蛇龍珠果醋醋酸發(fā)酵工藝研究

吳桂君，陳曉倩，劉永衡

（1.銀川能源學(xué)院 生物工程系，寧夏 永寧 750105；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，廣西 南寧 530001；3.寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工工程系，寧夏 銀川 750000）

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）、蛇龍珠（Cabernet Gernischt）和品麗珠（Cabernet Franc）屬于Carbernet系列品種，被稱(chēng)為“三珠”，以其獨(dú)特的酒質(zhì)成為世界著名釀酒品種[1-3]。蛇龍珠屬于歐亞類(lèi)群，原產(chǎn)法國(guó)，是我國(guó)目前栽培面積最大的釀酒紅葡萄品種。我國(guó)的葡萄種植多集中于新疆、山東、寧夏、河北、遼寧、山西、吉林和河南等地。特別近十年葡萄栽培面積和產(chǎn)量一直呈上升趨勢(shì)。我國(guó)葡萄年產(chǎn)量約200萬(wàn)t，栽培面積據(jù)世界第六位，產(chǎn)量據(jù)世界第五位，中國(guó)葡萄在世界已占有一席之地[4-6]。隨著葡萄酒產(chǎn)業(yè)在我國(guó)快速的發(fā)展，葡萄酒釀制過(guò)程中產(chǎn)生了大量的葡萄皮渣，其中主要是葡萄皮、葡萄籽和果梗等。目前這些皮渣主要被用作飼料、肥料，其綜合利用率較低，造成很大的浪費(fèi)[7]。

果醋是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的酸味調(diào)味品，它兼有水果和食醋的營(yíng)養(yǎng)保健功能，最重要的是它可以以果渣為主要原料進(jìn)行釀制，目前全國(guó)各地醋吧的興起，特別是在我國(guó)南方大中城市，食用果醋已成為一種時(shí)尚，在飲料中大有后來(lái)居上之勢(shì)[8]。科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，果醋具有多種功能，果醋能促進(jìn)新陳代謝，調(diào)節(jié)酸堿平衡，消除疲勞，果醋中含有10種以上的有機(jī)酸和人體所需的多種氨基酸[9]。目前關(guān)于葡萄皮渣綜合利用的相關(guān)研究很多，如牛蕾等[10]對(duì)葡萄皮渣中的組成成分的研究，王占勇等[11]還研究了從葡萄皮中提取果膠等。本試驗(yàn)以葡萄皮渣釀制的原酒為基礎(chǔ)，添加惡臭醋酸桿菌（A cetobactor rancens）渾濁變種AS1.41進(jìn)行醋酸發(fā)酵試驗(yàn)，探討接種量、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、初始酒精含量對(duì)醋酸轉(zhuǎn)化率的影響，并設(shè)計(jì)了4因素4水平正交試驗(yàn)，確定出最佳發(fā)酵條件和試驗(yàn)方案，為后續(xù)新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和品質(zhì)分析提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蛇龍珠葡萄皮渣原酒：由蛇龍珠葡萄皮渣酒精發(fā)酵所得，酒精度7.6%vol。

惡臭醋酸桿菌（Acetobactor rancens）混濁變種AS1.41：上海北諾生物科技有限公司。

醋酸菌斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1g，酵母膏1g，CaCO31.5g，體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇2mL（滅菌后加入），瓊脂2g，水100mL。

醋酸菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖1g，酵母膏1g，CaCO31.5g，體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇2 mL（滅菌后加入），水100 mL[12]。

1.1.2 試劑

葡萄糖（分析純）、NaOH（分析純）、CaCO3（分析純）、酚酞（指示劑）、酒石酸（分析純）、酵母膏（生化試劑）、瓊脂（生化試劑）、無(wú)水乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH320酸度計(jì)：上海雷磁電化學(xué)分析儀器公司；FUS-XL型10L發(fā)酵罐：上海國(guó)強(qiáng)生化裝備有限公司；DA-130N手持式數(shù)字酒精計(jì)：日本KEM生產(chǎn)；DHP-500W型電熱恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HCQ-QX全溫振蕩器：常州華冠儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指標(biāo)測(cè)定方法

酒精度的測(cè)定：蒸餾法和手持式數(shù)字酒精計(jì)[13]；總酸度的測(cè)定：酸堿中和滴定法[14]。

1.3.2 醋酸菌活化培養(yǎng)工藝

醋酸菌一級(jí)培養(yǎng)：在無(wú)菌狀態(tài)下，將選用的醋酸菌接入10 mL試管，30℃培養(yǎng)72 h為一代菌種。醋酸菌二級(jí)培養(yǎng)：在無(wú)菌狀態(tài)下，用無(wú)菌生理鹽水將生長(zhǎng)良好的二代種子接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，500 mL三角瓶中裝液50 mL，接種量10%，在30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。瓶?jī)?nèi)有菌膜產(chǎn)生，培養(yǎng)基變渾濁，達(dá)到醋酸菌旺盛繁殖期即可。鏡檢后要求無(wú)雜菌。

