山東省甘薯病毒復合侵染的分子鑒定

姜珊珊 張眉 吳斌 王升吉 杜振翠 辛相啟

摘要：為明確山東省甘薯病毒種類及發(fā)生現(xiàn)狀，本研究對7個甘薯種植區(qū)進行調查及樣品采集，通過RT-PCR/PCR技術分析山東省甘薯病毒種類及侵染類型。結果顯示，140份甘薯樣品中感染甘薯病毒的樣品有133份，共檢出7種甘薯病毒，其中甘薯褪綠矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus， SPCSV）檢出率最高；由多種病毒復合侵染的甘薯樣品占77%，單個甘薯樣品中最多檢出6種病毒，復合侵染組合共33種。表明山東甘薯病毒復合侵染情況嚴重，是威脅甘薯生產發(fā)展的重要因素。

關鍵詞：甘薯病毒；復合侵染；分子鑒定

中圖分類號：S435.313 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）09-0097-05

Abstract In order to determine the types and occurrence status of sweet potato viruses in Shandong Province， we investigated the occurrence of virus diseases in 7 sweet potato growing areas and collected the disease samples. The virus species and infection types were identified by RT-PCR or PCR technology. The results showed that there were 133 samples were infected by viruses in the 140 samples，and 7 virus species had been detected. Among them， the detection rate of sweet potato chlorotic stunt virus（SPCSV） was the highest. A total of 77% sweet potato samples were infected by multiple viruses with a total of 33 types of infection combinations， and up to 6 viruses were detected in a single sweet potato sample. In conclusion， the mixed infection of sweet potato viruses was serious in Shandong Province， which was an important factor threatening the development of sweet potato production.

Keywords Sweet potato virus； Mixed infection； Molecular identification

甘薯是集糧食、飼料、工業(yè)能源原料于一體的多用途作物，在世界范圍廣泛種植，我國是主要的甘薯生產國之一[1]。病毒病是威脅甘薯生產的重要病害，是導致甘薯產量降低和種性退化的重要因素，可對甘薯產量造成20%～ 40%的損失，嚴重限制了甘薯產業(yè)的發(fā)展[2]。全世界已報道的侵染甘薯的病毒有30多種，在我國至少存在15種[3-5]。馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）病毒是危害甘薯的主要病毒種類，包括甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet potato feathery mottle virus， SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G， SPVG）、甘薯潛隱病毒（Sweet potato latent virus， SPLV）、甘薯病毒2（Sweet potato virus 2， SPV2）等[6]。近年來，毛形病毒屬（Crinivirus）的甘薯褪綠矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus， SPCSV）已在我國甘薯種植區(qū)廣泛分布，與SPFMV協(xié)同侵染導致的甘薯病毒病害（sweet potato virus disease， SPVD）能夠造成70%～100%的產量損失[6，7]。除此之外，香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）的甘薯褪綠斑病毒（Sweet potato chlorotic fleck virus， SPCFV）、菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）的甘薯曲葉病毒（Sweet potato leaf curl virus， SPLCV）以及黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）等皆可侵染甘薯[5]。由于甘薯主要靠扦插枝條進行種植，因此病毒可通過蟲傳和汁液傳播，復合侵染率很高，單株可同時感染2～3種病毒。張振臣等[6]在單個甘薯樣品中最多檢出6種病毒。Potyvirus同屬的SPFMV、SPVG、SPLV等在田間多為混合侵染[3，5]。除SPFMV之外，SPCSV還可與其他甘薯病毒進行協(xié)同侵染，加強病毒侵染及危害[8，9]。多病毒復合侵染比單病毒侵染時造成的危害更大，復制能力增強，病毒含量大幅提高，影響寄主細胞病理特征的變化，并造成癥狀加重[8-10]。SPFMV和SPCSV共同侵染時，SPFMV的含量比單獨侵染時增加600倍[6，7]。SPCSV與Begomovirus協(xié)同侵染后會導致甘薯出現(xiàn)嚴重的葉片卷曲、黃化癥狀，葉片中Begomovirus病毒量同樣會增加[9]。

魯中南及魯東地區(qū)是山東甘薯的主要產區(qū)[11]。通過連續(xù)幾年對山東省甘薯病毒病害的調查發(fā)現(xiàn)，甘薯病毒病害日益嚴重，苗床發(fā)病率平均20%～30%，嚴重地塊達50%以上[12]。初期研究顯示魯南地區(qū)甘薯病毒多復合侵染，為進一步明確山東省內甘薯病毒的發(fā)生分布、種類及侵染類型，本研究對山東省7個地區(qū)甘薯進行病樣采集及病毒病害調查，提取樣品總RNA和DNA，利用特異性引物進行檢測，鑒定病原種類，并對甘薯病樣中不同病原的侵染類型進行分析，可為今后甘薯病毒病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017—2018年甘薯苗床期，于山東濰坊、日照、臨沂、威海、煙臺、泰安和青島等甘薯主栽區(qū)采集表現(xiàn)皺縮、畸形、矮化、褪綠等病毒病疑似樣品140份，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 甘薯總RNA、DNA提取及cDNA合成

稱取甘薯樣品葉片約0.1 g，液氮冷凍后迅速研磨，按TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒說明書提取葉片總RNA，利用DNA quick Plant System DNA提取試劑盒說明書提取植物總DNA。保存于-80℃?zhèn)溆谩０凑誋iScript Ⅱ 1st Stand cDNA Synthesis Kit說明書，以RNA為模板合成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR、PCR檢測

