討論

目前錦雞兒屬的組培擴(kuò)繁使用的外植體基本是莖段,包括直接從野外植株上采集的莖段和來自無菌實(shí)生苗的莖段,就植株再生途徑來說,基本實(shí)現(xiàn)了從無菌苗誘導(dǎo)芽叢的直接發(fā)生和植株再生,還未見通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽實(shí)現(xiàn)植株再生的報(bào)道。本研究也只通過無菌苗莖段的腋芽誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了植株再生。

有研究者在中間錦雞兒(C.intermedia)和檸條錦雞兒的培養(yǎng)中成功誘導(dǎo)了愈傷組織的發(fā)生,但都未實(shí)現(xiàn)愈傷組織的分化[10,12,18]。本研究雖然從小葉錦雞兒獲得了100%的愈傷組織誘導(dǎo)率,但愈傷組織分化率最高也僅有15.33%,并且在后續(xù)的繼代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)愈傷組織快速老化。因此愈傷組織的繼代培養(yǎng)和分化是錦雞兒屬離體培養(yǎng)應(yīng)該解決的一個問題。

表5 生根誘導(dǎo)

從已有報(bào)道來看,小葉錦雞兒無菌苗莖段的芽叢誘導(dǎo)率最高已達(dá)94.8%[16],本研究在MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上基本實(shí)現(xiàn)了100%芽叢誘導(dǎo)和增殖。但不定根的誘導(dǎo)研究結(jié)果卻相差較大。張強(qiáng)等(2005)研究發(fā)現(xiàn)適合不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基組合是MS+0.4 mg/L IAA+0.2 mg/L IBA[16],牛西午等(2005)發(fā)現(xiàn)不定根發(fā)生所適合的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IAA,并且認(rèn)為IAA對小葉錦雞兒生根的作用好于NAA和IBA[15]。而本研究在添加IAA的培養(yǎng)基上沒有根的發(fā)生,只在1/8MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基上實(shí)現(xiàn)了低頻率的根發(fā)生。所有報(bào)道結(jié)果在培養(yǎng)基營養(yǎng)和激素配比上均有較大差異。這可能是由于不定根發(fā)生是組培的最后一個環(huán)節(jié),不僅直接受到生根培養(yǎng)基的影響,還受到之前芽誘導(dǎo)和增殖階段各種因子滯后效應(yīng)的影響。因此,進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)基和激素組合的試驗(yàn)范圍,誘導(dǎo)高頻率不定根發(fā)生是建立小葉錦雞兒組培技術(shù)體系的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

(1)以幼嫩莖段為外植體的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),當(dāng)年生未木質(zhì)化的幼嫩枝條比2年生木質(zhì)化的枝條適合腋芽的誘導(dǎo)培養(yǎng);

(2)無菌實(shí)生苗的子葉、真葉、帶節(jié)莖段和下胚軸均適合愈傷組織的誘導(dǎo),在添加適當(dāng)濃度NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率均可達(dá)到或接近100%,但愈傷組織的分化困難。

(3)無菌實(shí)生苗的帶節(jié)莖段在添加適當(dāng)濃度NAA(1.5～2.0 mg/L)和6-BA(0.5 mg/L)的MS培養(yǎng)基上腋芽的萌發(fā)率和增殖率最高可達(dá)約100%,在1/8MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA 培養(yǎng)基上生根率達(dá)到12.41%,實(shí)現(xiàn)了植株的再生。