赤子愛勝蚓對乙草胺污染土壤微生物群落的影響

郝月崎，孫 揚，李曉晶，周 斌，翁莉萍，李永濤，趙麗霞*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所農(nóng)田有機(jī)污染生物消減創(chuàng)新團(tuán)隊，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點實驗室/天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室，天津 300191；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

乙草胺是中國用量最大的三大除草劑之一[1]，是一種選擇性芽前處理劑，廣泛應(yīng)用于玉米、大豆、棉花等作物的田間除草。一直以來乙草胺被認(rèn)為是一種低毒除草劑而廣泛使用，但有研究顯示，乙草胺對土壤微生物的數(shù)量與活性有明顯的抑制作用，而且由于乙草胺施用頻繁，能夠?qū)ν寥牢⑸锶郝洚a(chǎn)生不可逆的影響[2-4]。蚯蚓是土壤中生物量最大的無脊椎動物，被譽為“土壤生態(tài)系統(tǒng)工程師”，蚯蚓的掘洞、排泄和分泌黏液的行為能夠改變土壤理化性質(zhì)，為微生物提供良好的生長環(huán)境，促進(jìn)微生物活性和數(shù)量的提高；蚯蚓腸道微生物隨糞便排入土壤，可以增加土壤中氨化細(xì)菌、磷細(xì)菌和纖維素降解菌的數(shù)量，改變土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化情況[5-6]。蚯蚓的這些性質(zhì)使其成為了改善土壤質(zhì)量的有效工具。此外，研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓能夠強(qiáng)化有機(jī)氯殺蟲劑[7-8]和阿特拉津[9]等多種有機(jī)污染物的生物降解。但這些研究大都只關(guān)注污染物的降解過程，對蚯蚓在此過程中對土壤微生物群落的影響和修復(fù)作用尚未深入探究。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，通過土壤微生物的結(jié)構(gòu)與狀態(tài)評價土壤質(zhì)量和安全一直是科學(xué)研究的熱點問題。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法僅能夠?qū)ψ匀煌寥乐?%～5%的可培養(yǎng)微生物進(jìn)行研究，具有明顯的局限性[10]；基于生物遺傳多樣性的新型分子生物學(xué)技術(shù)則能夠根據(jù)基因序列對難培養(yǎng)微生物進(jìn)行定性與定量分析，其中高通量測序作為新一代測序技術(shù)的典型代表，因其能夠全面、準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，對不同因素導(dǎo)致的土壤微生物群落變化予以客觀研究和評價而被廣泛應(yīng)用[11]?，F(xiàn)階段關(guān)于乙草胺對土壤中微生物群落影響只停留在對微生物數(shù)量和土壤酶活性的研究階段，研究手段也較為傳統(tǒng)，無法將乙草胺對土壤微生物種群的影響精確到屬。本實驗利用土壤酶測定法、傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和高通量測序法等多種手段，表征蚯蚓對乙草胺污染土壤在微生物數(shù)量、活性、群落結(jié)構(gòu)和具體物種組成等方面的直接和間接影響，旨在為乙草胺的合理使用和蚯蚓對土壤質(zhì)量的修復(fù)改善提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗土壤采自天津西北部某農(nóng)場的表層土壤（0～20 cm）。新鮮土樣在室內(nèi)自然風(fēng)干，充分混勻后粉碎，過2 mm篩備用。供試土壤基本理化性質(zhì)：pH值為8.32、有機(jī)質(zhì)含量為23.97 g·kg-1、全氮含量為1.4 g·kg-1、速效磷含量0.94 mg·kg-1。本研究選用的受試生物為赤子愛勝蚓（Eisenia fetida），購于賈立明蚯蚓養(yǎng)殖有限公司（中國天津）。實驗蚯蚓選取重0.3 g左右具有環(huán)帶的成年赤子愛勝蚓，實驗前在實驗土壤中馴化兩周，取出用無菌水清洗干凈放置于裝有濕潤濾紙的燒杯中，在黑暗培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)24 h，使其排出體內(nèi)糞便。

