皰疹病毒的示蹤技術(shù)：看到了什么？還能看到什么？

王亞林，仇華吉，孫元

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皰疹病毒的示蹤技術(shù)：看到了什么？還能看到什么？

王亞林，仇華吉，孫元

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069

王亞林, 仇華吉, 孫元. 皰疹病毒的示蹤技術(shù)：看到了什么？還能看到什么？生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(11): 1721–1733.Wang YL, Qiu HJ, Sun Y. Tracking of herpesviruses: what have been seen and will be seen? Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1721–1733.

病毒感染宿主細(xì)胞是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，涉及病毒與多種宿主成分的相互作用。目前通過可視化病毒示蹤技術(shù)可對(duì)病毒復(fù)制周期的各個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)、原位觀察。皰疹病毒是一類有囊膜的DNA病毒，在自然界中廣泛存在，對(duì)人類和動(dòng)物健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。文中綜述了病毒示蹤技術(shù)在皰疹病毒研究中的應(yīng)用。這些研究為認(rèn)識(shí)皰疹病毒的感染、復(fù)制機(jī)制以及病毒與宿主相互作用的過程開拓了新的視野。但該技術(shù)還不是十分完善，包括標(biāo)記物最佳插入位點(diǎn)的選擇、無法示蹤病毒生命周期的全過程等。相信隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，會(huì)實(shí)現(xiàn)對(duì)皰疹病毒復(fù)制周期更加詳細(xì)地追蹤，從而更為詳盡地揭示其復(fù)制機(jī)制。

病毒示蹤技術(shù)，皰疹病毒，熒光蛋白，復(fù)制，潛伏感染，軸突轉(zhuǎn)運(yùn)

病毒是在普通光學(xué)顯微鏡下不可見的依賴活細(xì)胞寄生的微生物。病毒廣泛存在，可以感染自然界已知的所有生命體。許多病毒能造成人類的嚴(yán)重疾病，如近年來的SARS-CoV、H5N1亞型高致病性禽流感病毒、H1N1甲型流感病毒等曾大規(guī)模流行，造成全球恐慌。因此，人類必須加強(qiáng)病毒學(xué)研究，尋找攻克病毒病的方法，這就必須深入探究病毒感染宿主的詳細(xì)機(jī)制。傳統(tǒng)的研究方法無法直觀地研究病毒在活細(xì)胞內(nèi)的感染行為，但是在給病毒標(biāo)記上熒光標(biāo)簽之后，就能使病毒的感染過程可視化，即病毒示蹤技術(shù)。

示蹤技術(shù)是利用放射性或非放射性的標(biāo)記物在體內(nèi)或體外跟蹤其行徑、轉(zhuǎn)變和代謝等過程的技術(shù)。而病毒示蹤技術(shù)，即利用標(biāo)記物標(biāo)記病毒，從而追蹤其在細(xì)胞或宿主體內(nèi)的復(fù)制、擴(kuò)散等生命活動(dòng)的示蹤技術(shù)。而這一技術(shù)更是得益于綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和其他熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與改造，科學(xué)家們研發(fā)了多種新型的病毒示蹤策略，為生物醫(yī)學(xué)研究作出了巨大貢獻(xiàn)。

病毒示蹤技術(shù)實(shí)現(xiàn)了病毒感染的可視化，即“看得見”的病毒感染。這使得人類對(duì)病毒感染的微觀世界有了更加直觀的認(rèn)識(shí)。病毒感染宿主細(xì)胞是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，包含黏附、入侵、復(fù)制、包裝以及釋放等多個(gè)步驟，而且還涉及病毒與細(xì)胞內(nèi)多種組分的復(fù)雜相互作用。傳統(tǒng)的技術(shù)無法直觀地研究活細(xì)胞中的病毒感染過程。而病毒示蹤技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)、原位地研究病毒在活細(xì)胞內(nèi)的感染行為[1-2]。

1 皰疹病毒的示蹤技術(shù)

