產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌株的篩選及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

姜春宇，張 媱，孫燕飛，李 楊，雷勇輝*

（1.石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學 農(nóng)學院，新疆 石河子 832003）

蛋白酶是世界三大工業(yè)用酶之一，可催化肽鏈中肽鍵水解，在食品、洗滌、皮革等工業(yè)領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用，市場占有率高達整個商品酶銷售量的一半以上[1-2]。蛋白酶作為常用工業(yè)酶之一，在市場上享有廣闊的應(yīng)用及開發(fā)前景，并受到研究人員的廣泛關(guān)注：劉穎等[3]通過單因素試驗和正交試驗對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）10075發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，中性蛋白酶活力由98.36 U/mL提高至353.45 U/mL；舒?zhèn)W等[4]通過基因組改造技術(shù)對一株具有角蛋白酶活性的節(jié)桿菌（Arthrobacter）進行改造，酶活力為原始菌株的5.48倍。低溫蛋白酶的最適溫度一般在40℃以下[5]，由于在低溫環(huán)境下具有較高的酶活性，有助于在保證催化效率的前提下降低反應(yīng)溫度和縮短反應(yīng)時間，從而大幅度節(jié)約能源，具有廣泛應(yīng)用前景以及中溫蛋白酶無法取代的優(yōu)越性[6]，自20世紀70年代以來，國際上越來越多的實驗室投入到低溫蛋白酶的研究，從海水、高山以及極地泥土等樣品中分離到產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株，如張曉燕[7]從新疆冰川高寒地區(qū)阿勒泰進山口植物根際凍土中分離出一株沙雷氏菌（Serratiamarcescens），其所產(chǎn)的低溫蛋白酶活力為54.25 U/mL。

目前，蛋白酶主要來源于細菌，其中以芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonadaceae）尤為突出[8]。但其生產(chǎn)菌株的單一性不但不能滿足制革、絲綢、日化工業(yè)對多種酶類生產(chǎn)的需求，而且芽孢桿菌在工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的芽孢往往影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，打破現(xiàn)有產(chǎn)酶菌種的局限性，積極開發(fā)新菌種勢在必行。酵母菌作為一種工業(yè)常用菌種，在生產(chǎn)上具有發(fā)酵工藝成熟、產(chǎn)物易于誘導、產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)良等特點。徐亞男等[9]在新疆赤霞珠葡萄酒發(fā)酵過程中篩選得到1株產(chǎn)蛋白酶能力較強的葡萄汁有孢漢生酵母（Hanseniasporauvarum）；DASKAYA-DIKMEN C等[10]于土耳其北部分離得到3株嗜冷酵母（Candidagelida），其蛋白酶酶活在2.11～10.53 U/mL范圍內(nèi)。

本研究從新疆本地分離獲得的200株酵母菌中篩選產(chǎn)低溫蛋白酶菌株，并對其中3株低溫蛋白酶活力較高的酵母菌進行鑒定，并利用響應(yīng)面法對低溫蛋白酶活力最高的菌株產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行初步優(yōu)化，為后續(xù)酵母產(chǎn)低溫蛋白酶的研究和應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

200株酵母菌株：實驗室從新疆本地水果表皮、植物內(nèi)部、水樣和土壤中分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子液體培養(yǎng)基：采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptonedextrose，YEPD）培養(yǎng)基。酵母粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，pH自然。121℃滅菌20 min。

蛋白酶平板篩選培養(yǎng)基[11]：在YEPD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加脫脂奶粉1.0%，混勻，為防治奶粉變性應(yīng)將培養(yǎng)基分別高壓滅菌。121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

酪氨酸、干酪素、福林酚（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；DP307酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；Taq酶（5 U/μL）：大連TAkaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CS601恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；759S紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；ZHWY-100B搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FroFleX聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Life Technologies公司；5424R高速冷凍離心機：Eppendorf中國有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SMZ800N體式鏡：日本Nikon公司；Imager.M2微分干涉顯微鏡：德國ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌株的篩選