1.2 實驗設(shè)計

本實驗設(shè)置自然土壤（S）、土壤加乙草胺（SA）和土壤加乙草胺加蚯蚓（SAE）3個處理，每個處理3個重復(fù)。取200 g供試土壤置于250 mL玻璃燒杯中，SA和SAE處理組土壤中乙草胺的濃度為5 mg·kg-1（田間推薦使用劑量），SAE處理組中蚯蚓密度為5條/100 g土壤，所有處理外層包裹帶氣孔黑色塑料膜，為蚯蚓提供黑暗環(huán)境并防止逃逸。整個培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，保持在25℃黑暗條件下，實驗期間每隔7 d加一次滅菌蒸餾水以保持土壤含水量為23%（m/m）不變，培養(yǎng)持續(xù)30 d。于第0、3、7、14、23 d和30 d進(jìn)行土壤取樣，土樣置于-20℃下保存，測定土壤中乙草胺濃度及微生物數(shù)量，取部分第0、14 d和30 d土樣進(jìn)行土壤酶測定。另將少量第30 d土樣于-80℃條件下保存用于土壤DNA提取與測序。

1.3 土壤酶活性測定

土壤酶根據(jù)《土壤酶及其研究法》進(jìn)行測定[12]，具體方法如下：

（1）土壤過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法：基本原理是用高錳酸鉀溶液滴定剩余過氧化氫的量，來表征過氧化氫酶的活性。將2 g土壤樣品加入三角瓶中，加入40 mL蒸餾水和5 mL 0.3%的H2O2溶液，將三角瓶密封起來。振蕩20 min后加入1 mL飽和鋁鉀礬，放入盛有5 mL 1.5 mol·L-1硫酸的三角瓶中過濾，濾干后，吸取濾液25 mL，用0.02 mol·L-1高錳酸鉀滴定至紫紅色，同時做無土對照。

（2）土壤脫氫酶采用氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法：利用TTC作為受氫體，無色的TTC受氫后變成紅色的TF（三苯基甲鐟），根據(jù)吸光度值計算TPF的生成量，求出脫氫酶的活性。將0.1 g新鮮土壤樣品加入10 mL離心管中，加入0.5 mL 1%的TTC溶液充分混勻。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后立即冰浴5 min，加入0.5 mL甲醇，反復(fù)振蕩數(shù)次，37℃保溫10 min后進(jìn)行離心（10 000 r·min-1，10 min，4℃），取上清液在485 nm下測定吸光度值。

（3）土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法：蔗糖酶酶解所生成的還原糖與3，5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸，根據(jù)吸光度值計算3-氨基-5-硝基水楊酸的生成量，求出蔗糖酶的活性。將0.1 g土壤樣品加入10 mL離心管中，向其中加入15 μL甲苯，振蕩混勻使土樣全部濕潤，37℃水浴15 min。再向其中加入0.25 mL 8%的蔗糖溶液和0.75 mL磷酸緩沖液。混合均勻后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行離心（10 000 r·min-1，10 min，4 ℃）。取0.2 mL上清液，加入0.5 mL DNS試劑，充分混勻95℃水浴5 min，然后用自來水冷卻樣品。在分光光度計上于508 nm處進(jìn)行比色。

（4）土壤脲酶采用靛藍(lán)比色法：稱取0.25 g土樣于10 mL離心管中，加125 μL甲苯。振蕩混勻，使土樣全部潤濕，室溫放置15 min。加625 μL 10%尿素6溶液和1250 μL pH 6.7的檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行離心（10 000 r·min-1，10 min，25 ℃），取上清液。取0.1 mL上清液加入0.9 mL蒸餾水稀釋10倍。向稀釋液中加入200 μL苯酚鈉溶液和150 μL次氯酸鈉溶液，添加溶液過程中不斷搖勻。充分混勻，室溫放置20 min。1 h內(nèi)于分光光度計上578 nm處進(jìn)行比色。