皰疹病毒是一類有囊膜的DNA病毒，分為α皰疹病毒、β皰疹病毒、γ皰疹病毒以及其他皰疹病毒。其中有代表性的α皰疹病毒包括能夠感染人類的單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus type 1/2，HSV-1/2)、水痘帶狀皰疹病毒 (Varicella-zoster virus，VZV) 以及感染動(dòng)物的偽狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)、雞馬立克氏病病毒 (Marek’s disease virus，MDV) 等。β皰疹病毒主要有人類的巨細(xì)胞病毒 (Human cytomegalovirus，HCMV)[3]。病毒示蹤技術(shù)很早就已經(jīng)應(yīng)用于皰疹病毒的研究當(dāng)中，隨著示蹤技術(shù)的發(fā)展和高敏感度熒光蛋白的衍生，多種熒光蛋白已經(jīng)用于標(biāo)記皰疹病毒，從而研究皰疹病毒的復(fù)制周期及其與宿主細(xì)胞的相互作用。

病毒示蹤劑的標(biāo)記方法繁多，主要包括基因工程技術(shù)標(biāo)記、化學(xué)反應(yīng)法標(biāo)記以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)記等[1,4-5]。相應(yīng)的病毒示蹤劑包括熒光蛋白、肽/蛋白標(biāo)簽、有機(jī)染料、量子點(diǎn)以及熒光素酶等，這些標(biāo)記方法和示蹤劑同樣適用于皰疹病毒的示蹤。

自20世紀(jì)60年代初發(fā)現(xiàn)GFP以來，熒光蛋白在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中獲得了廣泛應(yīng)用。研究者利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一系列能夠表達(dá)熒光蛋白的生物有機(jī)體，包括病毒、細(xì)菌、酵母、寄生蟲以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等，然后通過光學(xué)成像技術(shù)可以直接觀察到從微觀到宏觀各個(gè)層次上豐富多彩的生命現(xiàn)象[6]。肽/蛋白標(biāo)簽多為人工改造的多肽或酶，其本身不具有熒光特性，但可通過與熒光標(biāo)記的特異性識(shí)別分子或底物之間的化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)肽/蛋白標(biāo)簽?zāi)康牡鞍椎臉?biāo)記[7-8]。這一類的病毒示蹤劑有HaloTag蛋白標(biāo)簽以及利用脊髓灰質(zhì)炎病毒等腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C構(gòu)建的一系列Flag-2C肽標(biāo)簽等[2,9]。有機(jī)熒光染料大多是含有共軛雙鍵、苯環(huán)的小分子化合物，具有分子量小、種類繁多等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于熒光成像領(lǐng)域。如利用Cy5染料標(biāo)記腺病毒衣殼，闡明了其感染機(jī)制[10]。DiO是一種脂質(zhì)染料，可標(biāo)記病毒包膜，通過觀測(cè)熒光強(qiáng)度的變化研究病毒的感染過程[11]。量子點(diǎn) (Quantum dot，QD) 是一種新型納米材料，具有熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于活細(xì)胞標(biāo)記、免疫標(biāo)記及活體成像等研究領(lǐng)域。Li等通過共價(jià)結(jié)合將量子點(diǎn)嵌入人類免疫缺陷病毒1型 (Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) 的衣殼內(nèi)，利用單顆粒示蹤技術(shù)揭示了HIV-1是通過內(nèi)吞的方式入侵巨噬細(xì)胞的[1]。熒光素酶是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱，通過與相應(yīng)底物發(fā)生氧化反應(yīng)而產(chǎn)生生物冷光[12]，包括最常用的螢火蟲熒光素酶 (Firefly luciferase)、海腎熒光素酶 (luciferase)、熒光素酶以及NanoLuc熒光素酶等[12-15]。利用熒光素酶標(biāo)記的病毒感染動(dòng)物或細(xì)胞后，可通過注射或加入底物的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒感染的體內(nèi)外示蹤，已在病毒感染的相關(guān)研究中獲得了廣泛應(yīng)用[16-18]。圖1展示了熒光標(biāo)記物在示蹤技術(shù)中的應(yīng)用。