在NCBI GenBank中下載各病毒基因組序列，利用DNAman 7.0軟件分別針對SPVG、SPLV、SPLCV、SPV2、SPCFV和SPCSV設計特異性檢測引物，SPFMV檢測引物引用王麗等[13]已報道序列（表1）。取合成的cDNA第一鏈或植物總DNA為模版，利用Easy Taq DNA聚合酶進行RT-PCR/PCR擴增。擴增體系為：2 × Es Taq Master Mix 7.5 μL，F(xiàn)/R（10 μmol/L）引物各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O補足總體積至15 μL。反應條件為： 94℃ 3 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。陰性樣品葉片總RNA反轉錄的cDNA作為陰性對照模板，ddH2O為空白對照模板。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 山東省甘薯病毒發(fā)生分布情況

2017—2018年，在山東省甘薯主栽區(qū)共采集樣品140份。利用RT-PCR/PCR技術進行病原檢測，結果顯示陽性樣品133個，采集樣品帶毒率達95%，共檢測到7種病毒（表2），SPVG、SPLV、SPCSV和SPFMV為主要病毒，檢出率皆在45%以上，其中SPCSV檢出率最高，在104份樣品中檢測到。有少數樣品被SPLCV、SPV2和SPCFV侵染，檢出率在10%～18%之間。

分別對7個地區(qū)的甘薯病毒種類及檢出率進行分析，結果顯示，SPVG、SPLV、SPCSV和SPFMV 4種病毒在7個地區(qū)皆有分布，且在各地區(qū)的檢出所占比相差不大（圖1）。SPCFV僅在日照、臨沂和青島地區(qū)檢出；SPLCV在濰坊、日照和臨沂地區(qū)檢測到；SPV2僅在泰安未檢測到。

2.2 山東省甘薯病毒復合侵染類型

140份甘薯樣品中，未感染病毒樣品占5%，其余樣品皆檢測到病毒。對133份甘薯病樣的病毒侵染情況進行分析，其中23%的樣品為單種病毒侵染，剩余樣品由多種病毒復合侵染，以2～4種病毒共同侵染為主，單個甘薯樣品中最多檢測到6種病毒（圖2）。

對133份病樣中病毒種類進行分析，復合侵染的病毒組合類型達33種。單種病毒侵染的樣品中主要為SPCSV，剩余樣品分別由SPLV、SPV2和SPFMV侵染（圖3A）。2種病毒侵染的樣品有7種組合，主要為SPFMV和SPCSV的組合（圖3B）。3種病毒侵染的樣品有9種組合，主要的組合為SPCSV、SPLV和SPVG（圖3C）。4種病毒侵染的樣品有8種組合，主要為SPFMV、SPCSV、SPLV和SPVG共同侵染（圖3D）。5種病毒侵染的樣品有5種組合，主要的侵染組合為SPV2、SPFMV、SPCSV、SPLV和SPVG（圖3E）。6種病毒侵染的樣品有4種組合，以SPV2、SPFMV、SPCSV、SPCFV、SPLV和SPVG共同侵染為主。

3 討論與結論

山東是甘薯種植大省，近年來由于病毒病的發(fā)生，造成甘薯巨大產量損失，而病毒種類和種群結構尚不明確。本研究通過對山東省7個地區(qū)140份甘薯樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)樣品病毒感染率達95%，表明山東薯區(qū)病毒病已經普遍發(fā)生。所檢樣品中共發(fā)現(xiàn)SPV2、SPLCV、SPFMV、SPCSV、SPCFV、SPLV和SPVG 7種病毒，其中SPCSV、SPFMV、SPVG和SPLV在7個地區(qū)皆有分布，為山東薯區(qū)的主要病毒，這與之前的研究報道相符[5，12]。山東地區(qū)甘薯病毒主要分布在魯中南及膠東地區(qū)（圖1），SPCSV、SPFMV、SPVG和SPLV在各地區(qū)的發(fā)生所占比沒有顯著的地域性差異，表明這幾種病毒在山東薯區(qū)已經全面分布與為害。SPV2、SPLCV和SPCFV檢出量較低，發(fā)生分布具有地域差異，SPV2和SPCFV在青島檢測所占比較高，SPLCV在日照發(fā)生比重較高，表明這幾種病毒還未在山東薯區(qū)全面發(fā)生，但存在大發(fā)生的威脅。

多種病毒共同侵染同一寄主是自然界中的常見現(xiàn)象，在甘薯病毒中也普遍存在[5，6]。山東省甘薯種植區(qū)病毒病發(fā)生情況復雜，本研究結果顯示133份病樣中復合侵染比例為77%，復合侵染的病毒組合達33種，單個樣品中最多可檢測出6種病毒，由此推測復雜的協(xié)同侵染是導致山東薯區(qū)病毒病害嚴重發(fā)生的主要因素。復合侵染時多種病毒會表現(xiàn)拮抗或協(xié)生作用。SPFMV和SPCSV復合侵染引起甘薯病毒病害（SPVD）已造成甘薯大規(guī)模減產甚至絕收，嚴重危害了甘薯生產，現(xiàn)已在世界各甘薯產區(qū)分布[6，7]。與單種病毒侵染相比，SPVD病樣癥狀更加嚴重，SPFMV含量增高[6]。本研究中，133份樣品中有70份樣品共同檢測到SPFMV和SPCSV，其中有19份樣品由SPFMV與SPCSV復合侵染，占兩種病毒復合侵染樣品中的68%。由此表明SPVD已在山東薯區(qū)廣泛分布及危害，是造成山東甘薯病毒病發(fā)生嚴重的重要因素之一。

綜上所述，山東地區(qū)甘薯病毒種類繁多、危害廣泛、復合侵染嚴重，已嚴重威脅山東甘薯產業(yè)的發(fā)展。本研究通過明確各地區(qū)甘薯病毒病的發(fā)生現(xiàn)狀，為各地區(qū)甘薯引種及防控工作提供了技術支持與理論指導。

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