（5）土壤堿性磷酸酶是根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)酚的量計算磷酸酶活性：稱取0.1 g土樣于10 mL離心管中，加入 50 μL甲苯，輕搖15 min后，加入400 μL 0.5%的硼酸鹽緩沖液，搖勻后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后加入1 mL 0.3%的硫酸鋁溶液，混勻以終止酶催化反應(yīng)。離心（8000 r·min-1，10 min，25℃）取上清液于分光光度計660 nm處比色。

1.4 土壤微生物數(shù)量測定

土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量測定采用平板計數(shù)法。具體實驗步驟如下：

（1）土壤稀釋液制備：取待測土壤樣品10 g于含90 mL滅菌水的錐形瓶中，橡膠塞密封后充分振蕩5 min，獲得土壤的10-1稀釋液。用滅菌移液管取10 mL土壤稀釋液到含90 mL滅菌水的錐形瓶中，振蕩均勻獲得 10-2稀釋液。再依次配制土壤的 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的土壤稀釋液。全部操作在超凈工作臺上進(jìn)行，保證無菌操作。

（2）平板涂布：將培養(yǎng)基融化滅菌后制成平板，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用孟加拉紅馬丁培養(yǎng)基。細(xì)菌選取10-6、10-7和10-8的土壤稀釋液，真菌選取10-3、10-4和10-5的土壤稀釋液。每個培養(yǎng)皿加入0.1 mL的土壤稀釋液，并用玻璃刮鏟涂布均勻。每組稀釋液設(shè)置3個重復(fù)。

（3）培養(yǎng)：細(xì)菌平板倒置培養(yǎng)于37℃培養(yǎng)箱中，真菌平板倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)時間為48 h。

（4）計數(shù)：選取菌落數(shù)量為30～300的平板進(jìn)行計數(shù)。微生物數(shù)量（CFUs/g）=M×D/W，M表示平板中群落的個數(shù)，D表示稀釋倍數(shù)，W表示用于測定的干土質(zhì)量。

1.5 土壤微生物群落高通量分析

（1）DNA提?。喝客寥繢NA提取使用土壤樣品DNA 提取試劑盒：PowerSoil DNA extraction kit（Mo Bio Laboratories，USA），提取方法按照說明書執(zhí)行。DNA提取后使用Thermo Nano Drop 2000核酸蛋白定量檢測儀測定樣品DNA的濃度和檢查DNA的純度。

（2）擴(kuò)增：對純化后的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，細(xì)菌引物為16S rRNA基因V4區(qū)的515F和806R，真菌引物為ITS1F和ITS4。

（3）純化：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA純化試劑盒：Micro Elute DNA Clean-Up Kit（Omega Bio-Tek）進(jìn)行純化，純化步驟按照說明書執(zhí)行。

（4）分析：純化后DNA的測序與分析由天津諾禾致源公司完成。

1.6 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH用pH計進(jìn)行測定[13]，具體方法為稱取2 g待測土壤于50 mL離心管中，加入10 mL超純水，混合均勻后進(jìn)行離心（15 min，4000 r·min-1），取上清液進(jìn)行測定。土壤總有機(jī)碳使用CN分析儀進(jìn)行測定（Vario Max CN，Elementar，Hanau，Germany）[14]。土壤可溶性有機(jī)碳和可溶性無機(jī)碳使用TOC分析儀進(jìn)行測定（Analytik jena multi N/C 3100，Germany）[13]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析使用SPSS（Version 22.0）進(jìn)行處理。使用單向方差分析進(jìn)行各處理間的差異顯著性比較。經(jīng)過統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)使用OriginPro 9.0作圖。土壤微生物α多樣性使用QIIME軟件分析。PCoA（princi?pal co-ordinates analysis）分析利用R軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤酶變化分析

