基于圖像灰度處理的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生菌半定量-高通量篩選

石 楠，張瑩瑩，陳海清，李志輝，劉 雙，于 凡，郭 璇，檀建新*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院 河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002；3.承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德 067000；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)渤海校區(qū) 后勤管理辦公室，河北 滄州 061100）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）是一種食品行業(yè)中應(yīng)用廣泛的添加劑，微生物來(lái)源的TG通常被稱為微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（microbial transglutaminase，MTG），被譽(yù)為“21世紀(jì)超級(jí)粘合劑”[1]，可應(yīng)用于多種食品的加工過(guò)程中，例如肉類產(chǎn)品的重構(gòu)、防止奶酪脫水收縮[2-4]、參與功能油脂的微膠囊化[5]等。MTG可以由多種微生物產(chǎn)生，如茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）[6]、吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）[7]、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）[8]等。

對(duì)MTG產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選和檢測(cè)時(shí)，通常采用經(jīng)典的氧肟酸比色法[9]，但是該方法中底物N-羧基苯甲酰基L-谷氨?；拾彼幔∟-α-carboxybenzoyl-L-glutaminyl-glycine，N-CBZ-Gln-Gly）價(jià)格昂貴且用量較大，不適于菌株的大規(guī)模、高通量檢測(cè)篩選；因此，在菌種的初篩階段，人們通常會(huì)采用比較廉價(jià)的蛋白質(zhì)交聯(lián)-絮凝沉淀法[10-11]或稱凝膠法[12]，然而微生物的發(fā)酵液通常組成復(fù)雜，代謝產(chǎn)物中有很多成分可以使酪蛋白凝集或沉淀，很容易對(duì)凝膠現(xiàn)象的觀察造成干擾；BOURNEOWC等[13]曾建立了一種濾紙片（filter paper disc，F(xiàn)PD）檢測(cè)法，但這種方法獲得的陽(yáng)性菌落需要事先復(fù)印在其他非顯色平板上，顯色后再對(duì)應(yīng)菌落位置選擇接種，不利于后續(xù)復(fù)篩。

Image J是一種廣泛應(yīng)用于各種科學(xué)圖像分析處理的開(kāi)放軟件[14]，如醫(yī)學(xué)影像分析[15-16]、真菌孢子觀察[17]等。因此，本研究將一株MTG產(chǎn)生菌擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis sp.）109.5經(jīng)紫外誘變后產(chǎn)生的突變株接種于含有固體培養(yǎng)基的96孔板中，在孔內(nèi)進(jìn)行酶活檢測(cè)反應(yīng)，采用Image J軟件獲取各孔顯色結(jié)果的灰度均值，根據(jù)該值大小進(jìn)行突變株的初篩，以期建立MTG產(chǎn)生菌的半定量-高通量篩選方法，為MTG高產(chǎn)菌株或新產(chǎn)生菌的快速半定量-高通量篩選提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis sp.）109.5：分離自河北省承德地區(qū)土壤樣本，分離純化后高氏斜面4℃保存。

1.1.2 試劑

N-CBZ-Gln-Gly、鹽酸羥胺、還原型谷胱甘肽、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸：美國(guó)Sigma公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶-B（transglutaminase-B，TG-B）酶粉（酶活10 U/g）：上海雪豐國(guó)際貿(mào)易有限公司；其余常規(guī)生化試劑：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

高氏培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L、KNO31 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、瓊脂粉12 g/L、蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：牛肉膏1 g/L、酵母粉2 g/L、蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂粉12 g/L、蒸餾水1 L，pH 7.4。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、K2HPO40.7 g/L、KH2PO40.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、蒸餾

水1 L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25g/L、蛋白胨35g/L、酵母粉2g/L、NaCl 5 g/L、蒸餾水1 L，pH 7.2。

孢子萌發(fā)培養(yǎng)基：可溶性淀粉1 g/L、（NH4）2SO42 g/L、KH2PO41g/L、NaCl 1g/L、MgSO4·7H2O1g/L、微量元素溶液（FeSO4·7H2O 1 g/L、MnCl2·4H2O 1 g/L、ZnSO4·7H2O 1 g/L）1 mL，蒸餾水1 L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌條件為115℃，20 min；其余培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃，15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Costar96孔板：美國(guó)Corning公司；軟件ImageJ2x（2.1.4.7）：美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院；756P紫外-可見(jiàn)分光光度儀：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 突變株的獲得

