李桂榮,連艷會(huì),程珊珊,辛董董,牛生洋,扈惠靈
(河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)
【研究意義】葡萄(Vitis vinifera L.)屬于葡萄 科,為落葉藤本植物,是世界最古老的植物之一。隨著人們生活水平的提高,葡萄越來越受廣大人民喜愛,在全球,葡萄生產(chǎn)和葡萄栽培面積越來越廣。然而,我國北方地區(qū)氣候差異大,低溫是限制我國北方葡萄分布與生長的重要因素,對葡萄越冬栽培生產(chǎn)造成一定的損失,最終,葡萄產(chǎn)量下降,品質(zhì)不佳。為了能夠滿足不同區(qū)域適宜栽培的葡萄品種,提高葡萄品質(zhì),近年來,在葡萄抗寒性方面做了大量的研究?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】盧精林等[1]認(rèn)為抗寒性的砧木品種電導(dǎo)率,POD,CAT,SOD,可溶糖含量和丙二醛,與抗寒性關(guān)系密切,可作為抗寒性的鑒定指標(biāo)。鐘海霞等[2]研究不同葡萄品種根系抗寒力的強(qiáng)弱比較,認(rèn)為電導(dǎo)率,可溶性糖,可溶性蛋白,游離脯氨酸和丙二醛等生理指標(biāo)可以作為抗寒性鑒定指標(biāo)?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)以山葡萄,貝達(dá)和北醇為對照,3個(gè)無核葡萄品種(粉紅無核、優(yōu)無核、京早晶)為試材,測定相對電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA)和游離脯氨酸的含量,分析不同葡萄品種抗寒力大小,并通過灰色關(guān)聯(lián),研究不同抗寒指標(biāo)與抗寒性的關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問題】為北方冬季低溫地區(qū)葡萄引種、雜交育種、種質(zhì)篩選以及抗寒新品種栽培提供科學(xué)理論依據(jù)。
通過不同品種的生物學(xué)性狀比較,于中國農(nóng)科院鄭州果樹研究所種質(zhì)資源圃中選出6種葡萄品種材料進(jìn)行試驗(yàn)研究,分別為:山葡萄、貝達(dá)、北醇、京早晶、優(yōu)無核和粉紅無核。以一年生休眠枝條為試驗(yàn)材料,粗0.5~1 cm,長20~50 cm長勢較好的健壯、無病蟲害的枝條進(jìn)行標(biāo)記沙藏,材料處理前取出并放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
將材料先用自來水沖洗3次,再用去離子水沖洗3次,放在濾紙上吸干水分,材料按不同品種均勻分成7份,用保鮮膜包好,并用吊牌進(jìn)行標(biāo)記,分別在7個(gè)溫度(4、-5、-10、-15、-20、-25、-30℃)下進(jìn)行低溫處理,以4℃/h的速度降到處理溫度并保持24 h,再以4℃/h的速度解凍,每0.5 h回升1個(gè)梯度,最終置于4℃冰箱中備用,測定其相關(guān)生理指標(biāo)。
采用電導(dǎo)率儀(DDSJ-308A)進(jìn)行電導(dǎo)率的測定[3],氮藍(lán)四唑法(NBT)進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定[4],愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行過氧化物酶(POD)活性的測定[4],紫外吸收法進(jìn)行過氧化氫酶(CAT)測定活性測定[4],考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行可溶性蛋白含量的測定[5],蒽酮法進(jìn)行可溶性糖含量測定[5],硫代巴比妥酸法(TBA)進(jìn)行丙二醛(MDA)含量測定[6],茚三酮比色法進(jìn)行游離脯氨酸含量的測定[6]。
用Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和DPS軟件(15.10)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
從圖1可以看出,各材料總體趨勢逐漸升高,呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律,-15~-25℃下,粉紅無核、優(yōu)無核和京早晶出現(xiàn)躍升,山葡萄、貝達(dá)和北醇變化趨勢不明顯,當(dāng)溫度達(dá)到-25℃時(shí),粉紅無核上升至61.29%,優(yōu)無核由上升至71.31%,京早晶上升至72.21%,山葡萄上升至 40.55%,貝達(dá)上升至42.36%,北醇上升至44.07%。京早晶、優(yōu)無核和粉紅無核在初遇低溫時(shí)電解質(zhì)滲出率稍有上升,有可能是枝條內(nèi)部細(xì)胞的自我保護(hù)作用,隨著處理溫度的降低,在-25℃時(shí)電導(dǎo)率急劇上升,說明枝條內(nèi)部細(xì)胞已經(jīng)受到明顯的傷害,膜透性喪失功能。山葡萄、貝達(dá)和北醇變化趨勢仍不明顯。由試驗(yàn)結(jié)果看出,隨處理溫度的降低,原生質(zhì)膜透性逐漸增大,當(dāng)電解質(zhì)滲出率達(dá)到100%時(shí),質(zhì)膜完全破壞[7]。