初篩[12]：室溫下將分離純化得到的酵母菌點接于蛋白酶平板篩選培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)7～14d后觀察菌落生長狀況與培養(yǎng)基變化情況。記錄有透明水解圈的酵母菌，編號并拍照，采用十字交叉法記錄水解圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值D/d。將具有透明水解圈的菌株點接轉(zhuǎn)板，于20℃重復上述觀察記錄過程以篩選產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌。

復篩[13-15]：在超凈臺中，于活化斜面取一環(huán)初步篩選得到的產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌株接種到100 mL種子液培養(yǎng)基中，在20℃或28℃（依據(jù)初篩培養(yǎng)溫度）、150 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)48 h。取2 mL種子液，10 000 r/min離心20 min，所得的上清液即為粗酶液。粗酶液稀釋10倍后，根據(jù)國標GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》測定蛋白酶活力，其中反應(yīng)溫度降至20℃或28℃。

1.3.2 形態(tài)學和生理生化鑒定

形態(tài)學鑒定：將篩選到的產(chǎn)低溫蛋白酶的菌種劃線接種于YEPD培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2～5 d，進行菌落形態(tài)觀察，并在體視顯微鏡和微分干涉顯微鏡下進行細胞形態(tài)觀察。

生理生化鑒定：鑒定方法參考文獻[16]。

1.3.3 分子生物學鑒定[17-18]

酵母菌基因組的提取：采用DP307酵母基因組提取試劑盒提取酵母菌株的DNA。

PCR擴增：以酵母菌基因組DNA為模板，采用26SrRNA基因的通用引物（NL-1：5'-GCATATCAATAAGCGGAG GAAAAG-3'；NL-4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：50×SYBRGreen 0.3μL、ROX Reference Dye0.1μL、10×cDNA 1μL、10×Taq buffer 2.5μL、25 mmol/L MgCl22.5μL、10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）0.5 μL、5 U/μL Taq DNA polymerase0.2μL、10μmol/L上下游引物各0.5μL，補雙蒸水（ddH2O）至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃1min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析：將擴增出的26SrRNA基因序列克隆送至上海生工測序。登錄美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站，采用BLAST程序進行序列比對，通過Mega6.06軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.3.4 產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

碳源種類優(yōu)化：于活化斜面取一環(huán)初步篩選得到的產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌株WLY1接種至100mL種子液體培養(yǎng)基中，20℃、150r/min條件下培養(yǎng)48h得到種子液。按2%（V/V）接種量將種子液接種至YEPD培養(yǎng)基中，20℃、150 r/min條件下培養(yǎng)時間48h。以不添加葡萄糖的YEPD培養(yǎng)基為對照，考察碳源種類（蔗糖、甘油、乳糖、可溶性淀粉、檸檬酸）對酵母菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響，碳源添加量為2%。

無機氮源種類優(yōu)化：選取最優(yōu)碳源后，考察無機氮源種類（酪素、硝酸鉀、硝酸鈉、尿素粉）對酵母菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響，無機氮源添加量為1.5%[19-21]。

響應(yīng)面分析[22]：在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法（responsesurfacemethodology，RSM）中的Box-Behnken試驗方案進行設(shè)計，考察酵母浸粉含量（A）、蛋白胨含量（B）和干酪素含量（C）對菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響，通過試驗數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，初步確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方，并進行驗證。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013計算樣品的平均值±標準差，用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan法進行組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌株的篩選結(jié)果

產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌的D/d值及酶活力測定結(jié)果見表1。表中除菌株WLY1、WLY1、MLY1于20℃條件下培養(yǎng)外，其他菌株均在28℃條件下培養(yǎng)。

表1 不同菌株的D/d值、蛋白酶活力測定結(jié)果Table 1 Determination results of D/d values and protease activity of different strains