基因工程標(biāo)記法是皰疹病毒示蹤技術(shù)中常用的標(biāo)記方法之一，具有穩(wěn)定性高、定位準(zhǔn)確、可縮短曝光時(shí)間等優(yōu)勢(shì)。利用熒光蛋白標(biāo)記皰疹病毒時(shí)，即使標(biāo)記物和病毒蛋白的詳細(xì)結(jié)構(gòu)是已知的，我們也無法預(yù)測(cè)其融合蛋白的精確結(jié)構(gòu)。因此，構(gòu)建一株功能完善的表達(dá)熒光蛋白的重組病毒仍然是一個(gè)充滿不確定性、需要反復(fù)試驗(yàn)的過程。皰疹病毒在結(jié)構(gòu)上具有一定的共性，這使得熒光蛋白在皰疹病毒基因組中的插入位點(diǎn)具有普適性。例如UL35基因是熒光蛋白的常用插入位點(diǎn)，曾有文獻(xiàn)報(bào)道在HSV-1、PRV的該位點(diǎn)插入熒光蛋白的實(shí)例[4,23]。圖2展示了本研究團(tuán)隊(duì)在PRV不同位點(diǎn)插入紅色和綠色熒光蛋白的重組病毒感染小鼠背根神經(jīng)節(jié) (Dorsal root ganglions，DRGs) 中的神經(jīng)元和豬腎上皮細(xì)胞 (PK-15) 后熒光蛋白的表達(dá)情況。表1列出了一些目前報(bào)道的皰疹病毒中熒光蛋白的插入位點(diǎn)。

2 病毒示蹤技術(shù)在皰疹病毒研究中的應(yīng)用

可視化病毒示蹤技術(shù)因其方便、快速并能實(shí)時(shí)定位病毒感染等優(yōu)點(diǎn)而獲得了廣泛的應(yīng)用，在皰疹病毒的研究中也不例外。此外，α皰疹病毒具有嗜神經(jīng)性和在神經(jīng)細(xì)胞中傳導(dǎo)的特性。因此，可視化病毒示蹤技術(shù)也促進(jìn)了神經(jīng)解剖學(xué)和病毒神經(jīng)傳導(dǎo)方面的研究。

圖1 不同的熒光標(biāo)記物在生物示蹤技術(shù)中的應(yīng)用 (改編自參考文獻(xiàn)[19–22])

圖2 綠色或紅色熒光蛋白標(biāo)記的PRV感染神經(jīng)元和PK-15細(xì)胞后的熒光蛋白表達(dá)情況

表1 熒光蛋白與皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白融合表達(dá)的實(shí)例 (改編自參考文獻(xiàn)[6])

2.1 在病毒入侵、復(fù)制和釋放相關(guān)研究中的應(yīng)用

Liu等利用轉(zhuǎn)座的原理將HaloTag蛋白標(biāo)簽成功插入到PRV基因組中，使HaloTag與VP26融合表達(dá)，產(chǎn)生重組病毒rPRV-HT。病毒感染細(xì)胞之后，可以通過不同的HaloTag配體使重組病毒產(chǎn)生不同顏色的熒光，從而區(qū)別親本病毒和子代病毒，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒黏附、衣殼入侵以及子代病毒釋放的可視化。結(jié)合單顆粒示蹤技術(shù)，最終揭示了PRV生命周期的機(jī)制，獲得了病毒入侵和復(fù)制過程的全局圖像數(shù)據(jù)[2]。

皰疹病毒在宿主細(xì)胞的核內(nèi)復(fù)制，最終形成相似的病毒粒子結(jié)構(gòu)。病毒基因組由核孔入核，首先表達(dá)IE蛋白 (Immediate-early proteins)，從而調(diào)控E蛋白 (Early proteins) 的表達(dá)，最終起始病毒基因組在復(fù)制區(qū)室 (Replication compartments，RCs) 的復(fù)制[46]。通過熒光蛋白標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)病毒復(fù)制組裝中間體形成過程的可視化，進(jìn)而揭示病毒復(fù)制和組裝的詳細(xì)過程[47]。在病毒入侵的每個(gè)細(xì)胞中，僅有限數(shù)量的基因組獲得表達(dá)，而且只有這些基因組進(jìn)行復(fù)制并包裝成病毒粒子[48]。Kobiler等利用分別與PRV VP26融合表達(dá)紅色熒光蛋白 (Red fluorescent protein，RFP)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (Enhanced green fluorescent protein，EGFP)、藍(lán)綠色熒光蛋白 (Cyan fluorescent protein，CFP) 的3株重組病毒研究發(fā)現(xiàn)，每個(gè)RC起源于單個(gè)病毒基因組，且每個(gè)細(xì)胞中僅有少于7個(gè)的病毒基因組可以進(jìn)行復(fù)制[48]。