土壤酶參與土壤中各種生物化學(xué)過程，能夠反映某一種土壤生物化學(xué)過程的相對強(qiáng)度和土壤微生物活性。未添加乙草胺的自然土壤中五種酶的活性在30 d的培養(yǎng)過程中變化幅度很?。▓D1）。在SA處理中過氧化氫酶的活性在第14 d和30 d時均明顯下降（P＜0.05），第30 d時土壤過氧化氫酶的活性從59.4 μmol·d-1·g-1減少到了54.6 μmol·d-1·g-1。SAE處理中過氧化氫酶的活性同樣呈現(xiàn)下降趨勢，但下降過程相對減緩（圖1A）。土壤脫氫酶的活性與過氧化氫酶類似，乙草胺的加入使得第14 d時SA處理中脫氫酶活性顯著下降（P＜0.05），但第30 d時SA處理中脫氫酶的活性已恢復(fù)到原有程度。蚯蚓的加入能在一定程度上促進(jìn)脫氫酶活性的提高，在第14 d和30 d時，SAE處理中脫氫酶的活性分別提高了14%和7%（圖1B）。土壤過氧化氫酶和脫氫酶的活性反映了土壤中氧化還原過程的活躍程度，因此常被作為指示土壤微生物活性的指標(biāo)[15-16]，乙草胺對這兩種酶的抑制作用說明乙草胺對土壤微生物有一定的毒害作用，會導(dǎo)致微生物活性的降低。蚯蚓活動對土壤理化性質(zhì)的改善作用在促進(jìn)微生物生長的同時也對土壤酶的活性有促進(jìn)作用，蚯蚓對有機(jī)質(zhì)的利用則直接影響了與營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)相關(guān)的微生物。乙草胺的加入同樣可以抑制土壤中蔗糖酶的活性，SA處理中第14 d和30 d 時土壤中蔗糖酶的活性從 77 μg·d-1·g-1下降到了48～52 μg·d-1·g-1范圍內(nèi)。蚯蚓對蔗糖酶的活性有明顯促進(jìn)作用（P＜0.05），第14 d和30 d時，SAE中蔗糖酶的活性分別提高了14%和53%（圖1C）。赤子愛勝蚓作為表層蚓以動植物殘體和新鮮有機(jī)質(zhì)為食，與土壤有機(jī)質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化有密切聯(lián)系[17]，蚯蚓對有機(jī)質(zhì)的利用刺激了與土壤碳循環(huán)相關(guān)的蔗糖酶的活性。與上述三種酶不同的是，乙草胺的加入會對土壤中脲酶的活性有促進(jìn)作用，SA處理中第14 d和第30 d的脲酶活性分別提高了84%和210%（圖1D）。各處理中堿性磷酸酶的活性變化與脲酶類似，乙草胺能夠促進(jìn)土壤堿性磷酸酶活性的提高，且磷酸酶的活性在培養(yǎng)周期內(nèi)呈不斷上升趨勢。蚯蚓的加入對土壤脲酶和堿性磷酸酶沒有明顯影響（圖1E）。土壤脲酶和堿性磷酸酶分別是土壤氮和磷循環(huán)速率的指示酶[18-19]，SA處理中這兩種酶活性的升高說明乙草胺對土壤氮、磷循環(huán)起促進(jìn)作用。

綜上，對本實驗測定的5種酶而言，蚯蚓對土壤酶的促進(jìn)作用僅限于受到乙草胺抑制的三種酶（過氧化氫酶、脫氫酶和蔗糖酶），對另兩種被乙草胺促進(jìn)的酶沒有明顯影響，因此蚯蚓對土壤微生物的影響主要表現(xiàn)在對土壤微生物的修復(fù)作用，當(dāng)土壤中微生物受到乙草胺毒害而活性或數(shù)量受抑制時，蚯蚓能夠緩解毒害、提高微生物活性。

