不同表面修飾的氧化鐵納米顆粒對A549細胞的毒性及DNA損傷

文海若郭雅娟 # 黃芝瑛王 雪 * 淡 墨*

（1．中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室，北京 100176；2．中山大學藥學院，廣東 廣州 510006）

納米技術是21世紀最重要的科學技術成果之一，納米材料獨特的物理化學性質及其與生物體的相互作用為其應用于醫(yī)藥領域提供了廣闊的前景。1995年美國FDA批準了第1個納米藥物Doxil上市[1]，緊接著在1996年美國FDA又先后批準了兩種靜注磁性氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticle，IONP)，分別為Ferumoxil和Ferumoxide，用于肝損傷和腫瘤的核磁共振造影(MRI)診斷[2-3]。IONP是常見的生物醫(yī)用納米材料，其生物相容性較好，且在診斷和殺傷神經膠質瘤方面效果尤為卓越[4-5]。然而不同表面修飾可導致納米材料與細胞的相互作用產生明顯差異，從而可能影響其體內成像效果和抗腫瘤療效。

肺臟是人體納米材料暴露的主要器官之一，文獻中已有納米氧化鐵致肺臟損傷的報道。II型肺泡上皮細胞是肺臟功能單位肺泡的重要組成部分，人肺腺癌細胞A549細胞與II型肺泡上皮細胞具有相似的生理功能，可通過內吞作用吞噬納米顆粒，且是肺臟毒性的常用體外評價模型[6-7]。

胺基(Amine)和聚乙二醇[poly(ethyleneglycol)，PEG]是常見的納米材料表面修飾基團，可賦予納米顆粒不同的表面電荷及細胞作用特征。前者攜帶正電荷，與帶有負電荷的PEG相比，經胺基修飾的納米材料更易于與表面帶負電荷的細胞相互作用。本研究首先通過比較相同粒徑范圍(約5 nm)的胺基表面修飾的納米氧化鐵顆粒(Amine-IONP)和聚乙二醇表面修飾的納米氧化鐵顆粒(PEG-IONP)對A549細胞存活率和細胞周期的影響；之后使用高內涵法評價經不同納米氧化鐵顆粒處理后胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量、線粒體膜電位(mitochondtial membrance potential，MMP)和內質網(endoplasmic reticulum，ER)狀態(tài) 指標的變化；然后采用體外胞質分裂法微核試驗和堿性彗星電泳評價其對DNA損傷的影響，從而綜合比較不同表面修飾的氧化鐵納米顆粒對A549細胞的毒性及其作用機制的差異。研究聯(lián)合使用氧自由基清除劑乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)和叔丁基對羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)來進一步評價氧化應激作用與DNA及染色體斷裂的關聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要化學試劑包括：平均粒徑為5 nm的PEGIONP(生產批號MKBR4497V)和Amine-IONP(生產批號MKBR2641V)，以及遺傳毒性陽性劑絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)和甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate)均購自Sigma Aldrich公司；Cell Titer-Glo 2.0試劑盒購自Promega公司；PI/RNase染液、乙酰半胱氨酸(NAC) 和叔丁基對羥基茴香醚(BHA)購自Invitrogen公司；細胞核熒光探針Hoechst 33342、胞內活性氧檢測熒光探針DCFH-DA、線粒體膜電位檢測熒光探針Mito Tracker?Red CMXRos、內質網應激水平檢測熒光探針ER-Tracker Red和SYBR Green I nuclei acid gel stain購自Life Technologies；Trevigen Comet Assay Kit彗星檢測試劑盒購自Trevigen公司；anti-p21抗體、anti-p53抗體、anti-β-tubulin抗體購自SANTA CRUZ。

主要儀器包括：Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分 析 儀(Malvern)；FACS CaliburTM流 式 細 胞 儀(BD)；Mini-PROTEAN?Tetra Cell 系 統(tǒng) (BIO-RAD)， SPECTR Amax-PLUS型酶標儀(Molecular Devices)；5810R型離心機(Eppendorf)；DYCP31F 型電泳儀(北京市六一儀器廠)；Eclipse 80i熒光顯微鏡(Nikon)；Komet 6.0圖像分析系統(tǒng)(Andor Technology)；IN Cell 2 000高內涵分析儀(GE Healthcare)。

1.2 細胞

人肺腺癌II型肺泡基底上皮細胞A549由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心提供，液氮中保存。本研究所用細胞代數(shù)在第90～100代，細胞倍增時間約20～24 h，支原體檢測結果為陰性。

1.3 氧化鐵納米顆粒的粒徑分布和表面電性測定

Amine-IONP與PEG-IONP分別經RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到一定濃度后，使用動態(tài)光散射法(dynamic light scattering，DLS)檢測顆粒在細胞培養(yǎng)液中的顆粒分布和表面帶電性。經測定兩種不同表面修飾的5 nm氧化鐵納米顆粒在細胞培養(yǎng)液中均勻分布，無明顯聚集。PEG-IONP顆粒平均分布為(5.6±0.4) nm，表面帶電為-2 mV；Amine-IONP顆粒平均分布為(5.3±0.7)nm，表面帶電為+13 mV[8]。