由表1可知，從新疆本地分離獲得的200株酵母菌中篩選出14株產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株，其中菌株WLY1、WLY2和MLY1在20℃條件下均能產(chǎn)蛋白酶，蛋白酶活分別為69.03 U/mL、34.20 U/mL、29.70 U/mL，故選取該3株酵母菌進行菌種鑒定。且在3株酵母菌株中，菌株WLY1在20℃條件下所產(chǎn)的低溫蛋白酶酶活力較高。因此，對其產(chǎn)低溫蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化。

2.2 產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

酵母菌株WLY1、WLY2和MLY1的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)觀察結(jié)果見圖1。

圖1 產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌WLY1、WLY2和MLY1的菌落（A，B，C）和細胞形態(tài)（a，b，c）Fig.1 Colony(A,B,C)and cell morphology(a,b,c) of low-temperature protease-producing yeasts WLY1,WLY2 and MLY1

由圖1可知，菌株WLY1菌落呈粉紅色，圓形，中間凸起，表面及邊緣光滑濕潤，其單細胞為橢圓形或球形，可觀察到出芽生殖形成的藕節(jié)狀假菌絲；菌株WLY2菌落呈白色、圓形，中間凸起，表面及邊緣粗糙規(guī)整，其單細胞成典型球狀；菌株MLY1菌落呈米黃色，表面潤滑，中部凹陷有褶皺，邊緣凸起不規(guī)則，其單細胞體積較小，橢圓形或球形，單個或成對出現(xiàn)。

2.2.2 生理生化特征

酵母菌株WLY1、WLY2和MLY1的生理生化鑒定結(jié)果見表2～表4。

表2 3株產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌的同化試驗結(jié)果Table 2 Results of assimilation tests of 3 yeasts producing low-temperature protease

表3 3株產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌糖發(fā)酵結(jié)果Table 3 Results of the sugar fermentation tests of 3 yeasts producing low-temperature protease

表4 3株產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌其他生理生化鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of other physiological and biochemical of 3 yeasts producing low-temperature protease

由表2～表4可知，菌株WLY1不能利用乳糖、淀粉以及蜜二糖作為碳源，在無維生素環(huán)境下可以生長，不產(chǎn)胞外類淀粉化合物，產(chǎn)尿素酶，可在40℃條件下生長；菌株WLY2不能利用D-阿拉伯糖、蜜二糖以及菊粉作為碳源，在無維生素環(huán)境下可以生長，產(chǎn)胞外類淀粉化合物、尿素酶，可在40℃條件下生長；菌株MLY1在上述3種菌株中的可利用碳源最少，生長需要維生素，產(chǎn)胞外類淀粉化合物、尿素酶，最高生長溫度僅28℃。

經(jīng)形態(tài)觀察和生理生化鑒定，初步鑒定菌株WLY1、WLY2、MLY1分別為紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、Barnettozyma。

2.2.3 分子生物學鑒定

酵母菌株WLY1、WLY2和MLY1的26SrRNA測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對搜索，選取同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 3株產(chǎn)低溫蛋白酶酵母菌基于26S rDNA的D1/D2區(qū)序列構(gòu)建的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 3 yeasts producing low-temperature protease based on the D1/D2 sequences of 26S rDNA

由圖2可知，菌株WLY1、WLY2和MLY1分別與紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、Barnettozyma聚于一支，初步判定酵母菌株WLY1為Rho dosporidium、WLY2為Cryptococcus、MLY1為Barnettozyma。結(jié)合形態(tài)學和生理生化鑒定結(jié)果，最終鑒定產(chǎn)低溫蛋白酶酵母WLY1、WLY2、MLY1分別為雙倒卵形紅冬孢酵母（Rhodosporidium diobovatum）、Cryptococcus adeliensis、Barnettozymacalifornica。

2.3 菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.3.1 碳源種類對菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響

