腌菜中細(xì)菌多樣性研究及乳酸菌分離鑒定

尚雪嬌，代程洋，王玉榮，廖 華，張振東，郭 壯，3*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市農(nóng)業(yè)局，湖北 恩施 445000；3.恩施市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 恩施 445000）

恩施土家苗族自治州是由齊躍、巫山和武陵山脈等組成的山地，全州水資源豐富、森林覆蓋率高達(dá)71.2%，境內(nèi)生活著漢族、土家族和苗族等27個(gè)民族，有著制作和食用發(fā)酵蔬菜的習(xí)俗[1-2]。該地生產(chǎn)的腌菜主要以芥菜為原料，采用傳統(tǒng)手工技術(shù)將芥菜頭和部分芥菜葉露天晾曬至七成干后切丁、加適量鹽入壇腌漬而成。特殊的地理環(huán)境、開放的生產(chǎn)條件以及傳統(tǒng)的制作技術(shù)使得腌菜成品中保留了多種由環(huán)境和原料等因素引入的微生物。近年來研究人員對(duì)腌菜的微生物多樣性進(jìn)行了初步解析，張奶英等[3]采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）對(duì)四川葉用芥菜鹽漬過程中微生物多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中優(yōu)勢(shì)菌為鹽單胞菌（Halomonas sp.）、釀酒酵母（Saccharomy cerevisiae）和粘性紅圓酵母（Rhodotorulamucilaginosa）；鄧元源等[4]從福建省農(nóng)家自制腌菜中分離出3株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為短乳桿菌（Lactobacillusbrevi）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；林親錄等[5]從湖南省傳統(tǒng)發(fā)酵芥菜中分離出10株乳酸菌菌株，通過初步鑒定將其鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus），然而目前關(guān)于恩施地區(qū)腌菜中微生物多樣性的研究報(bào)道尚少。

高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）具有操作簡(jiǎn)單、通量高和檢測(cè)速度快的特點(diǎn)，且一次可對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行平行分析[6]，但因擴(kuò)增引物通用性高，導(dǎo)致專門針對(duì)某一個(gè)種屬的微生物群落進(jìn)行研究時(shí)其適用性較差[7]。在使用種屬特異性引物擴(kuò)增16SrRNA多變區(qū)基因序列的基礎(chǔ)上，使用DGGE技術(shù)可以完成腸道等復(fù)雜基質(zhì)中乳酸菌菌群群落結(jié)構(gòu)的研究工作[8]，具有操作簡(jiǎn)單易行、靈敏度高和可檢測(cè)到一個(gè)核苷酸水平的差異等優(yōu)點(diǎn)[9]。由此可見，將高通量測(cè)序和DGGE技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行發(fā)酵食品多樣性解析是可行的，且在窖泥[10]、豆醬[11]和腸道[12]細(xì)菌多樣性解析方面已得到了廣泛應(yīng)用。

因此，本研究采用MiSeq高通量測(cè)序與DGGE指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)采集自恩施土家苗族自治州的腌菜中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，并采用稀釋涂布平板法對(duì)其中所含乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定與保藏，為后續(xù)腌菜的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

腌菜樣品：采自恩施舞陽壩菜市場(chǎng)，3份，編號(hào)分別為YC01、YC02和YC03，每份分裝兩管。

1.1.2 試劑

聚丙烯酰胺、尿素、N,N-亞甲基二丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、乙醇、冰醋酸、甲醛、硝酸銀、碳酸鈣、丙三醇、過氧化氫、三氯甲烷、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鈣、十二烷基硫酸鈉、酚、氯仿、異戊醇、醋酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Axygen清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；溶菌酶（400 U/μg）、蛋白酶K（20 U/μg）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）mix、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）Buffer、r Taq酶（5 U/μL）、pMD18-T vector、Solution I：寶生物工程（大連）有限公司；10×Loading buffer、DL2000 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×PCRmix：南京諾唯贊生物科技有限公司；QIAGENDNeasymericon Food Kit提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 引物

高通量測(cè)序引物：正向引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）；反向引物806R（5′-GGACTACHVGGGT-3′）。

帶有GC夾子的PCR-DGGE正向引物L(fēng)ac-GC-V3F（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′），不帶GC夾子的PCR-DGGE正向引物L(fēng)ac-V3F（5′-ACCGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′）和PCR-DGGE反向引物L(fēng)ac-V3R（5′-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′）。