取新鮮培養(yǎng)孢子成熟的菌株109.5高氏斜面，用孢子萌發(fā)培養(yǎng)基將斜面上的孢子洗下，無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾去除菌絲，置于含有50 mL孢子萌發(fā)培養(yǎng)基和適量玻璃珠的250 mL三角瓶中，調(diào)節(jié)孢子懸液濃度約為1×108CFU/mL，溫度30℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下?lián)u床振蕩2～3 h，使孢子萌發(fā)至菌絲長(zhǎng)度約為孢子直徑的一半。將孢子懸液置于無(wú)菌平皿中進(jìn)行紫外（ultra violet，UV）誘變，UV誘變條件：紫外燈20 W，照射距離25 cm，照射時(shí)間60 s。誘變后的孢子懸液經(jīng)梯度稀釋（稀釋梯度10-3、10-4、10-5），將稀釋液涂布于高氏培養(yǎng)基平板，30℃避光倒置培養(yǎng)3 d，至單菌落長(zhǎng)出。挑取生長(zhǎng)迅速、菌落邊緣整齊、孢子豐富的單菌落轉(zhuǎn)接至高氏斜面，每個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接1支高氏斜面。

1.3.2 96孔板反應(yīng)體系的確定

酶活測(cè)定底物液：0.2 mol/L Tris-乙酸緩沖液（pH 6.0）中N-CBZ-Gln-Gly 30 mmol/L、鹽酸羥胺0.1 mol/L、還原型谷胱甘肽10 mmol/L。

酶活測(cè)定終止液：三氯乙酸-氯化鐵溶液，由5%FeCl3、12%CCl3COOH、3 mol/L HCl等體積混和。

選擇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的商品酶制劑TG-B酶粉作為確立反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)參照物，以確定96孔板中酶顯色反應(yīng)的適宜條件。配制TG-B酶粉酶活梯度溶液（0、0.01 U/mL、0.05U/mL、0.1U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.6U/mL、0.8U/mL），酶活測(cè)定參考氧肟酸比色法[9，12]并有所改進(jìn)；考慮到接種到固體培養(yǎng)基上的突變株分泌的酶量未知但有限，故取10μL酶液（即酶量范圍為0.000 1～0.008 0 U）加入無(wú)菌96孔板的孔中，分別加入底物液10μL和30μL，37℃培養(yǎng)箱溫浴10 min后加等體積終止液顯色，根據(jù)顏色深淺確定適宜反應(yīng)體系。

1.3.3 96孔板培養(yǎng)基的選擇

分別取高氏培養(yǎng)基、發(fā)酵固體培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于無(wú)菌96孔板中，每孔200μL；采用接種環(huán)從斜面菌種上刮取相同面積（0.3 cm×1.0 cm）的部分突變株和出發(fā)菌株分別接種至3種培養(yǎng)基，涂布涂勻；96孔板加蓋并用封口膜密封，置于30℃條件下培養(yǎng)3 d。取底物液加入培養(yǎng)好的菌體表面，37℃培養(yǎng)箱溫浴10 min，加終止液顯色，對(duì)比幾種培養(yǎng)基的顯色效果，確定最適培養(yǎng)基。

1.3.4 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶突變株的半定量-高通量篩選

制備含有適宜培養(yǎng)基的96孔板，將突變株自高氏斜面接種至培養(yǎng)基，保持接種量基本一致，且涂布均勻，每個(gè)菌株接種一個(gè)孔；同時(shí)接種出發(fā)菌株109.5作為對(duì)照（CK），30℃條件下培養(yǎng)3 d。

在軟件Image J中打開(kāi)顯色結(jié)果圖片，轉(zhuǎn)換圖片類型為32-bit（32位）灰度圖像，從分析菜單欄的工具選項(xiàng)中調(diào)出目標(biāo)區(qū)域（region of interests，ROI）工具，用橢圓取圖選中待分析的孔，調(diào)整取圖框邊界以適應(yīng)孔內(nèi)待測(cè)區(qū)域，加入到ROI工具中；重復(fù)以上操作至選擇完畢所有需要分析的孔，點(diǎn)擊ROI工具中的測(cè)量選項(xiàng)獲得計(jì)算結(jié)果。結(jié)果數(shù)值中以灰度平均值體現(xiàn)不同孔的顏色深淺差異?；叶戎抵负诎讏D像中點(diǎn)的顏色深度，范圍在0～255之間，白色為255，黑色為0；故顏色越深則數(shù)值越小。

