不同辣椒品種果實(shí)發(fā)育過程中DNA甲基化的MSAP分析

李寧，帕提古麗·艾斯木托拉，楊生保，王柏柯，唐亞萍，楊濤，余慶輝

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】辣椒(CapsicumannuumL.)，也可稱為番椒、辣茄等，隸屬茄科(solanaceae)，辣椒屬(C.apsicumL.)，主要產(chǎn)地分布于南北美洲、亞歐大陸以及大洋洲[1]。辣椒紅素作為目前銷售量最大的純天然的色素，被廣泛應(yīng)用到各行各業(yè)中去。在國內(nèi)農(nóng)作物市場上，而每年辣椒紅素的產(chǎn)量大約是2 000 t[2]。新疆制干加工型辣椒年種植面積達(dá)3.5×104hm2，干椒年產(chǎn)量15×104～20×104t，辣椒成為新疆發(fā)展紅色產(chǎn)業(yè)的重要支柱作物?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】辣椒果實(shí)中的主要色素是辣椒紅素和辣椒玉紅，通過辣椒紅素-辣椒玉紅合酶(CCS)由辣椒特有的類胡蘿卜素路徑合成[3]。辣椒擁有高度進(jìn)化的類胡蘿卜素合成路徑，前人采用基因克隆技術(shù)得到了辣椒紅素相關(guān)的部分基因，辣椒中尚未發(fā)現(xiàn)有哪個(gè)單基因突變可影響色素含量的差異[4]。對辣椒紅素的表觀遺傳及其調(diào)控機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究。辣椒中胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化是影響其外形的較為明顯的修飾形式，DNA甲基化能夠?qū)ψ魑锏耐獗?、生長發(fā)育的情況等其他方面產(chǎn)生重要的影響。經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果和數(shù)據(jù)都能夠證明DNA甲基化在植物逆境脅迫響應(yīng)以及生長等重要的生命進(jìn)程有明顯的影響，DNA甲基化的發(fā)生還會引起基因沉默以及功能蛋白的缺失，導(dǎo)致于植物性狀發(fā)生改變[5-7]。MSAP(methylation-sensitive amplified polymorphism)法用以同裂酶HpaII和MspI當(dāng)做高頻切割酶來取代AFLP(amplified fragment length polymorphism)中的MspI。其他遵循標(biāo)準(zhǔn)的AFLP分析[8]。在同裂酶(如HpaII和MspI)的眾多特性中，其能夠準(zhǔn)確的分辨出序列中的甲基化，使得DNA進(jìn)行不同的片段切割方式，產(chǎn)生出不同的切割片段來對甲基化位點(diǎn)進(jìn)行表示[9-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于辣椒紅素表觀遺傳機(jī)制的研究仍未見報(bào)道，鮮見對辣椒果實(shí)發(fā)育過程中的DNA甲基化變化的研究。結(jié)合MSAP技術(shù)，研究不同品種辣椒果實(shí)發(fā)育過程DNA甲基化的狀態(tài)和模式的變化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以7月下旬到10月上旬2個(gè)取材時(shí)期的GB14和GB38兩個(gè)辣椒品種果實(shí)為研究對象，以DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(methylation sensiitve amplified polymorphism，MSAP)技術(shù)為基礎(chǔ)，對各時(shí)期辣椒果實(shí)基因組甲基化變化進(jìn)行觀察和研究。并對甲基化表現(xiàn)呈多態(tài)性變化的8個(gè)片段回收、測序分析。為揭示辣椒紅素的表觀遺傳機(jī)制以及辣椒高紅素品種的選育奠定基礎(chǔ)理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

采用辣椒紅素低的GB14和辣椒紅素高的GB38兩個(gè)辣椒品種不同發(fā)育階段(綠熟期、紅熟期)的果實(shí)。引物(上海生工，中國)；植物總DNA提取試劑盒，純化試劑盒，DNA marker、克隆載體試劑盒，RNase-Free ddH2O，dNTP、10×buffer及內(nèi)切酶均使用北京博邁德生物技術(shù)有限公司所生產(chǎn)的產(chǎn)品，而其余的實(shí)際都是分析純級別的試劑。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

采用北京博邁德植物總DNA提取試劑盒提取總DNA，將DNA溶于ddH2O中，進(jìn)而對此進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)的實(shí)驗(yàn)，在完成這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)之后將剩余溶液放入-20℃的冰箱中密封保存，以備下次實(shí)驗(yàn)之用。

1.2.2 MSAP分析

甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)以Christoph等[8]的方法為基礎(chǔ)，進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐晟?，再此試?yàn)中使用EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ連個(gè)雙酶切組合。表1

