響應面法優(yōu)化薏米中結合型多酚的提取工藝

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(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122; 2.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210023)

薏米(Coixlacryma-jobi),屬于禾本科薏米屬草本植物,主要分布在亞洲熱帶太平洋島嶼附近,中國、印度、越南、緬甸、巴西、日本等許多國家都有種植[1]。薏米是一種藥食兩相宜的農(nóng)作物,作為藥,薏米可入脾肺,有利于清熱排膿。作為食品,薏米營養(yǎng)豐富,薏米中含有豐富的膳食纖維、維生素、脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)及礦物質(zhì);其中含油脂類占7.2%。薏米中含有8種人體必需氨基酸,薏米仁中支鏈氨基酸含量為17.5%,抗氧化作用的氨基酸占10.8%[2]。并且氨基酸的比例與人體需要的比例十分接近,比其他全谷物食品更易被人體吸收,薏米也被譽為“世界禾本科植物之王”。

薏米可以分為薏米殼、薏米麩皮、薏米仁。薏米殼中含有豐富的膳食纖維及α-生育酚[3],Kuo等[4]鑒定出薏米殼中含有丁香酸、木酚素、4-酮松脂酚、松柏醇、阿魏酸、丁香脂素6種抗氧化物質(zhì),除此以外,還含有圣草素、神經(jīng)酰胺、對-香豆素[5]。薏米麩皮中含有內(nèi)酰胺類化合物、黃烷酮類化合物、黃酮類化合物、多酚類化合物、木質(zhì)素等[1,6-7],其對癌細胞具有很強的抗增殖作用并且具有免疫反應的調(diào)制作用[8]。阿魏酸是薏米麩皮中的主要酚類化合物,并且該物質(zhì)可以抑制結腸腫瘤的癌變以及阻止心肌抑制因子(MDF)的形成[9]。

薏米仁中含有豐富的脂肪酸、多酚類、甾醇類化合物等物質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)薏米經(jīng)脫脂后的丙酮提取物具有明顯的抗腫瘤、抗氧化、降血脂的作用[10]。有學者另將薏米中游離型多酚經(jīng)過葡聚糖LH-20凝膠及半制備液相分離純化后,得到四種薏米多酚純化物,分別為N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺、阿魏酸、蘆丁和對香豆酸,后證實其具有很強的抗氧化活性[11]和抗腫瘤活性[12]。但是,薏米中另一類多酚,結合型多酚的活性物質(zhì)的研究很少,而且與游離型多酚相比，提取方法較為復雜,導致其在谷物中的作用經(jīng)常被忽視,之前有研究表明橙皮中結合型多酚比游離態(tài)多酚的抗氧化能力更好。

因此,本實驗在前期研究的基礎上，采用有機溶劑結合NaOH消化法提取薏米中的結合型多酚,有機溶劑可以使多酚與蛋白質(zhì)或多糖之間形成的氫鍵斷裂,NaOH的加入可有效的破壞細胞壁,使結合型多酚更利于提取。通過福林-酚比色法,在不同條件下測定所提薏米結合型多酚的含量,并運用Box-Behnken的中心組合實驗分析薏米結合型多酚的最優(yōu)提取條件,為后續(xù)對薏米中結合型多酚的相關性質(zhì)及功能的進一步研究提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薏米 品種為貴州小薏米,貴州黔西南農(nóng)貿(mào)市場;石油醚、福林酚、碳酸鈉(Na2CO3) 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;沒食子酸 色譜純,美國Sigma公司。

FW100型高速粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;TP-214型電子分析天平 丹佛儀器北京有限公司;THZ-D型臺式恒溫振蕩器 江蘇太倉市強樂實驗設備有限公司;pHS-3C型型精密數(shù)顯pH計 上海精密科學儀器廠;Beckman Coulter J6型高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;SpectraMax M2型酶標儀 美國Molecular Devices公司;ALpHA2-4型真空冷凍干燥機 德國Christ公司;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮化學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 薏米結合型多酚的提取工藝 根據(jù)文獻[10-12]方法稍作修改,薏米經(jīng)高速粉碎機得到薏米粉末,過60目篩,混入石油醚震蕩脫脂,反復3次,烘干,保存于-20 ℃冰箱。脫脂薏米粉末先使用丙酮萃取出游離多酚,剩余薏米殘渣采用NaOH消化法。首先將殘渣與NaOH溶液混勻,震蕩進行消化處理,加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為2,加入乙酸乙酯以一定溫度浸提20 min后，于冷凍離心機3500 r/min離心10 min，所得上清液即結合型多酚,重復5次,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干,溶于去離子水,并置于冷凍干燥機凍干至粉末狀,保存于-20 ℃,即薏米結合型多酚粗品。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 NaOH消化濃度對結合型多酚提取的影響 取10 g薏米殘渣,用20 mL 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mol/L不同濃度NaOH溶液20 mL消化處理后,于室溫下震蕩消化4 h,按料液比1∶3 (m/v)加入乙酸乙酯在30 ℃下浸提20 min后,于冷凍離心機3500 r/min離心10 min,得上清液,重復5次,最后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去有機溶劑,溶于去離子水,冷凍干燥至白色粉末,研究NaOH消化濃度對薏米結合型多酚提取的影響。