1.3.5 突變株的復(fù)篩

將篩選得到的正突變株從高氏斜面接種至裝有10 mL種子培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，每株接種3瓶，30℃、200r/min條件下培養(yǎng)30h后按3%（V/V）接種量分別轉(zhuǎn)接至裝有60mL發(fā)酵培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)70 h后，9 000 r/min離心3 min，取上清液即為粗酶液，測(cè)定MTG活力。

參考經(jīng)典氧肟酸比色法[9，12]測(cè)定MTG活力：取200μL粗酶液置于1.5mL離心管中，加入200μL底物液，37℃培養(yǎng)箱溫浴10min后加200μL終止液顯色，反應(yīng)體系經(jīng)12000r/min離心1 min，采用分光光度儀測(cè)定上清液在波長(zhǎng)525 nm條件下的吸光度值，根據(jù)L-谷氨酸-γ-單羥肟酸生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.191 1x+0.017 1，R2=0.998 1）計(jì)算MTG酶活力；MTG酶活力單位：37℃條件下每分鐘催化形成1μmol的L-谷氨酸-γ-單羥肟酸所需要的酶量[8，18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬無(wú)枝酸菌109.5的紫外誘變

菌株109.5是從土壤樣品中分離到的野生型菌株。有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，對(duì)于野生型菌株，誘變初始采用較高的劑量，容易引起遺傳物質(zhì)發(fā)生較大幅度的變異，如此獲得的突變株不易回復(fù)突變，遺傳特性比較穩(wěn)定。菌株109.5經(jīng)紫外誘變60 s后，致死率達(dá)到99.75%，屬于較高劑量范圍；最終共獲得突變株334株，編號(hào)為1～334。

2.2 96孔板反應(yīng)體系的確定

兩種反應(yīng)體系的顯色結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 兩種反應(yīng)體系的顯色結(jié)果Fig.1 Color results of two kinds of reaction systems

由圖1可知，L1反應(yīng)體系中整體顏色偏淺，無(wú)法指示酶濃度的變化；而L2反應(yīng)體系中隨著酶濃度的增加，反應(yīng)體系顏色逐漸加深。說(shuō)明在給定酶量的酶粉溶液中，L1反應(yīng)體系中的反應(yīng)物不足量，不足以完全指示酶活力大??；L2體系中的反應(yīng)物足量，檢出限可達(dá)0.000 1 U酶量，可以通過(guò)顯色結(jié)果推斷酶的濃度。由此確定96孔板固體培養(yǎng)基篩選的反應(yīng)體系為底物液和終止液各30μL。

2.3 96孔板篩選培養(yǎng)基的確定

隨機(jī)選取6株突變菌株（1編號(hào)為1～16），與出發(fā)菌株109.5（CK）同時(shí)接種在96孔板中的3種培養(yǎng)基上。培養(yǎng)3 d后，3種培養(yǎng)基中菌體均正常生長(zhǎng)。加入30μL底物液和終止液顯色后結(jié)果如圖2所示。

圖2 96孔板中突變菌株在3種固體培養(yǎng)基上的顯色結(jié)果對(duì)比Fig.2 Color result comparison of mutants on three kinds of solid media in 96-well plates

由圖2可知，高氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株未產(chǎn)生明顯的顏色反應(yīng)，說(shuō)明高氏培養(yǎng)基僅可供菌體生長(zhǎng)而不利于菌種產(chǎn)MTG；發(fā)酵固體培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌株有明顯的顏色反應(yīng)，說(shuō)明這兩種培養(yǎng)基適合菌株產(chǎn)MTG。

圖3 突變株在兩種固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況與顯色結(jié)果Fig.3 Growth situations and color results of mutants on two kinds of solid media