2.2 土壤微生物數(shù)量變化分析

從圖2可以看出，在不添加乙草胺時，培養(yǎng)周期內(nèi)自然土壤（S）中微生物的數(shù)量略有增長但變化并不明顯。添加乙草胺后，SA處理中細(xì)菌和真菌的數(shù)量都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但兩者的變化規(guī)律并不完全一致。培養(yǎng)第3 d時SA中細(xì)菌數(shù)量級從開始時的107下降到了104（圖2A）。之后細(xì)菌數(shù)量迅速回升，在實驗結(jié)束時細(xì)菌的CFUs已接近初始的數(shù)量值，達(dá)到了106。對真菌而言，加入乙草胺后，SA處理中真菌數(shù)量逐漸下降，在第14 d時達(dá)到最低點，土壤中真菌的數(shù)量級從最初的105下降到了103，14 d后土壤真菌數(shù)量逐漸上升，在第30 d培養(yǎng)結(jié)束時，土壤中真菌數(shù)量接近于104（圖2B）。土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量的下降說明乙草胺對土壤微生物具有一定的毒性，這與前人的研究結(jié)果基本保持一致[20-21]。乙草胺的生物毒害作用對細(xì)菌來說是暫時性的，土壤中細(xì)菌數(shù)量的減少能夠迅速自行恢復(fù)，而對真菌來說毒害作用持續(xù)時間較長。這表明一方面細(xì)菌對乙草胺的耐受性可能高于真菌；另一方面，真菌數(shù)量恢復(fù)速率較慢可能與細(xì)菌的快速增長有關(guān)，有實驗表明部分細(xì)菌能夠?qū)φ婢a(chǎn)生拮抗作用[22]。

在加入蚯蚓的SAE處理中，培養(yǎng)第3 d時，土壤細(xì)菌數(shù)量比不添加蚯蚓時要高35%（P＜0.05），而其他時間點蚯蚓作用不明顯。對真菌來說，不同時間點SAE處理中真菌的數(shù)量均高于SA，在蚯蚓的作用下SAE中真菌數(shù)量要比SA高5%～39%，說明蚯蚓的加入能夠加快乙草胺污染土壤中細(xì)菌、真菌數(shù)量的恢復(fù)速率。蚯蚓在土壤中通過掘洞、吞食土壤和排泄蚓糞等方式改變土壤的理化性質(zhì)，直接或間接地促進(jìn)土壤中微生物數(shù)量和活性的提高[23]。

圖1 蚯蚓對乙草胺污染土壤酶活性的影響Figure1 The impact of earthworm on soil enzyme activities

2.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性變化分析

ACE和Shannon指數(shù)分別表征微生物群落的豐富度和多樣性，這兩個值越高分別表示微生物的多樣性和豐富度越大。從表1中可以看出，30 d培養(yǎng)結(jié)束

時，乙草胺對土壤細(xì)菌的豐富度沒有明顯影響，但使得真菌豐富度降低了31.8%；蚯蚓的加入對細(xì)菌豐富度影響不明顯，但使得真菌豐富度上升了30.5%。這與平板計數(shù)測定的微生物數(shù)量結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明了乙草胺對土壤微生物的毒害作用和蚯蚓對乙草胺毒害的修復(fù)作用。對微生物多樣性而言，SA中細(xì)菌的多樣性與S處理組相比減少了4.6%，蚯蚓的加入進(jìn)一步減少了土壤細(xì)菌的多樣性。這可能源于蚯蚓消化過程對細(xì)菌的選擇性消化，使得蚓糞中細(xì)菌的多樣性低于土壤環(huán)境（蚓糞樣品細(xì)菌的Shannon指數(shù)值為8.710±0.115），蚯蚓活動將蚓糞與土壤混合使土壤中細(xì)菌多樣性相對減少。30 d培養(yǎng)結(jié)束時，SA中真菌的多樣性與S處理組相比減少了4.3%，SAE中真菌的多樣性指標(biāo)相較于SA提高了9.8%。蚯蚓對土壤多樣性影響具有兩面性，一方面蚯蚓能夠?qū)⒛c道特有的微生物帶入到土壤環(huán)境中，使其多樣性增加[24]，另一方面蚯蚓的消化過程會使得蚓糞中微生物多樣性減少。本實驗中，第30 d時真菌仍明顯受到乙草胺的抑制作用，蚯蚓對土著微生物的刺激作用能夠使其多樣性提升，而此時細(xì)菌已幾乎恢復(fù)到正常狀態(tài)，蚯蚓對土著微生物細(xì)菌豐富度的作用不明顯，蚓糞與土壤的混合會使得細(xì)菌多樣性下降。