新合成病毒粒子的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過程，涉及病毒組分與宿主膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的協(xié)同作用。衣殼和病毒基因組在細(xì)胞核內(nèi)組裝之后，通過出芽方式穿過內(nèi)外核膜離開細(xì)胞核[49]。分泌途徑中產(chǎn)生的病毒膜蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至二次包膜 (Secondary envelopment) 部位，目前認(rèn)為這種包膜是轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基體膜和/或內(nèi)體膜[50-51]。病毒顆粒通過出芽的方式獲得其囊膜，在細(xì)胞內(nèi)囊泡中產(chǎn)生有囊膜的病毒粒子。之后這種含病毒粒子的轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡被運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)膜，病毒粒子通過胞吐方式離開感染的細(xì)胞[36]。關(guān)于病毒釋放過程的這些描述雖然被廣泛接受，但涉及具體機(jī)制的相關(guān)研究還不夠充分。Hogue等利用pH敏感型的GFP與病毒gM蛋白融合表達(dá)的重組PRV毒株，通過單顆粒示蹤技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒釋放過程的可視化[36]。

Scherer等利用一株能夠穩(wěn)定表達(dá)PRV mNG-VP26融合蛋白的PK-15細(xì)胞系和能夠表達(dá)VP26-RFP融合蛋白的重組PRV構(gòu)建了一個(gè)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)構(gòu)建的重組病毒命名為PRV180G，該重組病毒的衣殼能同時(shí)表達(dá)綠色和紅色熒光蛋白。重組病毒在神經(jīng)元細(xì)胞中感染并復(fù)制之后，所有的PRV180G子代病毒都僅含有mRFP-VP26標(biāo)記的衣殼。Scherer等利用PRV180G來分析外周神經(jīng)元軸突中PRV衣殼的轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，在病毒入侵時(shí)，胞漿動(dòng)力蛋白 (Dynein) 和驅(qū)動(dòng)蛋白 (Kinesin) 都可介導(dǎo)衣殼的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，而且轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)比較活躍，而在子代病毒釋放時(shí)，衣殼的轉(zhuǎn)運(yùn)僅由驅(qū)動(dòng)蛋白介導(dǎo)[5]。

2.2 在病毒潛伏感染研究中的應(yīng)用

皰疹病毒能在其宿主的特定細(xì)胞內(nèi)建立并維持長(zhǎng)期的潛伏感染[52]。潛伏感染的特征是僅表達(dá)有限數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本——潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本 (Latency- associated transcripts，LATs)，且不會(huì)合成子代病毒[53-55]。潛伏感染的建立、維持和再激活需要多種病毒和細(xì)胞蛋白的協(xié)同作用。

Koyuncu等利用表達(dá)單體紅色熒光蛋白的PRV對(duì)神經(jīng)元的感染模式進(jìn)行了研究。利用經(jīng)元三室神培養(yǎng)系統(tǒng)將神經(jīng)元胞體和軸突在分隔的不同區(qū)室中培養(yǎng)。以不同感染復(fù)數(shù) (Multiplicity of infection，MOI) 的重組病毒感染軸突區(qū)室時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MOI低于0.1時(shí)，傳導(dǎo)至神經(jīng)核的病毒基因組是“靜止”的，即建立了潛伏感染，而且這些“靜止”的基因組可以被復(fù)制缺陷型的PRV再激活。最終結(jié)果表明感染劑量的不同和感染環(huán)境的多樣性對(duì)于神經(jīng)元中的感染狀態(tài) (復(fù)制或潛伏感染) 具有決定性的影響[56]。

α皰疹病毒潛伏感染時(shí)，病毒基因組僅限于表達(dá)LATs。HSV-1的全長(zhǎng)LAT長(zhǎng)約8.3 kb，可被剪接為穩(wěn)定的1.5 kb和2 kb的內(nèi)含子，以及6.3 kb的LAT外顯子，6.3 kb的外顯子最終被加工成一系列microRNAs[57]。已經(jīng)證實(shí)LATs和相關(guān)的microRNAs能夠在體外限制HSV-1 IE基因 (Immediate-early gene) 的表達(dá)[58-59]，并能限制小鼠模型中病毒復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[60-61]。Michael等利用一系列表達(dá)GFP和螢火蟲熒光素酶 (Firefly luciferase) 的重組HSV-1毒株，結(jié)合體內(nèi)和體外試驗(yàn)證明，LATs可以抑制病毒復(fù)制相關(guān)基因的表達(dá)，并能抑制神經(jīng)元中潛伏感染的病毒基因組的再激活[57]。