1.3.3 醋酸發(fā)酵工藝流程

1.3.4 操作要點(diǎn)

（1）葡萄皮渣原酒：將5 kg葡萄皮渣放入發(fā)酵罐（20 L）中，添加蒸餾水不超過(guò)總?cè)萘康?0%，將糖度調(diào)整為18%，滅菌（93～95℃，30 s）后接入0.6%的酵母菌，26～28℃酒精發(fā)酵6 d，酒精度為7.6%vol。

（2）醋酸發(fā)酵：將過(guò)濾后的原酒采用無(wú)水乙醇或蒸餾水調(diào)整至適合的酒精度，接入活化培養(yǎng)后的醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵，以醋酸含量不再升高為終點(diǎn)。

（3）澄清殺菌：取上清液以0.45μm聚醚砜濾膜精濾；殺菌溫度60～70℃，時(shí)間10 min[15-16]。

1.3.5 醋酸轉(zhuǎn)化率的計(jì)算方法

式中：0.8為20℃時(shí)乙醇的密度，g/cm3；1.304為理論上醋酸與乙醇的質(zhì)量比。

1.3.6 醋酸發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

將葡萄皮渣發(fā)酵釀制的葡萄酒采用無(wú)水乙醇或蒸餾水調(diào)整適宜的酒精度進(jìn)行醋酸發(fā)酵。試驗(yàn)采用液態(tài)振蕩發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為10 d。分別以發(fā)酵溫度（26℃、28℃、30℃、32 ℃、36 ℃），初始酒精度（6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol），醋酸菌接種量（6%、8%、10%、12%、14%）及搖床轉(zhuǎn)速（100 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）4個(gè)因素為考察對(duì)象，醋酸轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，研究各因素對(duì)醋酸發(fā)酵的影響。

1.3.7 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

試驗(yàn)方案采用4因素4水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在單因素醋酸發(fā)酵試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取接種量、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、初始酒精含量4個(gè)主要因素，以醋酸轉(zhuǎn)化率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用DPS7.05軟件確定最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)，同時(shí)得出最優(yōu)試驗(yàn)組合，采用最小顯著差數(shù)法進(jìn)行顯著性分析，篩選出醋酸發(fā)酵工藝最優(yōu)組合，因素與水平編碼見(jiàn)表1。

表1 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵條件對(duì)葡萄皮渣醋酸發(fā)酵的影響

2.1.1 不同溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

取200 mL酒精含量10%vol的果酒裝入500 mL三角瓶中，紗布封口后滅菌（93～95℃、30 s），然后接入活化后的醋酸菌種10%，放置在26℃、28℃、30℃、32℃、36℃全溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，10 d內(nèi)每天測(cè)定一次酸度和酒精度，計(jì)算出醋酸轉(zhuǎn)化率，最終確定在醋酸發(fā)酵過(guò)程中合適的發(fā)酵溫度。其結(jié)果如圖1所示。

圖1 溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of temperature on acetic acid fermentation

由圖1可知，在26～36℃發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，隨著溫度上升，醋酸菌生長(zhǎng)代謝較旺盛，醋酸轉(zhuǎn)化率穩(wěn)步提升。溫度在26℃時(shí)，雖然轉(zhuǎn)化率始終在提高，但是相對(duì)其他溫度時(shí)曲線偏低，當(dāng)溫度在36℃時(shí)反而抑制了醋酸菌的活力，醋酸轉(zhuǎn)化率較低。因此，選取溫度28℃、30℃、32℃、34℃四個(gè)水平進(jìn)行醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)。

2.1.2 不同接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

取200 mL酒精含量10%vol的果酒裝入500 mL三角瓶中，紗布封口后滅菌（93～95℃、30 s），然后分別以接種量6%、8%、10%、12%、14%接入活化后的醋酸菌種。30℃條件下全溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，10 d內(nèi)每天測(cè)定一次酸度和酒精度，計(jì)算出醋酸轉(zhuǎn)化率，最終確定在醋酸發(fā)酵過(guò)程中合適的接種量，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of inoculum on acetic acid fermentation

由圖2可知，接種量的多少對(duì)于醋酸發(fā)酵影響不大，只是接種量較大時(shí)在發(fā)酵初期，發(fā)酵速度較快，接種量較小時(shí)發(fā)酵速度較慢，轉(zhuǎn)化率也相應(yīng)低一些，但是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各接種量醋酸轉(zhuǎn)化率差距明顯變小，接種量在12%時(shí)醋酸轉(zhuǎn)化率最高。因此，選取接種量6%、8%、10%、12%四個(gè)水平進(jìn)行醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)。

2.1.3 不同初始酒精含量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

取200 mL果酒裝入500 mL三角瓶中，紗布封口后滅菌（93～95℃，30 s），然后分別接入活化后的醋酸菌種10%，調(diào)整初始酒精含量為6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol。30℃條件下全溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180 r/min，10 d內(nèi)每天測(cè)定一次酸度和酒精度，計(jì)算出醋酸轉(zhuǎn)化率，最終確定在醋酸發(fā)酵過(guò)程中合適的初始酒精含量，其結(jié)果如圖3所示。