圖2 蚯蚓對乙草胺污染土壤細(xì)菌（A）和真菌（B）數(shù)量的影響Figure2 The impact of earthworm on soil bacteria（A）and fungi（B）population

表1 培養(yǎng)第30 d時不同處理組土壤中微生物的豐富度（ACE）和多樣性（Shannon）指數(shù)（ANOVA，Duncan’s test，P＜0.05）Table1 Shannon and ACE indices of soil microbial community after 30 days incubation（ANOVA，Duncan’s test，P＜0.05）

蚯蚓對土壤中受抑制微生物的恢復(fù)作用也可以從不同處理土壤中細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)分布圖（圖3）中看出。圖中不同處理組樣品點之間的距離越遠(yuǎn)，說明它們的群落結(jié)構(gòu)相差越大。第30 d時，三個不同處理的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均有明顯差異，說明乙草胺和蚯蚓都能夠?qū)ν寥牢⑸锶郝洚a(chǎn)生影響，這與前面的實驗結(jié)果基本一致，SAE處理組群落結(jié)構(gòu)位于S和SA之間，說明蚯蚓能夠促使土壤微生物恢復(fù)到接近未被污染的狀態(tài)。

2.4 乙草胺和蚯蚓對土壤理化性質(zhì)的影響

蚯蚓對乙草胺污染土壤理化性質(zhì)的影響如圖4所示。從圖4A中可以看出，S處理組的各項理化性質(zhì)在整個培養(yǎng)周期內(nèi)變化不明顯。SA和SAE的pH隨時間呈下降趨勢，SAE的pH下降趨勢更加明顯。第30 d時，S、SA和SAE的pH分別為8.25、8.05和7.90，這說明蚯蚓對土壤酸堿性有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力。由于蚯蚓體內(nèi)腸道及體表分泌黏液呈中性，蚯蚓可以通過將蚓糞和分泌物排放到土壤中的方式對土壤酸堿性進(jìn)行調(diào)節(jié)[25]，從而影響土壤微生物的活性與豐度。本實驗使用土壤為堿性土壤，所以蚯蚓起到了降低土壤pH的作用。從圖4B中可以看出，不論是蚯蚓還是乙草胺對土壤中總有機(jī)碳的影響都不明顯，但蚯蚓處理組能夠提高土壤中可溶性有機(jī)碳（圖4C）和無機(jī)碳（圖4D）的含量。蚯蚓對可溶性有機(jī)碳的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在實驗中期（第14 d），SAE的DOC含量比SA高23%，第30 d時兩者的DOC含量基本一致?？扇苄杂袡C(jī)碳易被微生物吸收分解，對土壤養(yǎng)分供應(yīng)有重要影響[26]。蚯蚓還能促進(jìn)土壤中可溶性無機(jī)碳含量的提升，第30 d時SAE的DIC含量比SA高11%。這說明蚯蚓對土壤中的碳循環(huán)有重要影響，與前文中土壤蔗糖酶的測定結(jié)果一致（圖1C）。蚯蚓消化過程能夠促進(jìn)土壤中有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化與降解，為微生物提供更多有效態(tài)營養(yǎng)物質(zhì)從而促進(jìn)土壤土著微生物的生長[27]。