1.2.2.2 消化時間對結合型多酚提取的影響 取10 g薏米殘渣,用20 mL 2.5 mol/L NaOH溶液消化后,震蕩消化2、3、4、5、6 h,按料液比1∶3 (m/v)加入乙酸乙酯在30 ℃下浸提20 min后,于冷凍離心機3500 r/min離心10 min,得上清液,重復5次,最后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去有機溶劑,溶于去離子水,冷凍干燥至白色粉末,研究堿消化時間對薏米結合型多酚提取的影響。

1.2.2.3 乙酸乙酯浸提溫度結合型多酚提取的影響 取10 g薏米殘渣,用20 mL 2.5 mol/L NaOH溶液消化后,于室溫下震蕩4 h,按料液比1∶3 (m/v)加入乙酸乙酯在20、30、40、50、60 ℃下浸提20 min后,于冷凍離心機3500 r/min離心10 min,得上清液,重復5次,最后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀脫去有機溶劑,溶于去離子水,冷凍干燥至白色粉末,研究乙酸乙酯浸提時間對薏米結合型多酚提取的影響。

1.2.3 Box-Behnken中心組合試驗設計 以單因素實驗為參考,采用Box-Behnken的中心組合試驗設計原理,選取NaOH消化濃度、消化時間以及乙酸乙酯浸提溫度3個因素,分別以A、B、C為代表,每一個自變量的低中高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼,采用3因素3水平的實驗設計,優(yōu)化薏米中結合多酚的提取工藝。響應面設計試驗因素及水平見表1[13-15]。

表1 響應面實驗因素與水平表Table 1 Variables and levels of response surface design

1.2.4 薏米結合型多酚含量的測定 薏米結合型多酚總酚含量測定選用Singleton所描述的福林-酚比色法[16],并根據(jù)文獻[17]方法進行改動。具體步驟如下:經(jīng)葡聚糖凝膠分離后的所有組分凍干成粉末后,取一定量溶于去離子水中，以0.0～600.0 μg/mL濃度的沒食子酸為標準溶液并以此作標準曲線,多酚混合物與Folin-Ciocalteu試劑反應后，加入碳酸鈉終止該反應，并在室溫下靜置90 min后，于760 nm吸光度下用酶標儀進行測定,總酚提取得率公式為:

式中，C:總酚濃度(μg沒食子酸/mL);V:測量液體積(mL);N為稀釋倍數(shù);W為原料重量(100 g)。提取得率表示為每100 g薏米粉末mg沒食子酸等量。每個樣品至少重復3次實驗,取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗重復3次,結果采用平均值±標準差形式表示,單因素實驗采用SPSS version 17.0和Excel進行數(shù)據(jù)處理。響應面試驗采用Design Expert 8.0.6進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 NaOH消化濃度對薏米結合型多酚提取得率的影響 由圖1可知,在該條件下,薏米結合型多酚的提取得率隨著NaOH消化濃度的升高而增大,當NaOH濃度增大到2.5 mol/L時,提取得率最大,并且當濃度大于2.5 mol/L后,其提取得率基本穩(wěn)定在24～25 mg/100 g左右,在NaOH濃度為2.5 mol/L時,薏米中的結合型多酚釋放的較為完全。并且考慮到之后所用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH時的用量,適宜選取的NaOH濃度在2.5 mol/L,提取得率為(24.95±0.78) mgGAE/100 g。

圖1 消化濃度對薏米結合型多酚提取得率的影響Fig.1 Effect of degrading concentrations on extraction rate of bond polyphenols in adlay

2.1.2 NaOH消化時間對薏米結合型多酚提取得率的影響 由圖2可知,在該條件下,薏米結合型多酚的提取得率隨著NaOH消化時間的延長而增大,于4 h時達到最高值,當消化時間不足4 h時,薏米結合型多酚提取得率的增長趨勢較大,而當消化時間超過4 h,提取得率基本保持穩(wěn)定,甚至有略微下降,但趨勢并不明顯。這可能是由于NaOH處理過程中,在4 h左右細胞壁才能破碎完全,結合型多酚的提取得率也在此時達到最大。消化時間4 h時薏米結合型多酚提取為(24.95±0.78) mgGAE/100 g。