酶切反應(yīng)中，DNA樣本(200 ng/μl)2 μL，10×Buffer 4 μL(50 mM KAc，20 mM Tris-acetate，10 mM MgAc2，1 mM dTT 2 μL)，10 U/μLEcoRⅠ和HpaⅡ內(nèi)切酶各0.8 μL，加水至20 μL，37℃保溫過夜。

在進(jìn)行連接反應(yīng)的過程中，在其實(shí)驗(yàn)原料中酶切片中進(jìn)行與人工設(shè)計(jì)的與EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ酶切位點(diǎn)互補(bǔ)的拼接工作，其中接頭連接體系為40 μL，20 μL酶切產(chǎn)物，10×T4 Buffer 4 μL，20 μM的EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ接頭各0.8 μL，5 U/μL連接酶2 μL，其余用水補(bǔ)齊，16℃過夜。

表1 用于MSAP分析的接頭和引物序列
Table 1 Adapters and primers used for MSAP analysis

接頭與引物Connectors and Primers引物序列 (5'-3')Primer sequenceEcoR I接頭EcoR I ConnectorsCTCGTAGACTGCGTACCAATTGGTACGCAGTCTACHM接頭HM ConnectorsGACGATGAGTCCTGAGCGCTCAGGACTCAT預(yù)擴(kuò)增引物Pre-Amplified PrimerGACTGCGTACCAATTC(E00)GATGAGTCCTGAGCGG(HM00)選擇性擴(kuò)增引物Selective Amplification PrimerGACTGCGTACCAATTCACC(E1)GACTGCGTACCAATTCACG(E2)GACTGCGTACCAATTCCAT(E3)GACTGCGTACCAATTCGTA(E4)GACTGCGTACCAATTCGTG(E5)GACTGCGTACCAATTCTCT(E6)GATGAGTCCTGAGCGGAGC(H1)GATGAGTCCTGAGCGGAGG(H2)GATGAGTCCTGAGCGGATC(H3)GATGAGTCCTGAGCGGCTC(H4)

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中含有酶切產(chǎn)物2 μL，10 mM dNTPs 0.4 μL、10×Buffer(25mM Mg2+)2 μL、5 U/μLTaq酶0.2 μL、10 μM E00-primer 0.5 μL、10 μM M00-primer 0.5 μL，其余用水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件為：94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，26個(gè)循環(huán)，在72℃的條件下進(jìn)行10 min。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的溶劑稀釋20倍，以保證后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程能夠順利完成。

選擇性擴(kuò)增體系與預(yù)擴(kuò)增體系相同。其PCR儀上設(shè)定的條件和過程是：在94和65℃到56℃之間分別持續(xù)30 s的時(shí)間，在72℃的時(shí)候持續(xù)1 min，其退火溫度在每個(gè)循環(huán)之后下降0.7℃，之后進(jìn)行降式PCR擴(kuò)增。在上述三個(gè)溫度段內(nèi)往復(fù)進(jìn)行23次，再在72℃延伸10 min。

將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物中假如適量的緩沖溶液，在94℃時(shí)，持續(xù)10 min使其充分的變性，之后把6%的變性聚丙烯酰胺凝膠加入到得到的溶液中去，進(jìn)行垂直方向的電泳分析，之后在使用硝酸銀進(jìn)行染色，在經(jīng)過水的漂洗以及氫氧化鈉顯色等項(xiàng)目。在對得到的電泳條帶進(jìn)行相應(yīng)的分析。

1.2.3 特異性條帶回收測序

在上述實(shí)驗(yàn)后獲得的聚丙烯酰胺凝膠上選取差異較大的條帶進(jìn)行取樣，把樣品放入適當(dāng)?shù)娜萜髦性诜湃?0 μL的TE緩沖液(pH值8.0)，進(jìn)行沸水浴，時(shí)間為10 min、等其完成沉淀之后，抽取3 μL的上清液作為對比對象。適應(yīng)相同類型的引物和反應(yīng)體系進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)步驟，之后再用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離操作，最后同樣使用北京博邁德生物技術(shù)有效公司生產(chǎn)額純化試劑盒進(jìn)行最后的實(shí)驗(yàn)。完成此實(shí)驗(yàn)后，將兩次實(shí)驗(yàn)獲取的物質(zhì)送往上海生工測序公司進(jìn)行更較準(zhǔn)確的測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA瓊脂糖檢測

在進(jìn)行辣椒果實(shí)DNA質(zhì)量檢測時(shí)使用0.8%的瓊脂糖，研究表明，在該DNA中，其結(jié)果是一條單帶，并且沒有講解現(xiàn)象的發(fā)生，在之后進(jìn)行的紫外分光光度計(jì)試驗(yàn)中證實(shí)了其DNA純度較高的猜想。圖1