初始酒精度越低，對(duì)醋酸菌抑制越小，在發(fā)酵初始階段，產(chǎn)酸較快。由圖3可知，當(dāng)酒精度在9%vol和10%vol時(shí)，過(guò)高的酒精度抑制了醋酸菌的生長(zhǎng)，醋酸轉(zhuǎn)化率在第5天以后增長(zhǎng)幅度明顯變小，酒精度在6%vol～8%vol時(shí)，轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高，由圖3可知初始酒精度7%vol發(fā)酵10天達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率，但是從整個(gè)曲線圖的變化趨勢(shì)上觀察，酒精度在8%vol的時(shí)候，第5天以前轉(zhuǎn)化率提高速度較快，之后穩(wěn)定增長(zhǎng)，第10天左右有所降低，這是由于發(fā)生過(guò)氧化作用，醋酸轉(zhuǎn)化率開(kāi)始下降。因此，初始酒精度選取6%vol、7%vol、8%vol、9%vol四個(gè)水平進(jìn)行醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)。

圖3 初始酒精含量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of initial alcohol content on acetic acid fermentation

2.1.4 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

取200 mL酒精含量10%vol的果酒裝入500 mL三角瓶中，紗布封口后滅菌（93～95℃、30 s），然后分別接入活化后的醋酸菌種10%，30℃條件下全溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)，分別選取100 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min五個(gè)轉(zhuǎn)速進(jìn)行醋酸發(fā)酵，10 d內(nèi)每天測(cè)定一次酸度和酒精度，計(jì)算出醋酸轉(zhuǎn)化率，最終確定在醋酸發(fā)酵過(guò)程中合適的搖床轉(zhuǎn)速，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of rotating speed on acetic acid fermentation

醋酸菌發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵，在氧化乙醇產(chǎn)生醋酸過(guò)程中需提高通氧量。由圖4可知，在較低的轉(zhuǎn)速100 r/min時(shí)，通氧量較低，發(fā)酵后期醋酸轉(zhuǎn)化率一直不高，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，初期發(fā)酵旺盛，這是由于通氧量過(guò)高，醋酸菌大量生長(zhǎng)繁殖，生長(zhǎng)因子消耗過(guò)大，同時(shí)轉(zhuǎn)速過(guò)高加快了乙醇的揮發(fā)，所以在發(fā)酵后期曲線出現(xiàn)了下降的拐點(diǎn)，醋酸轉(zhuǎn)化率反而降低。因此，搖床轉(zhuǎn)速選取140 r/min、150r/min、160 r/min、170 r/min四個(gè)水平進(jìn)行醋酸發(fā)酵正交試驗(yàn)。

2.2 葡萄皮渣醋酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取溫度、初始酒精含量、接種量和搖床轉(zhuǎn)速為評(píng)價(jià)因素，醋酸轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

從表2、表3可知，醋酸發(fā)酵的4個(gè)因素中，初始酒精含量是最主要影響因素，其次是發(fā)酵溫度，最后是搖床轉(zhuǎn)速和接種量。顯著性檢驗(yàn)表明，發(fā)酵溫度、初始酒精含量、接種量、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)醋酸轉(zhuǎn)化率的影響均為極顯著水平（P＜0.01），最優(yōu)的組合是A2B2C2D4，即溫度為30℃，初始酒精含量7%vol，醋酸菌接種量8%，搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，在此條件下測(cè)得醋酸轉(zhuǎn)化率為92.26%。

2.3 討論

目前我國(guó)關(guān)于葡萄皮渣果醋報(bào)道很少，相關(guān)研究還處于起步階段，對(duì)于下一步果醋釀造還需要解決以下問(wèn)題：葡萄皮渣釀造過(guò)程中醋酸菌選育優(yōu)化對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)有至關(guān)重要的作用，也是果醋產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生差距的原因之一，但是由于時(shí)間和條件的限制未對(duì)菌種進(jìn)行選育，今后可以采用物理誘變、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合等手段對(duì)此進(jìn)行研究。同時(shí)本研究只針對(duì)寧夏本地釀酒葡萄品種皮渣釀制果醋做出了研究，并未涉及到區(qū)外其他地區(qū)葡萄品種的發(fā)酵研究，也未涉及到鮮食葡萄皮渣的發(fā)酵研究，故在今后的實(shí)踐過(guò)程中，將在本研究的基礎(chǔ)上，展開(kāi)更加深入的探索。

3 結(jié)論

醋酸發(fā)酵階段初始酒精量、醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速都對(duì)醋酸轉(zhuǎn)化率有重要影響，其中通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了最適宜的工藝控制參數(shù)范圍，又通過(guò)4因素4水平正交試驗(yàn)確定了最佳試驗(yàn)組合方案，即：溫度30℃，初始酒精含量7%vol，醋酸菌接種量8%，搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，此條件下醋酸轉(zhuǎn)化率為92.26%，其主要影響因素為初始酒精含量和發(fā)酵溫度。