乳酸菌PCR擴(kuò)增引物：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）；反向引物1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）。

驗(yàn)證陽性克隆引物：正向引物M13F（5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）；反向引物M13R（5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′）。

以上引物均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

VeritiTM96孔梯度PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；DYY-12水平電泳儀：北京市六一儀器廠；DCodeTM System、UV PCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)BIO-RED公司；Bio-5000 plus掃描儀：上海中晶科技有限公司；DG250厭氧工作站：英國(guó)DWS公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；ECLIPSECi生物顯微鏡：日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

使用DNA提取試劑盒，按照試劑盒使用說明提取樣品基因組DNA，然后用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。

1.3.2 細(xì)菌多樣性分析

PCR擴(kuò)增及測(cè)序：PCR擴(kuò)增16SrRNA V3-V4區(qū)。PCR擴(kuò)增體系為5×FastPfu Buffer 4.0 μL，2.5mmol/L dNTPmix 2.0μL，5μmol/L的正（338F）反（806R）引物各0.8 μL，r Taq酶0.4μL，DNA模板10 ng，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)齊至20μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45 s，30次循環(huán)；72℃再延伸10 min[13]。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行MiSeq高通量測(cè)序。

序列質(zhì)量控制：參照文獻(xiàn)[14]中的方法對(duì)下機(jī)后的序列進(jìn)行拼接和質(zhì)量控制，對(duì)合格的序列進(jìn)行下一步分析。

序列分析：參照CAPORASOJG等[15-16]的方法使用QIIME數(shù)據(jù)分析平臺(tái)對(duì)質(zhì)控后的序列分別以100%和97%的相似度進(jìn)行序列劃分，從每個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）中選擇一條代表性序列與Greengenes和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)各分類水平信息。

1.3.3 乳酸菌指紋圖譜分析

PCR擴(kuò)增：將各樣品基因組DNA質(zhì)量濃度稀釋至20 ng/μL。PCR擴(kuò)增條件為10×PCRBuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTPmix（2.5 mmol/L）2.0 μL，Lac-GC-V3F（10 μmol/L）和Lac-V3R（10μmol/L）各0.5μL，r Taq酶0.2μL，DNA模板0.5μL，用ddH2O將體系補(bǔ)齊至25μL[17]。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min[18]。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的條帶。

DGGE檢測(cè)：聚丙烯酰胺凝膠變性劑變性范圍為35%～52%，上樣量為10μL，待0.5×三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（trisbase-acetic acid-ethylenediamine tetra acetic acid，TAE）制成的緩沖溶液溫度升至60℃時(shí)，調(diào)節(jié)電壓120 V運(yùn)行78 min，然后80 V維持13 h。電泳結(jié)束后，待緩沖溶液冷卻至室溫采用銀染法使凝膠顯色。

條帶回收測(cè)序：將顯色后的凝膠置于掃描儀上掃描成像，標(biāo)記特征條帶并用手術(shù)刀切下分別置于無菌EP管中，添加50μL無菌超純水，4℃靜置過夜，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為2×PCRmix 12.5μL，引物L(fēng)ac-V3F和Lac-V3R各0.5μL，DNA模板2.0μL，無菌超純水補(bǔ)齊至25μL。PCR擴(kuò)增程序及檢測(cè)方法同方法1.3.3。參照樊哲新等[19]的方法對(duì)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔、連接pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichiacoli）Top10以及鑒定陽性克隆。將陽性克隆寄至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)回的序列用DNAMAN軟件處理后置于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行比對(duì)，選取同源性較高的菌株，利用MEGA軟件中的鄰近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 乳酸菌的分離鑒定

分離：采用稀釋涂布平板法分別將3個(gè)樣品稀釋至10-6和10-7梯度，然后取100μL稀釋液涂布于含1.0%CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站中，37℃培養(yǎng)48 h后，挑選周圍有透明圈的單菌落純化2～3代，鏡檢合格后甘油保藏。

鑒定：對(duì)分離出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色以及過氧化氫酶試驗(yàn)；參照文獻(xiàn)[20]中的方法提取乳酸菌DNA，然后以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件和程序以及鑒定方法同1.3.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 序列豐富度分析