HCMV在人群中的感染率極高，可達(dá)90%以上，并可對(duì)免疫缺陷患者造成嚴(yán)重的后果[62]。目前已在不同類型細(xì)胞上建立了HCMV潛伏感染模型，包括造血干細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，但神經(jīng)細(xì)胞潛伏感染模型鮮有報(bào)道[63-64]。Cheng等利用一株表達(dá)GFP的HCMV作為指示病毒，成功在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G細(xì)胞系中建立了潛伏感染模型，為研究HCMV引起的神經(jīng)退行性后遺癥奠定了基礎(chǔ)[65]。

2.3 在病毒神經(jīng)傳導(dǎo)研究中的應(yīng)用

很多病毒可以感染神經(jīng)細(xì)胞，但只有少數(shù)病毒可以跨突觸傳播：如水泡性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus，VSV)、狂犬病病毒 (Rabies virus，RV) 以及α皰疹病毒。神經(jīng)傳導(dǎo)需要病毒入侵神經(jīng)元 (第一級(jí)神經(jīng)元) 并進(jìn)行復(fù)制，然后將包裝的病毒基因組在突觸連接部位或其附近轉(zhuǎn)運(yùn)到第二級(jí)神經(jīng)元進(jìn)行再次復(fù)制。這種自我擴(kuò)增的特性使得第一級(jí)、第二級(jí)和第三級(jí)神經(jīng)元都能被標(biāo)記[66]。圖3是皰疹病毒在神經(jīng)軸突中逆行傳導(dǎo)后建立潛伏感染的示意圖[56]。

PRV感染神經(jīng)元需要病毒粒子沿著長(zhǎng)距離軸突的雙向運(yùn)輸[3,67]。病毒入侵外周神經(jīng)元的軸突末端，并逆行運(yùn)輸至神經(jīng)元胞體而建立潛伏感染。潛伏狀態(tài)的病毒被再激活時(shí)，新合成的病毒粒子沿著軸突順行傳導(dǎo)至外周[3]。PRV高度保守的US9蛋白是病毒在體內(nèi)外順行傳導(dǎo)所必需的[34]。在通過軸突運(yùn)輸之前，PRV核衣殼與內(nèi)膜蛋白形成的病毒粒子前體通過二次包膜過程納入由轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基體衍生出的囊泡中。這一過程產(chǎn)生的病毒顆粒同時(shí)含有病毒和宿主的膜蛋白[3]。Taylor等利用US9-GFP融合表達(dá)的重組PRV感染大鼠頸上神經(jīng)節(jié)中的原代神經(jīng)細(xì)胞，通過活細(xì)胞的實(shí)時(shí)成像證實(shí)，US9-GFP能夠與在軸突中順行傳導(dǎo)的病毒顆粒共轉(zhuǎn)運(yùn)[37]。若缺失US9，病毒顆?？梢栽谏窠?jīng)元胞體中組裝，但不能在軸突中運(yùn)輸[68]。綜合這些研究結(jié)果，說明US9是利用一些未知的病毒或宿主蛋白介導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)病毒粒子轉(zhuǎn)運(yùn)的。Kramer等利用質(zhì)譜法鑒定了與US9-GFP相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)KIF1A能與US9-GFP相互作用。KIF1A是宿主的一種微管依賴性驅(qū)動(dòng)蛋白 (Kinesin)，在軸突其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要的作用[69-70]。KIF1A與病毒顆粒共轉(zhuǎn)運(yùn)，且對(duì)KIF1A的顯性位點(diǎn)失活突變后可干擾病毒顆粒的順行傳導(dǎo)[45]。這些研究結(jié)果表明，PRV能夠有效利用宿主神經(jīng)元內(nèi)軸突的運(yùn)輸機(jī)制在宿主體內(nèi)進(jìn)行傳播。

圖3 α皰疹病毒擴(kuò)散到外周神經(jīng)系統(tǒng)并建立潛伏感染的示意圖 (改編自參考文獻(xiàn)[56])