隨機(jī)選取38株突變株（編號(hào)為1～38）與出發(fā)菌株109.5（CK）分別接種到含有發(fā)酵固體培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的96孔板中，每孔含培養(yǎng)基200μL，30℃培養(yǎng)3d后進(jìn)行顯色反應(yīng)。同時(shí)取酶活分別為0、0.01U/mL、0.05U/mL、0.1 U/mL的TG-B酶粉溶液10μL加入空白未接種孔（內(nèi)含相同培養(yǎng)基），其它生長(zhǎng)菌落孔中加10μL Tris-乙酸溶液，以使每孔內(nèi)的溶液終體積一致，一同進(jìn)行顯色反應(yīng)；以觀察低酶活的酶粉溶液在固體培養(yǎng)基上的顯色效果。結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，低酶活酶粉溶液在兩種培養(yǎng)基上均可以呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的顏色變化，突變株也呈現(xiàn)了明顯的顏色差異；但相對(duì)而言，發(fā)酵固體培養(yǎng)基的本底顏色較深，有的突變株在生長(zhǎng)過(guò)程中就使培養(yǎng)基出現(xiàn)了顏色變化；而營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基被認(rèn)為是對(duì)檢測(cè)時(shí)顏色干擾較少的培養(yǎng)基[13]，本底淺，能突出顯色反應(yīng)后的顏色差異。因此營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基適宜作為突變株篩選的培養(yǎng)基。

2.4 產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶突變株的半定量-高通量篩選

將其余296株突變株及出發(fā)菌株109.5（CK）分別接種于含有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的96孔板中，30℃條件下培養(yǎng)3 d后進(jìn)行顯色反應(yīng)。在Image J軟件中打開(kāi)所要分析的顯色結(jié)果圖片，依次選取每個(gè)孔的顯色區(qū)域，測(cè)定所有突變株的灰度均值，部分灰度均值見(jiàn)表1。

表1 部分突變株的灰度均值Table 1 Grayscale averages of some mutants

以CK菌株的灰度均值85.883為參比，低于此值的即為正突變株。由表1可知，38株突變株中，正變株有24株，其中均值最小的是突變株19，灰度均值為54.684。按照這種方法，從334株突變株中初篩獲得6株灰度均值明顯減小的正突變株（P＜0.01），菌株編號(hào)分別為19、80、118、127、227、229。

2.5 篩選結(jié)果驗(yàn)證

將初篩獲得的6株正突變株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，同時(shí)隨機(jī)選取一株灰度均值＞CK菌株的突變株212（即負(fù)突變株）同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵作為對(duì)照。MTG酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 突變株的MTG活力測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of MTG activity of mutants

由表2可知，6株正突變株的MTG活力確實(shí)＞CK菌株；而負(fù)突變株212的MTG活力＜CK菌株。其中突變株80的MTG活力最高，為0.803 U/mL，比出發(fā)菌株（0.323 U/mL）MTG活力提高148.6%，而負(fù)突變株212的MTG活力為0.241U/mL，下降25.3%。

由此可見(jiàn)，基于Image J的96孔板固體培養(yǎng)適用于產(chǎn)MTG擬無(wú)枝酸菌株109.5突變株的初篩，并實(shí)現(xiàn)突變株的半定量-高通量篩選。相比于搖瓶發(fā)酵，96孔板固體培養(yǎng)篩選簡(jiǎn)化為一步接種在固體培養(yǎng)基上顯色對(duì)比灰度均值，節(jié)省了時(shí)間和培養(yǎng)基的用量，也節(jié)省了培養(yǎng)空間。另外，96孔板內(nèi)每個(gè)孔的培養(yǎng)基體積都相等，在接種量保持基本一致的前提下，顯色結(jié)果可以體現(xiàn)突變株的產(chǎn)酶差異，且相比于肉眼直接觀察的無(wú)法定量的凝膠法篩選，可以通過(guò)灰度均值來(lái)實(shí)現(xiàn)半定量測(cè)定及產(chǎn)酶能力-高通量篩選。

3 結(jié)論

采用96孔板固體培養(yǎng)結(jié)合Image J圖像處理軟件獲取菌落顯色反應(yīng)的灰度均值，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)MTG擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis sp.）109.5紫外誘變突變株的半定量測(cè)定及產(chǎn)MTG酶能力的高通量篩選。通過(guò)該方法從擬無(wú)枝酸菌株109.5紫外誘變后獲得的334株突變株中成功篩選到一株MTG高活力突變株80，較出發(fā)菌株109.5的MTG活力提高148.6%。相對(duì)于傳統(tǒng)的搖瓶發(fā)酵篩選，這種半定量-高通量篩選方法大大節(jié)省了培養(yǎng)空間和程序，可以推廣應(yīng)用至其它也需通過(guò)顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選的菌株；可作為MTG突變菌株的高通量篩選方法，為進(jìn)一步擴(kuò)大MTG產(chǎn)生菌資源從而開(kāi)發(fā)更好的食品用酶制劑提供技術(shù)支持。