由表1可以看出,方程的相關(guān)回歸系數(shù)在0.7544~0.8617,經(jīng)檢驗(yàn)表明,Logistic方程擬合度R2顯著,半致死溫度在-10.39~ -37.83℃。其中山葡萄、貝達(dá)和北醇抗寒性較強(qiáng),山葡萄的半致死溫度為-37.83℃,貝達(dá)的半致死溫度為-36.01℃,北醇的半致死溫度為-31.88℃,可知山葡萄抗寒性最強(qiáng),細(xì)胞傷害率最低,抵御低于外界低溫能力強(qiáng),其次是貝達(dá)和北醇。而優(yōu)無核和粉紅無核抗寒性較低,優(yōu)無核半致死溫度為-14.13℃,粉紅無核半致死溫度為-14.89℃,可知粉紅無核和優(yōu)無核的細(xì)胞傷害率較大,抵御外界低溫能力較低??购宰钊醯臑榫┰缇?,半致死溫度為-10.39℃,細(xì)胞傷害率最大,抵御外界能力最低。所得半致死溫度與電解質(zhì)滲出率結(jié)論一致。由Logistic方程計(jì)算出的半致死溫度可以看出抗寒性大小:山葡萄>貝達(dá)>北醇>粉紅無核>優(yōu)無核>京早晶。
圖1 低溫脅迫下葡萄枝條的電解質(zhì)滲出率Fig.1 Electrolyte leakage of grape branch under low temperature
表1 低溫脅迫下不同葡萄枝條半致死溫度Table 1 Half lethal temperature of grape branch under low temperature
由表2可知,3種無核葡萄品種(京早晶、優(yōu)無核、粉紅無核)酶活性隨溫度的下降,整體為先上升后下降。其中,京早晶SOD酶活性在-20℃時(shí)有明顯的升高,其酶活性從4℃(52.38±4.60)U/g上升到 -20℃的(112.07±3.73)U/g,-20 ℃后,繼續(xù)上升,在 -25℃時(shí)達(dá)到最大值(137.52±5.01)U/g,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-25℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P<0.05且P<0.01,這說明在-25℃時(shí)酶抵御低溫的能力達(dá)到最大,之后酶活性喪失;POD酶活性和CAT酶活性在-20℃下,POD酶活性達(dá)到最大值(11.33±0.13)U/g·min,由(3.26 ±0.17)U/g·min 上升到(11.33 ±0.13)U/g·min,CAT 酶活性達(dá)到最大值(34.13 ±3.95)U/g·min,由(10.39 ±1.94)U/g·min 上升到(34.13 ±3.95)U/g·min,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-20℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P <0.05且 P <0.01。
優(yōu)無核SOD酶活性在-20℃時(shí)有明顯的升高,其酶活性從4℃(55.76±3.60)U/g上升到-20℃(170.98±3.46)U/g,-20 ℃后,繼續(xù)上升,在 -25 ℃時(shí)達(dá)到最大值(195.08±2.93)U/g,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-25℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P<0.05且 P<0.01,這說明在-25℃時(shí)酶抵御低溫的能力達(dá)到最大,之后酶活性喪失;POD酶活性和CAT酶活性在-20℃下,POD 酶活性達(dá)到最大值(12.43±0.13)U/g·min,由(4.27±0.03)U/g·min 上升到(12.43 ±0.13)U/g·min,CAT 酶活性達(dá)到最大值(37.14 ±3.72)U/g·min,由(14.53 ±2.89)U/g·min 上升到(37.14±3.72)U/g·min,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-20℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P <0.05 且 P <0.01。