采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析細(xì)菌多樣性時(shí)，在100%相似度下共測(cè)得42954條序列，平均每個(gè)樣品14318條序列；在97%的相似度下又可將這些序列劃分成4 347個(gè)OTU，現(xiàn)對(duì)平均相對(duì)含量＞0.1%的OTU進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，平均相對(duì)含量＞0.1%的OTU有36個(gè)，其中OTU1168、OTU1427和OTU4213的平均相對(duì)含量明顯高于其他OTU，且這3個(gè)OTU在腌菜樣品YC01中的相對(duì)含量分別為71.16%、7.55%和0.33%；在腌菜樣品YC02中的相對(duì)含量分別依次為68.40%、0和2.20%；在腌菜樣品YC03中的相對(duì)含量分別為53.19%、0.08%和1.46%。將OTU1168的代表性序列分別在Greengenes和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，均將該序列鑒定為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。由此可見，恩施地區(qū)腌菜樣品中存在大量共有細(xì)菌菌群，且乳酸桿菌可能為其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。

圖1 核心OTUs相對(duì)含量分析Fig.1 Relative abundance analysis of core OTUs

2.1.2 α多樣性分析

在測(cè)序深度為28910條序列的條件下，對(duì)腌菜樣品YC01、YC02和YC03進(jìn)行α多樣性分析。YC01、YC02和YC03的超1（Chao1）指數(shù)分別為700、837和983，香農(nóng)（Shannon）指數(shù)分別為2.98、2.42和4.34，由此可見，腌菜樣品YC03中的細(xì)菌豐富度和多樣性要高于YC01和YC02。

2.1.3 優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)含量分析

經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)腌菜樣品中共檢測(cè)到10個(gè)門、24個(gè)綱、43個(gè)目、72個(gè)科和120個(gè)屬的細(xì)菌，所有樣品僅有2.68%的序列不能鑒定到屬水平。將平均相對(duì)含量＞0.1%的細(xì)菌門定義為優(yōu)勢(shì)菌門，優(yōu)勢(shì)菌門在各樣品中的分布情況如圖2所示。

圖2 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門相對(duì)含量分析Fig.2 Relative abundance analysis of dominant bacteria phyla

由圖2可知，腌菜樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）。所有腌菜樣品中含量最高的均為Firmicutes，其平均相對(duì)含量達(dá)97.09%；其次為Proteobacteria，平均相對(duì)含量為2.02%。腌菜樣品YC01、YC02和YC03中鑒定出的細(xì)菌屬數(shù)量分別為54個(gè)、95個(gè)和73個(gè)，各樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)含量如圖3所示。

圖3 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量分析Fig.3 Relative abundance analysis of dominant genus of bacteria

由圖3可知，平均相對(duì)含量＞0.1%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有7個(gè)，即乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、弧菌屬（Vibrio）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和黃桿菌屬（Flavobacterium），其平均相對(duì)含量分別為82.37%、7.02%、5.38%、0.58%、0.27%、0.15%和0.14%。王一淇等[21]通過采用純培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法對(duì)湖南芥菜腌制發(fā)酵過程中的菌相變化規(guī)律進(jìn)行了解析，結(jié)果表明，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）在芥菜自然發(fā)酵的中期和后期都占主要優(yōu)勢(shì)，這與本研究結(jié)果有相似之處。

2.2 乳酸菌指紋圖譜分析

經(jīng)高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus在樣品中的平均相對(duì)含量達(dá)82.37%，是恩施腌菜樣品中平均相對(duì)含量最高的細(xì)菌屬，本研究進(jìn)一步采用DGGE指紋圖譜技術(shù)對(duì)樣品中Lactobacillus的種類及其在各樣品間的差異進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乳酸菌的DGGE指紋圖譜Fig.4 DGGE fingerprint of lactic acid bacteria

由圖4可知，在DGGE指紋圖譜上每個(gè)樣品都檢測(cè)出數(shù)目不等的條帶。其中條帶LYC3和LYC4為腌菜樣品中共有條帶，而條帶LYC1為腌菜樣品YC03中特有條帶，條帶LYC5為腌菜樣品YC01中特有條帶，條帶LYC2為腌菜樣品YC01和YC03共有條帶，這說明恩施腌菜中含有多種共有乳酸桿菌，同時(shí)各樣品中也含有特有細(xì)菌菌群。腌菜樣品YC03泳道中的條帶數(shù)量及條帶明亮度高于腌菜樣品YC01和YC02泳道，說明腌菜樣品YC03中的乳酸菌的豐度較腌菜樣品YC01和YC02中的高，這與高通量測(cè)序結(jié)果一致。將回收條帶的測(cè)序結(jié)果與NCBI中的模式株比對(duì)，結(jié)果如表1所示。