圖1 辣椒果實(shí)DNA檢測結(jié)果
Fig.1 DNA test results of Capsicum fruit

2.2 PAGE電泳檢測結(jié)果

在進(jìn)行了優(yōu)化預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系后，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行50倍的稀釋操作，所得到的溶液取用1 μL作為實(shí)驗(yàn)的對比對象，再取用10 μL進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)操作。共組合成24對引物進(jìn)行篩選。在100～800 bp選擇擴(kuò)增條帶致密、多態(tài)性高的引物組合。在現(xiàn)有的24對組合中，通過對比分析，選出4對較為有實(shí)驗(yàn)價(jià)值的組合進(jìn)行了MSAP檢測。表2

表2 24對選擇性擴(kuò)增引物組合
Table 2 24 pairs of selective amplified primer combinations

引物編號Primer number引物組合Primer combination引物編號Primer number引物組合Primer combination引物編號Primer number引物組合Primer combinationP1E1H3P9E3H3P17E4H3P2E1H4P10E3H4P18E4H4P3E1H1P11E3H1P19E4H1P4E1H2P12E3H2P20E4H2P5E2H3P13E5H3P21E6H3P6E2H4P14E5H4P22E6H4P7E2H1P15E5H1P23E6H1P8E2H2P16E5H2P24E6H2

圖2 兩個(gè)辣椒品種的果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期DNA甲基化電泳
Fig.2 DNA methylation electrophoresis of two capsicum cultivars in different developmental stages

表3 辣椒基因組DNA甲基化修飾位點(diǎn)序列Blast分析
Table 3 Results of blast analysis of gene methylation modified loci of capsicum genome

序列同源序列一致性E值登錄號Pep-1PREDICTED: Capsicum annuum ABC transporter G family member 6(LOC107871342),mRNA99%0XM_016718249.1Pep-2PREDICTED:Capsicum annuum uncharacterized LOC107871923(LOC107871923),mRNA85%1.00E-91XM_016718770.1Pep-3Capsicum annuum clone BAC CaCM414G15,complete sequence74%5.00E-28GU048885.1Pep-4PREDICTED: Capsicum annuum uncharacterized LOC107864630(LOC107864630),transcript variant X5,miscRNA81%5.00E-88XR_001672686.1Pep-5Capsicum annuum clone BAC CaCM303O04,complete sequence74%6.00E-31GU048883.1Pep-6PREDICTED: Capsicum annuum putative disease resistance RPP13-like protein 1(LOC107847616),mRNA99%6.00E-91XM_016691985.1Pep-7Capsicum annuum cultivar Jeju mitochondrion,complete genome91%6.00E-27KJ865410.1Pep-8PREDICTED: Capsicum annuum serine/threonine-protein kinase Nek6-like (LOC107843669),transcript variant X1,mRNA98%3.00E-37XM_016688036.1

2.3 測序結(jié)果

對10個(gè)辣椒基因組DNA甲基化修飾位點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)的操作之后，得到了8條DNA甲基化修飾位點(diǎn)的核苷酸序列。使用BLASTn對此8條核苷酸序列進(jìn)行分析，辣椒基因組DNA中有轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Pep-5)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(Pep-3)、跨膜蛋白(Pep-5)、選擇性剪切體(Pep-4、Pep-5)、通道蛋白(Pep-9)、蛋白激酶(Pep-3)、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Pep-4)等多種類型的DNA序列中假定蛋白(Pep-2、Pep-3、Pep-4、Pep-5、Pep-8)、核糖體蛋白(Pep-6)、硫氧還蛋白(Pep-2)、均存在甲基化修飾現(xiàn)象[9]。表3

2.4 甲基化類型

辣椒果實(shí)DNA經(jīng)HpaII/EcoRI(H)和MspI/EcoRI酶切后會生成四種不同的甲基化類型，這四種甲基化類型可以通過聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)而得到，這四種甲基化類型可以分為一下幾種情況：類型I(TypeI)、類型II(TypeII)、類型III(TypeIII)、在這三種情況下，類型I可以表示非甲基化，在H和M用到都有條帶的形成，而其余兩種分別可以表示單鏈甲基化和雙鏈甲基化，其條帶也分別可以在H和M用到上看到，而且III類型在M泳道上的條帶為對各時(shí)間點(diǎn)采集的有野的MSAP條帶統(tǒng)計(jì)。兩種辣椒果實(shí)綠熟期和紅熟期的基因組單鏈甲基化(TypeII)類型條帶數(shù)分別為880、885、904、916，雙鏈甲基化(TypeIII)類型條帶數(shù)分別為為155、164、168、184，而超甲基化類型(TypeIV)條帶數(shù)分別為64、74、28和24。總體甲基化比例公式為MSAP%=(TypeII+TypeIII+TypeIV)/(TypeI+TypeII+TypeIII+TypeIV)%[11]，在此基礎(chǔ)上，可以知道，兩種辣椒果實(shí)綠熟期和紅熟期基因組總體甲基化比例分別為36.51%、36.38%、35.57%和35.45%。兩種辣椒果實(shí)綠熟期和紅熟期，在擴(kuò)增的甲基化位點(diǎn)變化的過程中，基因組DNA的甲基化與果實(shí)發(fā)育時(shí)間呈反比，當(dāng)其時(shí)間越長，其總體的甲基化比例就會下降。表4