以YEPD培養(yǎng)基為對照，考察碳源種類對菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 碳源種類對菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響Fig.3 Effect of type of carbon source on low-temperature protease production by strain WLY1

由圖3可知，在不添加葡萄糖的YEPD培養(yǎng)基中，菌株WLY1產(chǎn)蛋白酶水平最高，達72.49 U/mL。因此，本試驗選則無葡萄糖添加的YEPD培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。

2.3.2 無機氮源種類對菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響

在無葡萄糖添加的YEPD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，考察無機氮源種類對菌株WLY1產(chǎn)蛋白酶的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 無機氮源種類對菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響Fig.4 Effect of type of inorganic nitrogen source on low-temperature protease production by strain WLY1

由圖4可知，采用添加有干酪素的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，菌株WLY1所產(chǎn)的低蛋白酶活力最高，為102.20 U/mL，因此選用在無葡萄糖添加的YEPD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加干酪素為最佳培養(yǎng)基。

2.4 響應(yīng)面分析結(jié)果

通過前期單因素試驗得出，三種氮源的最優(yōu)添加量均為1.5%，因此，以單因素為基礎(chǔ)進行響應(yīng)面試驗。以蛋白酶活力（Y）為響應(yīng)指標，考察酵母浸粉（A）、蛋白胨（B）和干酪素（C）對菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的影響，Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6，各因素交互作用對蛋白酶活力的影響結(jié)果見圖5。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken tests

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of the regression model

通過Design Expert軟件對表5試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，獲得蛋白酶活力（Y）對酵母浸粉（A）、蛋白胨（B）和干酪素（C）的二次多項式回歸方程：

圖5 酵母浸粉、蛋白胨和干酪素交互作用對菌株WYL1的低溫蛋白酶活力影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between yeast extract powder,peptone and casein contents on low-temperature protease activity of strain WYL1

由表6和圖5可知，3個因素的二次項及蛋白胨對蛋白酶活力的影響極顯著（P＜0.01）；酵母浸粉分別與蛋白胨、干酪素的交互作用對蛋白酶活力影響顯著（P＜0.05）；其他因素對蛋白酶活力影響不顯著（P＞0.05）。分析該二次多項模型及其各項的方差結(jié)果表明，該回歸模型的P值為0.000 6，極顯著（P＜0.01），變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值較低為12.81%，有效信號與噪聲的比值＞10.95，決定系數(shù)R2值達到0.956，說明回歸方程的擬合程度較好，預測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性，因而該模型可以用于菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論分析和預測。

通過響應(yīng)面優(yōu)化得出酵母菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的最佳培養(yǎng)基配方為酵母浸粉1.64%、蛋白胨1.21%、干酪素1.48%。在此最優(yōu)條件下，得出實際蛋白酶活力平均值為251.51 U/mL，與預測值248.01 U/mL接近，說明模型可靠性很高。

3 結(jié)論

本研究從新疆本地分離獲得的200株酵母中篩選出14株產(chǎn)低溫蛋白酶的酵母菌株。其中3株酵母（WLY1、WLY2和MLY1）在20℃條件下產(chǎn)蛋白酶，且蛋白酶活力依次為69.03 U/mL、34.20 U/mL、29.70 U/mL。通過形態(tài)觀察、生理生化和分子生物學鑒定菌株WLY1、WLY2和MLY1分別為雙倒卵形紅冬孢酵母（Rhodosporidium diobovatum）、Cryptococcus adeliensis、Barnettozyma californica。通過響應(yīng)面分析法，優(yōu)化得出菌株WLY1產(chǎn)低溫蛋白酶的最佳培養(yǎng)基配方為酵母粉1.64%、蛋白胨1.21%、干酪素1.48%。在此最優(yōu)條件下，蛋白酶活力為251.51 U/mL，約為優(yōu)化前（69.03 U/mL）的4倍，具有較大的蛋白酶潛在應(yīng)用價值。