表1 乳酸菌PCR-DGGE優(yōu)勢(shì)條帶比對(duì)結(jié)果Table 1 Comparison results of dominant band of lactic acid bacteria by PCR-DGGE

由表1所知，回收的優(yōu)勢(shì)條帶中有4條隸屬于乳酸桿菌屬，其中LYC1為清酒乳桿菌（L.sakei），LYC2為L(zhǎng).insicii，LYC3為L(zhǎng).plantarum subsp.argentoratensis，LYC4為植物乳桿菌植物亞種（L.plantarum subsp.plantarum），LYC5為耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）。

2.3 乳酸菌的分離鑒定

通過稀釋涂布平板法從3個(gè)腌菜樣品中分離出15株菌，編號(hào)分別為YC01-1、YC01-2、YC01-3、YC01-4、YC02-1、YC02-2、YC02-3、YC02-4、YC02-5、YC03-1、YC03-2、YC03-3、YC03-4、YC03-5和YC03-6，經(jīng)生理生化試驗(yàn)得出，15株菌株革蘭氏染色為陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)檢測(cè)為陰性，16SrRNA鑒定序列與最似模式菌菌株的相似度均在99%以上。乳酸菌菌株與模式株的進(jìn)化關(guān)系如圖5所示。

圖5 乳酸菌基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rRNA sequences

由圖5可知，經(jīng)鑒定及比對(duì)發(fā)現(xiàn)這些菌株主要為植物乳桿菌（L.plantarum）、短乳桿菌（L.brevi s）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）、消化乳桿菌（L.alimentarius）和清酒乳桿菌（L.sakei）。進(jìn)一步對(duì)各菌株在樣品中的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示。

表2 各腌菜樣品中乳酸菌菌株的種類和數(shù)量Table 2 Species and quantities of lactic acid bacteria strains in each pickle sample

由表2可知，從腌菜樣品YC01共分離出4株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為L(zhǎng).plantarum、L.curvatus和L.brevi s；從腌菜樣品YC02中共分離出5株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為L(zhǎng).plantarum和L.sakei；從腌菜樣品YC03中分離出6株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為L(zhǎng).plantarum和L.alimentarius。由此可見，雖然Lactobacillus為腌菜樣品中的優(yōu)勢(shì)菌，但乳酸桿菌的構(gòu)成在樣品間存在一定的差異。值得一提的是，腌菜樣品YC02中的5株乳桿菌中有4株為L(zhǎng).sakei，有研究表明，該菌能產(chǎn)生多種細(xì)菌素，其中I類、部分IIa和IIb類清酒乳桿菌細(xì)菌素均具有一定的抑菌作用[22]，這可能是導(dǎo)致腌菜樣品YC02中細(xì)菌豐度低于其他樣品的原因之一。此外，采用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段從樣品中分離出15株隸屬于5個(gè)種的乳酸菌，但未分離出DGGE檢測(cè)到的L.insicii和L.acetotolerans，這可能與微生物特殊生長(zhǎng)需求以及培養(yǎng)條件的限制有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究采用MiSeq高通量測(cè)序和DGGE技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)采集自恩施地區(qū)的3份腌菜樣品中細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果表明，腌菜樣品中含量最高的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為硬壁菌門（Firmicutes），優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus、Weissella、Leuconostoc、Vibrio、Pseudomonas、Psychrobacter和Flavobacterium，雖然Lactobacillus為恩施腌菜中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬且平均相對(duì)含量高達(dá)82.37%，但不同腌菜樣品間乳酸菌的種類存在較大差異。

DGGE測(cè)定結(jié)果表明，腌菜中含有L.sakei、L.insicii、L.plantarum subsp.argentoratensis、L.plantarum subsp.plantarum和L.acetotolerans。

經(jīng)稀釋涂布平板法從腌菜中共分離到15株乳酸菌，包括L.plantarum7株、L.alimentarius 2株、L.curvatus和L.brevi s各1株以及L.sakei4株。