表4 辣椒果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期下DNA甲基化水平
Table 4 Effects of the DNA methylation levels in different stages of capsicum fruit development

甲基化類型Methylation type不同時(shí)間點(diǎn)采集的甲基化譜帶統(tǒng)計(jì)Methylation bands statistics in Different time points collected samples(%)GB14綠熟期GB38綠熟期GB14紅熟期GB38紅熟期類型1 Type I880885904916類型2 Type II155164168184類型3 Type III287268303295類型4 Type IV64742824

Note：TypeI：representsnon-methylated，typeII：representssingle-strands methylated，typeIII：represents double-strands methylated，TypeIV：represents super-methylated

3 討 論

基因的甲基化作為一種重要的表觀遺傳調(diào)控方式，在高等植物的基因組表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。辣椒是一種非模式植物，針對辣椒基本開展的各種與基因相關(guān)的研究還沒有取得突破性的進(jìn)展。在試驗(yàn)中，針對辣椒果實(shí)在著色成熟的過程中進(jìn)行了細(xì)致的研究，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在此過程中DNA甲基化修飾發(fā)生了巨大的變化。兩種辣椒果實(shí)在不同發(fā)育階段對比，GB14和GB38辣椒果實(shí)的綠熟期和紅熟期的總體甲基化水平依次分別是36.51%、36.38%、35.57%和35.45%，GB14的果實(shí)甲基化水平在紅熟期不斷降低。而在GB38的果實(shí)生長至成熟的過程中，CCGG位點(diǎn)的半甲基化迅速升至較高的水平，在64.5%處發(fā)生了停頓，與此同時(shí)全甲基化位點(diǎn)的百分比為13.21%。

有研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化不僅參與植物生長發(fā)育調(diào)控并在植物逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用[12]，而且在樹木年齡效應(yīng)中也具有重要的調(diào)控作用。任茂等[13]對棉花高溫脅迫誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)高溫能夠誘導(dǎo)棉花甲基化水平的提高，同時(shí)棉花耐熱性高低與DNA甲基化水平及狀態(tài)變化存在重要關(guān)系。李廷春等[14]對紫玉米生長發(fā)育過程MSAP分析結(jié)果顯示，紫玉米籽粒在授粉后，DNA半甲基化條帶和全甲基化條帶的百分比與玉米粒的生長發(fā)育呈正比例的關(guān)系，而且甲基化發(fā)生的區(qū)域并沒有明確的劃分。Bitonti等[15]針對桃子也開展了DNA甲基化對植物自身影響的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過對DNA中甲基化程度的干預(yù)，可以實(shí)現(xiàn)控制植物生長周期記憶果實(shí)成熟的目的。DNA甲基化水平對于植物的生長有重要的作用[16-17]。在實(shí)驗(yàn)中，GB14和GB38兩個(gè)不同品種的果實(shí)在不同發(fā)育階段DNA甲基化水平變化也不同，推測辣椒種群分化及物種進(jìn)化也與DNA甲基化水平有關(guān)。

MSAP體系中包括了對于基因的提取、酶切、連接等程序。較好的電泳圖譜是試驗(yàn)獲得成功的重要前提條件；而酶切反應(yīng)是該體系的關(guān)鍵操作，好的酶切反應(yīng)操作可以幫助科研人員獲得較為清晰的條帶及相關(guān)資料。酶切試驗(yàn)被給予了充分的反應(yīng)時(shí)間，酶連產(chǎn)物用量關(guān)系到預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度，會影響后續(xù)操作；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物不僅可以當(dāng)做選擇性擴(kuò)增的模板來使用，同時(shí)還可以對模板進(jìn)行純化，所以在進(jìn)行溶液稀釋的時(shí)候要謹(jǐn)慎小心，同時(shí)此操作對于整個(gè)實(shí)驗(yàn)也有至關(guān)重要的作用。

4 結(jié) 論

辣椒紅素低的GB14和辣椒紅素高的GB38的果實(shí)在不同發(fā)育階段對比，兩種辣椒果實(shí)的綠熟期和紅熟期的總體甲基化水平依次分別是36.51%、36.38%、35.57%和35.45%，對比兩個(gè)品種的辣椒生長過程，對甲基化中8個(gè)片段進(jìn)行研究，DNA的甲基化的發(fā)生不受編碼區(qū)和非編碼區(qū)的限制，在這兩種區(qū)域中都有可能發(fā)生。