圖2 消化時間對薏米結合型多酚提取得率的影響Fig.2 Effect of degrading time on extraction rate of bond polyphenols in adlay

2.1.3 浸提溫度對薏米結合型多酚提取得率的影響 由圖3可知,選取乙酸乙酯提取薏米結合型多酚時,浸提溫度對提取得率的影響較大。當浸提溫度為50 ℃時,提取得率為最高,為(29.28±1.65) mgGAE/100 g。當浸提溫度小于50 ℃時,提取得率隨著浸提溫度的升高而上升,當浸提溫度為60 ℃時,提取得率下降,這是因為隨著溫度的上升,薏米結合型多酚溶解度增加,但溫度過高時,薏米結合型多酚易被破壞[18]。因此,響應面設計實驗中薏米結合多酚浸提溫度不易超過60 ℃。

圖3 浸提溫度對薏米結合型多酚提取得率的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on extraction rate of bond polyphenols in adlay

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗結果 在單因素實驗的基礎上,利用Box-Behnken模型,采用NaOH消化濃度、消化時間、乙酸乙酯浸提溫度進行3因素3水平響應面優(yōu)化實驗,分析提取薏米中結合型多酚的最佳工藝條件。得到的試驗設計結果見表2。

表2 響應面優(yōu)化試驗設計及試驗結果Table 2 Experimental design and results of optimizing test with response surface method

Y=27.67+2.09A+1.38B+2.57C+0.18AB-0.72AC+0.080BC-2.21A2-2.36B2-1.76C2

對該模型的方差分析見表3,方程決定系數(shù)為0.9814,說明實測值與預測值之間相關性較高,模型對實驗有較好的擬合性;同時模型p<0.05,顯著,失擬項p值為0.9790>0.05,不顯著,表明所建立的二次回歸模型能有效的對響應值進行預測。方程一次項A、B、C對Y值的影響顯著(p<0.05),交互作用對Y值影響不顯著,二次項A2、B2、C2對Y值的影響顯著(p<0.05)。由3個獨立變量的F值可知,C>A>B,即對薏米結合多酚提取得率影響因素的主次順序為乙酸乙酯浸提溫度>NaOH消化濃度>NaOH消化時間。

表3 提取得率回歸分析結果Table 3 Regression analysis results of extracting rate

2.2.3 響應面圖分析 圖4為由回歸方程所作的等高線及相應曲面。該圖直觀顯示了當NaOH消化濃度、消化時間及乙酸乙酯浸提溫度3個因素兩兩交互作用對薏米結合型多酚提取得率的影響。根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應面和等高線結果見圖4。在響應面圖中,曲面越陡峭,等高線越密集,則兩因素的交互作用對響應值的影響越顯著,其曲線越接近中心,則對應的響應值也就越大[19]。從圖4可以看出,NaOH消化濃度(A)與消化時間(B)、NaOH消化濃度(A)與乙酸乙酯浸提溫度(C)以及消化時間(B)與乙酸乙酯浸提溫度(C)3組交互作用的等高線分化不密集,接近圓形,因此,交互作用AB、AC、BC對薏米結合型多酚提取得率無顯著影響。

圖4 兩因素交互作用對總酚提取得率影響的響應曲面圖(左)及等高線圖(右)Fig.4 Response surface(left)and counter(right)plots of two variables on extraction rate of total polyphenols

2.2.5 驗證實驗 根據(jù)所建立的模型通過軟件進行最優(yōu)分析,在條件為:NaOH濃度為3.26 mol/L,消化時間為4.63 h,溫度為53.18 ℃時可得到薏米結合型多酚最高提取得率,為29.3237 mgGAE/100。為了實際操作方便,將上述條件簡化為NaOH濃度為3.26 mol/L,消化時間為4.6 h,溫度為53 ℃,實測薏米結合型多酚提取得率為(30.16±1.08) mgGAE/100 g,誤差率為2.83%,因此確定上述模型可靠具有參考性。

3 結論

提取薏米結合型多酚的最優(yōu)條件為NaOH濃度為3.26 mol/L,消化時間為4.6 h,溫度為53 ℃。此條件下得到模型中結合型多酚的提取得率預測值為29.3237 mgGAE/10,實測結果為(30.16±1.08) mgGAE/100 g,說明該方法得到的薏米結合型多酚提取條件真實可靠,并具有較高的提取得率。因此,利用NaOH消化結合乙酸乙酯浸提是一種有效提取薏米中結合多酚的方法,對植物多酚的開發(fā)與利用具有一定的指導意義。