2.4 在神經(jīng)通路示蹤研究中的應(yīng)用

皰疹病毒在神經(jīng)通路示蹤方面的應(yīng)用主要包括探究外周神經(jīng)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)間的聯(lián)系通路和CNS內(nèi)局部環(huán)路兩方面。此外，皰疹病毒作為神經(jīng)通路示蹤劑的優(yōu)勢(shì)是其能夠在神經(jīng)環(huán)路中復(fù)制，因此可以放大示蹤信號(hào)，增加示蹤的靈敏度。PRV通常作為逆向的神經(jīng)示蹤劑揭示傳入神經(jīng)通路[71]。Krout等利用GFP與β半乳糖苷酶 (β-gal) 標(biāo)記的PRV對(duì)中樞神經(jīng)的神經(jīng)元的功能進(jìn)行了研究。將GFP-PRV注射入星狀神經(jīng)節(jié)，將β-gal-PRV注射入初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層，通過鑒定雙標(biāo)記的神經(jīng)元，揭示了中樞神經(jīng)元可能支配的神經(jīng)通路[72]。而HSV-1通常作為順行的神經(jīng)環(huán)路示蹤劑揭示傳出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[73-74]。Zeng等利用細(xì)菌人工染色體 (BAC) 技術(shù)構(gòu)建了能夠同時(shí)表達(dá)4個(gè)GFP分子的HSV-1 H129株，高熒光強(qiáng)度使其能夠有效標(biāo)記神經(jīng)元并對(duì)其詳細(xì)形態(tài)學(xué)實(shí)現(xiàn)可視化，包括對(duì)樹突、棘突和軸突纖維的可視化。將基因敲除后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)突觸的示蹤，通過對(duì)神經(jīng)環(huán)路細(xì)節(jié)的可視化以及對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)記，有助于提升我們對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，也為研究神經(jīng)退行性腦疾病提供了參考和借鑒意義[75]。

2.5 PRV報(bào)告病毒在示蹤技術(shù)中的系統(tǒng)應(yīng)用

國(guó)際著名皰疹病毒學(xué)家Enquist的團(tuán)隊(duì)在近20年的研究中，以PRV為模型，構(gòu)建了一系列表達(dá)不同熒光蛋白的重組報(bào)告病毒，并且利用這些報(bào)告病毒對(duì)PRV感染宿主的過程進(jìn)行了示蹤，進(jìn)而揭示了病毒的復(fù)制、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)以及釋放等過程的詳細(xì)機(jī)制，同時(shí)闡明了α皰疹病毒潛伏感染、在神經(jīng)軸突中傳導(dǎo)的相關(guān)機(jī)制以及宿主神經(jīng)通路的結(jié)構(gòu)[45,56,67,76]。他們?cè)诓《净蚪M的不同位點(diǎn) (gM、gG、US9、UL35等) 插入不同的熒光蛋白 (GFP、YFP、RFP、mCherry、mNeonGreen等) 構(gòu)建了一系列示蹤病毒，為人類皰疹病毒示蹤的相關(guān)研究提供了重要參考[4,36,77]。

Enquist等以PRV Bartha株為骨架，利用Cre-Lox重組系統(tǒng)獲得的PRV-267和PRV-263，在感染同一個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)，由于發(fā)生不同的重組而產(chǎn)生不同的報(bào)告子表型，從而產(chǎn)生表達(dá)不同熒光的病毒，利用這兩株病毒對(duì)大鼠腦干髓質(zhì)區(qū)神經(jīng)回路進(jìn)行了分析[76]。他們也分別以PRV Becker和PRV 180 (RFP與病毒小衣殼蛋白VP26融合表達(dá)) 為骨架，在囊膜蛋白gM之后插入pH敏感型的綠色熒光蛋白pHluorin，獲得重組病毒PRV 486和PRV 483，利用這一系列報(bào)告病毒并基于相關(guān)研究基礎(chǔ)，Enquist等建立了α皰疹病毒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)以及由胞吐作用介導(dǎo)的釋放的完整模型[36]，并闡明了病毒顆粒、L-顆粒 (僅含有衣殼、外膜蛋白或囊膜蛋白，無病毒核酸) 以及糖蛋白的分泌機(jī)制[78]。

2.6 雙熒光標(biāo)記在皰疹病毒示蹤技術(shù)中的應(yīng)用

與單獨(dú)的熒光蛋白標(biāo)記相比，雙色熒光蛋白標(biāo)記在研究病毒感染機(jī)制以及病毒與宿主相互作用中更具優(yōu)勢(shì)?？梢酝ㄟ^同時(shí)標(biāo)記病毒衣殼、外膜或囊膜實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒粒子的雙色標(biāo)記[79]；也可通過標(biāo)記病毒粒子，利用熒光補(bǔ)充型細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)雙色標(biāo)記[5]；此外，還可以利用示蹤劑與不同配體的相互作用實(shí)現(xiàn)雙色甚至多色標(biāo)記[2]。