粉紅無核的SOD酶活性在-20℃時(shí)有明顯的升高,其酶活性從4℃(21.41±2.02)U/g上升到-20 ℃的(195.76±3.56)U/g,-20 ℃后,繼續(xù)上升,在-25 ℃時(shí)達(dá)到最大值(219.84±5.91)U/g,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-25℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P<0.05且 P<0.01,這說明在-25℃時(shí)酶抵御低溫的能力達(dá)到最大,之后酶活性喪失;POD酶活性和CAT酶活性在-20℃下,POD酶活性達(dá)到最大值(13.14±0.14)U/g·min,由(5.14 ±0.20)U/g·min 上升到(13.14 ±0.14)U/g·min,CAT酶活性達(dá)到最大值(38.04±2.33)U/g·min,由(8.15 ±1.16)U/g·min 上升到(38.04 ±2.33)U/g·min,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-20℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P <0.05且P <0.01。
3種對照葡萄品種(山葡萄、貝達(dá)、北醇)酶活性隨溫度的降低總體趨勢為先上升后下降。其中,山葡萄的SOD酶活性在-20℃時(shí)有明顯的升高,其酶活性從4℃(120.32±1.6)U/g上升到-20℃的(268.77±3.33)U/g,-20 ℃后,繼續(xù)上升,在 -25℃時(shí)達(dá)到最大值(310.05±1.96)U/g,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-25℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P<0.05且 P<0.01,這說明在-25℃時(shí)酶抵御低溫的能力達(dá)到最大,之后酶活性喪失;POD酶活性和CAT酶活性在-20℃下,POD酶活性達(dá)到最大值(16.13 ±0.15)U/g·min,由(7.83 ±0.37)U/g·min上升到(16.13 ±0.15)U/g·min,CAT 酶活性達(dá)到最大值(55.32 ±3.53)U/g·min,由(25.93 ±1.93)U/g·min 上升到(55.32±3.53)U/g·min,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-20℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P <0.05 且 P <0.01。
貝達(dá)的SOD酶活性在-20℃時(shí)有明顯的升高,其酶活性從4℃(115.77±2.6)U/g上升到 -20℃的(164.83 ±3.8)U/g,-20 ℃后,繼續(xù)上升,在-25 ℃時(shí)達(dá)到最大值(270.32 ±3.7)U/g,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-25℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P<0.05且 P<0.01,這說明在-25℃時(shí)酶抵御低溫的能力達(dá)到最大,之后酶活性喪失;POD酶活性和CAT酶活性在-20℃下,POD 酶活性達(dá)到最大值(14.56±0.11)U/g·min,由(6.38±0.11)U/g·min 上升到(14.56 ±0.11)U/g·min,CAT 酶活性達(dá)到最大值(47.35 ±3.1)U/g·min,由(26.14 ±3.6)U/g·min 上升到(47.35 ±3.1)U/g·min,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-20℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P<0.05 且 P <0.01。
北醇的SOD酶活性在-20℃時(shí)有明顯的升高,其酶活性從4℃(114.08±2.01)U/g上升到-20℃的(230.53±10.26)U/g,-20 ℃后,繼續(xù)上升,在 -25 ℃時(shí)達(dá)到最大值(264.19±3.37)U/g,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-25℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P<0.05且P<0.01,這說明在-25℃時(shí)酶抵御低溫的能力達(dá)到最大,之后酶活性喪失;POD酶活性和CAT酶活性在-20℃下,POD酶活性達(dá)到最大值(13.79±0.05)U/g·min,由(5.98±0.12)U/g·min上升到(13.79±0.05)U/g·min,CAT酶活性達(dá)到最大值(44.39±2.86)U/g·min,由(22.31±1.61)U/g·min上升到(44.39±2.86)U/g·min,之后隨著處理溫度的降低其酶活性開始下降,-20℃時(shí)與其他溫度相比差異顯著,P<0.05且P<0.01。