圖3 培養(yǎng)第30 d時蚯蚓對乙草胺污染土壤細(xì)菌（A）和真菌（B）群落結(jié)構(gòu)的影響Figure3 The impact of earthworm on soil bacteria（A）and fungi（B）community structure after 30 days incubation

圖4 蚯蚓對乙草胺污染土壤理化性質(zhì)的影響Figure4 The impact of earthworm on soil physicochemical properties

2.5 土壤物種組成

2.5.1 門和綱水平上的土壤微生物變化分析

在門水平上土壤中的細(xì)菌優(yōu)勢菌群為Proteobac?teria、Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Acido?bacteria（圖5A）。這5種細(xì)菌占到了整個細(xì)菌高通量序列的80%以上。其中Proteobacteria在每組樣品中的含量都超過了40%。乙草胺的加入使得SA處理組中Proteobacteria和Actinobacteria的豐度分別下降6%和5%，而Acidobacteria的豐度則上升了6%。蚯蚓的添加能夠改善乙草胺污染土壤中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，SAE處理組中Proteobacteria和Actinobacteria的相對豐度上升了2%和3%，而Acidobacteria的相對豐度則下降了6%，相較于SA處理組更接近于S處理組的物種組成。

圖5 蚯蚓對乙草胺污染土壤細(xì)菌門與綱水平上物種分布的影響Figure5 The impact of earthworm on bacteria composition at phylum and class level

細(xì)菌的Proteobacteria門可以分為Gammaproteo?bacteria、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Del?taproteobacteria四個綱，其中乙草胺對Alphaproteo?bacteria、Betaproteobacteria和Deltaproteobacteria都有抑制作用，而對Gammaproteobacteria豐度提升有促進(jìn)作用。對于Actinobacteria門，乙草胺主要對unidenti?fied_Actinobacteria和Thermoleophilia綱有明顯的抑制作用，使其豐度分別減少了71%和59%，對Acidi?microbiia綱的作用并不明顯。Acidobacteria門中大部分序列都屬于unidentified_Acidobacteria綱，乙草胺對其有明顯的促進(jìn)作用，使其序列數(shù)量提升了127%，乙草胺對Acidobacteria門豐度提升的促進(jìn)作用就來源于此。與門水平相似，蚯蚓使得分屬不同門的9個綱的物種數(shù)量更接近S處理組，蚯蚓處理組中被乙草胺抑制的微生物Alphaproteobacteria、Betaproteobacte?ria、Deltaproteobacteria、unidentified_Actinobacteria 和Thermoleophilia的豐度分別提高了21%、23%、33%、62%和63%，而被乙草胺促進(jìn)的微生物Gammaproteo?bacteria和unidentified_Acidobacteria的豐度下降了15%和52%。這就進(jìn)一步說明了蚯蚓能夠修復(fù)乙草胺造成的生態(tài)毒害，使得土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更接近于未被污染的自然狀態(tài)。

圖6顯示，在門水平上，真菌的群落主要由Asco?mycota、Zygomycota以及 Chytridiomycota組成，其中Ascomycota是優(yōu)勢物種，占整個真菌序列的60%以上。相比于S處理組，SA組Zygomycota的序列數(shù)上升了10%。而Chytridiomycota會明顯受到乙草胺的抑制，其相對豐度從10%下降到了2%。蚯蚓能夠使得SAE處理組Zygomycota的豐度相較于SA處理組有所下降，但對Chytridiomycota的含量沒有明顯影響。

真菌Zygomycota門的主要組成為Incertae_se?dis_Zygomycota綱，乙草胺使其豐度明顯上升，蚯蚓能夠使其序列數(shù)下降恢復(fù)到原有狀態(tài)。Chytridiomycetes是Chytridiomycota門中最主要的綱，乙草胺對其有明顯的抑制作用，而蚯蚓沒有明顯的促進(jìn)作用。