Enquist等利用雙色標(biāo)記的PRV實(shí)現(xiàn)了對(duì)皰疹病毒在軸突內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)態(tài)的追蹤，闡明了不同的運(yùn)輸?shù)鞍讓?duì)親代和子代病毒粒子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[5]。Kerstin等分別利用EGFP和mCherry標(biāo)記了HCMV的內(nèi)膜蛋白pp150和囊膜蛋白gM，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HCMV感染的雙色示蹤，揭示了其入侵機(jī)制[79]。

圖4系統(tǒng)展示了病毒示蹤技術(shù)在皰疹病毒相關(guān)研究中的應(yīng)用。

圖4 病毒示蹤技術(shù)在皰疹病毒研究中的應(yīng)用 (改編自參考文獻(xiàn)[2,56])

3 皰疹病毒示蹤技術(shù)的發(fā)展前景

自病毒示蹤技術(shù)應(yīng)用到皰疹病毒的研究中以來，一個(gè)個(gè)難題得以攻克。然而，關(guān)于病毒生命周期、病毒與宿主相互作用等方面依然存在很多未闡明的機(jī)制。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展、更加靈敏的新的熒光蛋白的合成、高效監(jiān)測(cè)儀器的發(fā)明，相信我們未來依然會(huì)利用其解決更多的科學(xué)問題。

例如，Kobiler等利用表達(dá)RFP、EGFP、CFP三種熒光蛋白的重組PRV研究發(fā)現(xiàn)，皰疹病毒的RC起源于單個(gè)病毒基因組，且每個(gè)細(xì)胞中僅有極少數(shù)的病毒基因組可以啟動(dòng)復(fù)制[48]。但他們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)部分RC來源于2個(gè)病毒基因組，將這種RC稱為“雙基因組RC”。對(duì)于這一現(xiàn)象有3種解釋：一是發(fā)生了病毒的重組；二是這種“雙基因組RC”事實(shí)上來源于單個(gè)基因組，只是在一個(gè)基因組復(fù)制的過程中，鄰近的基因組與其復(fù)制不同步，從而只檢測(cè)到一個(gè)RC；第三種可能性是“雙基因組RC”可能是獨(dú)立形成的兩個(gè)RC的重疊[80]。因此，假設(shè)利用病毒示蹤技術(shù)對(duì)單個(gè)基因組進(jìn)行標(biāo)記，然后持續(xù)監(jiān)測(cè)到其形成RC，這樣的實(shí)時(shí)活細(xì)胞可視化模型可以解決這一問題，從而對(duì)RC的形成過程進(jìn)行可視化的監(jiān)測(cè)。

PRV囊膜蛋白US9通過募集驅(qū)動(dòng)蛋白KIF1A參與順行神經(jīng)傳導(dǎo)[45]。但是，KIF1A與US9相互作用還需要其他未知病毒蛋白的協(xié)助，如果可以將多種病毒蛋白、宿主成分利用不同的熒光標(biāo)記物同時(shí)標(biāo)記，就可以將這一過程進(jìn)行更加細(xì)致的可視化，從而揭示PRV在軸突傳導(dǎo)過程的詳細(xì)機(jī)制，不僅如此，這樣的研究方法同樣適用于其他α皰疹病毒的神經(jīng)傳導(dǎo)研究。

病毒學(xué)家也已經(jīng)開始利用超高分辨率顯微鏡進(jìn)行相關(guān)的研究[49,81-82]，這非常有助于對(duì)皰疹病毒內(nèi)膜層網(wǎng)狀蛋白的觀測(cè)以及對(duì)病毒相關(guān)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的鑒定，如組裝中間體 (Assemblons) 、RC等。目前已利用超高分辨率技術(shù)測(cè)量了PRV顆粒中結(jié)構(gòu)蛋白的不對(duì)稱分布以及HSV-1顆粒中內(nèi)膜蛋白的徑向分布[83-84]。未來需要對(duì)超高分辨率技術(shù)的速度和靈敏度進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒復(fù)制周期的超高分辨率的觀測(cè)。