由此可知,不同葡萄品種的酶活性總體趨勢呈S型曲線上升。SOD在-25℃時(shí)達(dá)到最大值,增加幅度最大,在4~-25℃時(shí)細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生了自我保護(hù)功能,這種保護(hù)能力逐漸上升,超過-25℃時(shí),這種保護(hù)能力下降,而POD和CAT在-20℃下達(dá)到最大值,增加幅度最大,超過-20℃時(shí),細(xì)胞膜造成了嚴(yán)重傷害,膜系統(tǒng)受到破壞。不同酶保護(hù)系統(tǒng)性能的增強(qiáng),可提高組織的抗寒性[8]??傻贸龉┰嚻贩N的抗寒性順序?yàn)?山葡萄>貝達(dá)>北醇>粉紅無核>優(yōu)無核>京早晶。
表2 低溫脅迫下葡萄枝條的酶活性Table 2 Antioxidant enzyme activities of grape branch under low temperature
續(xù)表2 Continued table 2
由表3可知,隨著脅迫溫度的下降,不同葡萄品種可溶性蛋白含量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在不同溫度下,抗寒性較強(qiáng)的葡萄品種可溶性蛋白含量增幅明顯高于抗寒性弱的葡萄品種。其中,當(dāng)溫度降到-25℃時(shí),對照品種(山葡萄、貝達(dá)、北醇)可溶性蛋白含量逐漸上升,山葡萄從4℃的(0.25±0.03)mg/g上升到(0.81±0.04)mg/g,達(dá)到-30℃(0.84±0.04)mg/g時(shí)差異顯著,P<0.05且 P<0.01,貝達(dá)從4℃的(0.23±0.01)mg/g上升到(0.80±0.03)mg/g,達(dá)到 -30 ℃(0.81±0.03)時(shí)差異顯著,P<0.05且 P<0.01,北醇從4℃的(0.23±0.06)mg/g上升到(0.71±0.02)mg/g,達(dá)到-30℃(0.72±0.02)mg/g時(shí)差異顯著,P<0.05且P<0.01;無核葡萄品種(粉紅無核、優(yōu)無核、京早晶)-15~-25℃時(shí)可溶性蛋白含量緩慢上升,達(dá)到-30℃時(shí)差異顯著,粉紅無核(0.48±0.052)mg/g、優(yōu)無核(0.45 ±0.01)mg/g、京早晶(0.44±0.02)mg/g,P<0.05且 P<0.01。由此可見,總體上山葡萄增幅最大,可溶性蛋白變化明顯,抗寒性最強(qiáng),其次,京早晶增幅最小,可溶性蛋白含量變化不明顯,抗寒性最弱。
隨著脅迫溫度的下降,不同葡萄品種可溶性糖含量出現(xiàn)逐漸上升的趨勢,可溶性糖含量越高,積累糖分越大,提高細(xì)胞內(nèi)的滲透勢,保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)不受破壞,抗寒性越強(qiáng)。其中,當(dāng)溫度降到-25℃時(shí),對照品種(山葡萄、貝達(dá)、北醇)可溶性糖含量逐漸上升,-30℃時(shí)差異顯著,山葡萄(7.32±0.18)%、貝達(dá)(6.96±0.23)%、北醇(6.68±0.12)%,P<0.05且 P<0.01,無核葡萄品種(粉紅無核、優(yōu)無核、京早晶)達(dá)到-30℃時(shí)差異顯著,粉紅無核(4.76±0.20)%、優(yōu)無核(4.84±0.13)%、京早晶(5.78±0.30)%,P<0.05且P<0.01。
隨著脅迫溫度的下降,不同葡萄品種MDA含量出現(xiàn)逐漸上升的趨勢。MDA對質(zhì)膜產(chǎn)生毒害作用,主要破壞細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜系統(tǒng),當(dāng)枝條受低溫傷害時(shí),含量增加,達(dá)到一定程度植株死亡[8],而山葡萄、貝達(dá)和北醇的MDA含量在低溫脅迫過程中明顯低于其他品種,可知,山葡萄、貝達(dá)和北醇抗寒性優(yōu)于其它品種。其中,當(dāng)溫度降到-30℃時(shí)差異顯著,山葡萄(0.38±0.01)μmol/g、貝達(dá)(0.39±0.02)μmol/g、北醇(0.42 ±0.01)μmol/g,P <0.05且 P <0.01,粉紅無核(0.76±0.02)μmol/g、優(yōu)無核(0.72±0.01)μmol/g、京早晶(0.68±0.01)μmol/g,P <0.05且P <0.01。
表3 低溫脅迫下葡萄枝條的生理指標(biāo)Table 3 Physiological indexes of grape branches under low temperature
表4 山葡萄生理生化指標(biāo)與抗寒性的灰色關(guān)聯(lián)分析Table 4 Grey correlation analysis of physiological and biochemical indexes and cold resistance
表5 京早晶生理生化指標(biāo)與抗寒性的灰色關(guān)聯(lián)分析Table 5 Grey correlation analysis of physiological and biochemical indexes and cold resistance