圖6 蚯蚓對乙草胺污染土壤真菌門水平上物種分布的影響。Figure6 The impact of earthworm on fungi composition at phylum level

2.5.2 屬水平上的土壤微生物變化分析

圖7顯示了細(xì)菌、真菌在屬水平上豐度前15的物種，這些微生物在整個群落中的占比在10%～20%的范圍內(nèi)。對圖中所顯示的15種細(xì)菌而言，乙草胺對大部分細(xì)菌（11種）都有抑制作用，而蚯蚓則能夠緩解毒害作用促進(jìn)其豐度上升，這與門水平的變化情況基本一致。四種被乙草胺促進(jìn)生長的細(xì)菌分別是Sphingomonas、Pseudomonas、Clostridium_sensu_stricto_1和Steroidobacter，它們可能能夠利用乙草胺作為碳源或氮源，參與到乙草胺的降解過程中。其中Sphin?gomonas和Pseudomonas已被研究人員從高濃度乙草胺污染（100 mg·kg-1）的土壤中分離純化出來，并認(rèn)為它們參與到了乙草胺降解的脫氯、脫烷基和碳氮鍵斷裂過程中[28-30]。Pseudomonas是目前研究較多的真菌拮抗菌之一，具有抑制真菌繁殖生長的能力[31]，乙草胺處理組SA中Pseudomonas的豐度上升了36%，這可能加劇了乙草胺對真菌的抑制作用。

對真菌而言，豐度前15的物種中有9種會受到乙草胺的刺激作用而相對豐度上升，但乙草胺對其余真菌的抑制作用更加明顯，使得SA處理中15種真菌的序列數(shù)總和低于S處理（圖7B）。從圖中還可以看出，蚯蚓在屬層面上使得Chaetomium、Mortierella、Metarhizium和Scedosporium等多種真菌的豐度更接近于S處理，與門水平上結(jié)果一致。另外，蚯蚓對Fusar?ium、Gaertneriomyces和Pyrenula這三種可能的降解菌有促進(jìn)生長的作用。這三種真菌和乙草胺降解的關(guān)系并不明確，但有研究顯示Fusarium能夠參與到多環(huán)芳烴的降解過程中[32]。

圖7 蚯蚓對乙草胺污染土壤細(xì)菌（A）和真菌（B）屬水平上物種分布的影響Figure7 The impact of earthworm on bacteria（A）and fungi（B）composition at genues level

3 結(jié)論

（1）蚯蚓對乙草胺造成的生態(tài)毒害有明顯的緩解和修復(fù)作用。乙草胺對土壤過氧化氫酶、脫氫酶和蔗糖酶活性有抑制作用，蚯蚓能夠促進(jìn)污染土壤中這三種酶活性的提升，從而達(dá)到緩解毒害、修復(fù)土壤的作用。蚯蚓對乙草胺污染土壤中細(xì)菌數(shù)量的恢復(fù)作用主要發(fā)生在實驗前期（第3 d），對真菌的恢復(fù)作用持續(xù)到了整個培養(yǎng)周期結(jié)束（30 d）。

（2）蚯蚓能夠通過改變土壤理化性質(zhì)的方式間接影響土壤的微生物群落，本實驗中蚯蚓對土壤酸堿性和碳循環(huán)有明顯的影響，蚯蚓通過改善土壤pH、增加土壤中可溶性碳的方式，為微生物生長提供適宜的生長環(huán)境。

（3）乙草胺在門水平上主要對細(xì)菌Proteobacte?ria、Actinobacteria、Acidobacteria和真菌 Zygomycota、Chytridiomycota產(chǎn)生影響。蚯蚓能夠改善土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，促使土壤微生物物種組成更接近于未污染狀態(tài)。

（4）少數(shù)微生物包括Sphingomonas、Pseudomonas、Fusarium、Gaertneriomyces和Pyrenula等能夠受到乙草胺刺激而豐度增加，這些微生物可能參與到乙草胺的微生物降解過程中。