4 結(jié)語與展望

可視化病毒示蹤技術(shù)應(yīng)用于皰疹病毒的相關(guān)研究，成功地揭示了皰疹病毒入侵、復(fù)制、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝、釋放以及潛伏感染等生命活動(dòng)的詳細(xì)機(jī)制，也促進(jìn)了神經(jīng)解剖學(xué)和病毒神經(jīng)傳導(dǎo)方面的研究。隨著病毒示蹤技術(shù)所需的熒光標(biāo)記物、標(biāo)記策略和監(jiān)測(cè)儀器的不斷發(fā)展和完善，可視化的病毒示蹤技術(shù)將更加方便、快捷、經(jīng)濟(jì)、有效地用于皰疹病毒的相關(guān)研究。

目前的示蹤技術(shù)尚不完善，雖然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于多種病毒蛋白的可視化標(biāo)記，但對(duì)病毒核酸的標(biāo)記仍舊是一大難題；熒光原位雜交技術(shù)雖然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA或RNA的原位標(biāo)記，特別是近年來報(bào)道的RNAscope技術(shù)[85]，但該技術(shù)需要對(duì)組織進(jìn)行固定和染色，即無法實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒核酸在宿主細(xì)胞內(nèi)一系列生命活動(dòng)的實(shí)時(shí)追蹤，期待未來在病毒核酸標(biāo)記方面能有所突破；將熒光蛋白插入病毒基因組的基因工程技術(shù)具有穩(wěn)定性好、熒光蛋白表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在使病毒感染能力減弱的問題，此外還存在熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成多聚體的報(bào)道，對(duì)病毒的生命活動(dòng)具有不良的影響[23]。因此，探索更加適宜插入熒光蛋白的位點(diǎn)或更加優(yōu)良的標(biāo)記方法依然是待解決的技術(shù)難題。有機(jī)染料和肽類標(biāo)記物雖然對(duì)病毒的感染能力無削弱，但是存在結(jié)合不牢的缺點(diǎn)，跟熒光蛋白相比標(biāo)記能力差。未來需要探尋分子量更小的熒光蛋白以及結(jié)合性更強(qiáng)、更特異的染料和肽類標(biāo)記物。

利用示蹤劑實(shí)現(xiàn)對(duì)皰疹病毒單個(gè)生命過程的研究有很多，但是對(duì)兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)生命過程的同步示蹤還鮮有報(bào)道，這可能也是未來需要突破的難點(diǎn)。

此外，今后需要研發(fā)更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、熒光強(qiáng)度高、對(duì)病毒活性影響小的標(biāo)記物；仍需不斷探索更加簡(jiǎn)便、普適性的標(biāo)記策略；仍需不斷研發(fā)更加靈敏的監(jiān)測(cè)儀器。如何使病毒示蹤技術(shù)與生物技術(shù)手段更加高效地結(jié)合應(yīng)用，突破各領(lǐng)域之間的界限，一直是研究者亟待解決的難題。

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Tracking of herpesviruses: what have been seen and will be seen?

Yalin Wang, Huaji Qiu, and Yuan Sun

State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, Heilongjiang, China

Viral infection of cells is a highly intricate process that involves the complex virus-cell interactions. Recently, virologists can monitor the virus life cycle at the primary infection site in real-time using various virus tracking techniques. Herpesviruses, a class of large enveloped DNA viruses, are important pathogens threatening the health of humans and animals. This review discussed the applications of different virus tracking techniques in herpesvirus studies, to provide new insights into virus-cell interactions and replication mechanisms of herpesviruses. Though the techniques have widely been exploited, some issues need to be addressed, such as the selection of the optimal site to insert reporters and the inability to track the whole process of the virus life cycle. With the updated tracking techniques, hopefully, more complex replication mechanisms of herpesviruses will be revealed in detail.

virus tracking techniques, herpesvirus, fluorescent protein, replication, latent infection, transport in axon

February 8, 2018;

June 11, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31570149).

Huaji Qiu. Tel/Fax: +86-451-51051708; E-mail: huajiqiu@caas.cn

Yuan Sun. Tel/Fax: +86-451-51051709; E-mail: sunyuan@caas.cn

10.13345/j.cjb.180057

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31570149) 資助。

2018-07-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180704.1636.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)