隨著脅迫溫度的下降,不同葡萄品種游離脯氨酸含量出現(xiàn)逐漸上升的趨勢,由于細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸大量積累,此時(shí),葡萄枝條通過滲透勢的降低來維持細(xì)胞膜內(nèi)結(jié)構(gòu)的完整??购暂^強(qiáng)的山葡萄和貝達(dá)在-25℃時(shí),游離脯氨酸的含量達(dá)到最高,分別為(63.28±0.29)和(59.28±0.32)μg/g,P <0.05且P<0.01。而抗寒性較差的優(yōu)無核和京早晶分別在-10和-15℃達(dá)到最高,分別為(39.52±0.01)和(43.31±0.05)μg/g,P<0.05且P <0.01。
為了研究葡萄枝條不同抗寒指標(biāo)和抗寒性關(guān)聯(lián)程度,做灰色關(guān)聯(lián)分析。按灰色系統(tǒng)理論要求,將不同品種的抗寒指標(biāo)的平均值和不同處理溫度視為一個(gè)整體,即灰色系統(tǒng),進(jìn)行分析。
對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理之后,由表4可見,和山葡萄的抗寒性關(guān)聯(lián)最大的抗寒指標(biāo)是CAT(0.72),其次是POD(0.70)和MDA(0.70),其他指標(biāo)均在0.60以上,并且和山葡萄關(guān)聯(lián)最高的溫度是-25℃(0.71)。由表5可見,和京早晶抗寒性關(guān)聯(lián)最大的抗寒指標(biāo)是POD(0.68)和CAT(0.68),其次是SOD(0.66)、MDA(0.66),并且和京早晶關(guān)聯(lián)最高的溫度是-10℃。
綜上可知,和所研究葡萄品種關(guān)聯(lián)度最高的抗寒指標(biāo)是CAT,其次是POD和MDA。
抗寒性是不同植物對低溫寒冷環(huán)境下長期適應(yīng)中通過本身的遺傳變異和自然選擇獲得的一種抗寒能力,是果樹的一個(gè)重要性狀。有不少學(xué)者在果樹抗寒性方面做了大量的研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在電導(dǎo)率測定中,隨著處理溫度的降低,電導(dǎo)率整體呈逐漸升高的趨勢,這與駱建霞研究的用電導(dǎo)法對8種地被植物抗寒性的測定結(jié)果一致[9]。在酶的測定中,隨著處理溫度的下降,酶活呈現(xiàn)先上升后下降,這與曹建東[10],魯金星[11],曲凌慧[12]的研究一致。在可溶性糖含量的測定中,6個(gè)葡萄品種隨著處理溫度的降低,可溶性糖含量總體變化趨勢逐漸上升,這與孟艷瓊[13]和王小媚[14]研究結(jié)論一致。在丙二醛含量的測定中,隨著處理溫度的降低,丙二醛含量逐漸升高,這與段肖翠[15]究的低溫脅迫對阿月渾子抗寒生理指標(biāo)中在不同溫度處理下,丙二醛含量的變化一致。在可溶性蛋白的測定中,其含量隨著處理溫度的降低而升高,抗寒性強(qiáng)的品種上升幅度快,這與牛錦鳳等[16]的研究結(jié)論相一致。在游離脯氨酸的測定中,其含量也隨著處理溫度的降低而呈現(xiàn)出升高趨勢,這與沈洪波[17]的研究結(jié)論一致。綜上所述,相對電導(dǎo)率、SOD酶活性、POD酶活性、CAT酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛和游離脯氨酸含量可以作為測定植物抗寒性的指標(biāo)。
本試驗(yàn)是在人工模擬低溫的條件下進(jìn)行的,人工低溫處理和室外自然條件有一定的差異,僅在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行測量具有一定的局限性,在今后的研究中我們將在室外低溫的條件下進(jìn)行抗寒鑒定,從而更加準(zhǔn)確全面地反應(yīng)抗寒性。
由測得的電導(dǎo)率并結(jié)合Logistic方程求得不同葡萄品種半致死溫度分別為:山葡萄-37.83℃,貝達(dá)-36.01℃,北醇 -31.88℃,粉紅無核 -14.89℃,優(yōu)無核-14.12℃,京早晶-10.39℃。除了對照品種。其余品種的致死溫度均在-10~-15℃之間。
通過酶活性的測定,酶活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。通過理化指標(biāo)的測定與分析,隨著處理溫度的下降,各指標(biāo)含量均呈現(xiàn)上升趨勢,并且抗寒性強(qiáng)的品種上升的幅度比抗寒性弱的品種上升的幅度大。其中,對抗寒指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析,得出與所研究葡萄品種關(guān)聯(lián)度最高的抗寒指標(biāo)是CAT,其次是POD和MDA。綜合結(jié)果分析,不同葡萄品種抗寒性強(qiáng)弱依次為:山葡萄>貝達(dá)>北醇>粉紅無核>優(yōu)無核>京早晶。