1.4 細胞存活率測定

使用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%熱滅活小牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)培養(yǎng)A549細胞，并分別更換無菌注射用水及不同濃度(20、40、80、160、 320 μg/mL)的 Amine-IONP和 PEG-IONP處 理 48 h，每濃度8個復孔。保留孔內原培養(yǎng)基，加入等量Cell Titer-Glo?2.0 Reagent，室溫孵育10 min后立即檢測生物發(fā)光強度。因各濃度條件下細胞存活抑制率均<20%，整個研究中Amine-IONP和PEG-IONP均使用上述濃度范圍開展。

1.5 細胞周期檢測

細胞經不同濃度處理24 h后在4 ℃預冷的70%乙醇溶液中固定，并在-20 ℃保存過夜處理。每樣加入500 μL PI/RNase染液室溫避光孵育30 min，并使用流式細胞儀檢測，每組分析2×104個細胞計算細胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，分析軟件為ModFit LT(Verity Software House)。

1.6 p21和p53蛋白表達水平測定

細胞經不同濃度PEG-IONP處理24 h后，經裂解液冰浴裂解20 min。細胞裂解經勻漿后備用。樣本經BCA試劑盒定量后，每個樣品取約20 μg總蛋白加至含4%濃縮膠和10%分離膠的SDS-PAGE電泳(濃縮膠50 V恒壓電泳40 min，待樣品進入分離膠后，更換電壓至100 V恒壓電泳直至克羅寧、溴酚藍遷移至凝膠邊緣)，并轉至PVDF膜(100 V電泳轉移90 min)。轉膜完畢后，將膜放入含5% BSA-TBS中，室溫搖動1 h以封閉膜上的非特異結合位點。之后將膜用TBS/T洗3次，每次5 min。洗滌完畢后，將膜放入容器中，分別加入稀釋 于 1% BSA-TBS/T中 的 anti-p21(1∶ 200)、 anti-p53(1∶200)和anti-β-tubulin(1∶5 000)抗體，4 ℃置于搖床上，平緩搖動過夜。一抗標記后取出膜，用TBS/T洗3次，將膜重新放入容器中，加入5 000倍稀釋于1%BSA-TBS/T中的辣根酶標記二抗。室溫平緩搖動1 h后，取出膜，用TBS/T洗3次。在膜上加入化學發(fā)光試劑后在暗室內顯色曝光。試驗重復3次。

1.7 氧化應激相關指標檢測

1.7.1 胞內ROS含量測定 細胞接種及給藥方法同上，每個試驗條件每個濃度設復孔8個。孵育結束后棄去孔內原有培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含Hoechst 33342 (終濃度2.5 μg/mL)和H2DCFDA(終濃度10 μmol/L)的培養(yǎng)基混合液，胞內ROS通過將H2DCFDA去乙?；蛊湓?95 nm激發(fā)光下發(fā)射綠色熒光，根據(jù)熒光強度來反映胞內ROS的含量。

1.7.2 線粒體損傷水平的測定 每孔加入100 μL含Hoechst 33342(終 濃 度 2.5 μg/mL)和 MitoTracker?Red CMX Ros(終濃度100 nmol/L)的培養(yǎng)基混合液，探針進入細胞后在狀態(tài)正常的線粒體內蓄積，固定過程可以去除膜電勢下降的居于線粒體中的探針，因此可以根據(jù)熒光探針的數(shù)量來反映線粒體的狀態(tài)。

1.7.3 內質網損傷水平的測定 每孔加入100 μL含Hoechst 33342(終濃度2.5 μg/mL)和ER-Tracker Red(終濃度1 μmol/L)的培養(yǎng)基混合液，內質網表面突出表達磺酰脲受體與ER-Tracker結合，因此根據(jù)結合的ERTracker的多少可以反映內質網的功能狀態(tài)。分別加入上述染料后，細胞在37 ℃培養(yǎng)30 min，之后移除含染料的培養(yǎng)基，使用PBS 100 μL清洗2次，每孔加入50 μL含5%甲醇的PBS溶液固定，使用IN Cell 2000型高內涵系統(tǒng)進行檢測。

1.8 彗星試驗

彗星試驗方法詳見前期研究[9]，簡述如下。調整A549細胞達對數(shù)生長期后，更換不同濃度Amine-IONP和PEG-IONP和陽性對照(EMS，200 μg/mL)分別處理48 h，之后收獲細胞并將密度調整為2×105/mL。1.5 mL試管37 ℃水浴預熱，每管預先加入300 μL Comet LMAgarose(Trevigen Comet Assay Kit彗星檢測試劑盒中瓊脂糖凝膠制備試劑)。每孔取單細胞懸液30 μL，用移液頭與預熱的Comet LMAgarose迅速混合均勻1～2次后鋪片，保證細胞均勻分布于每孔，每個樣本平行2孔。鋪片結束后將玻片置于4 ℃、避光、過夜裂解。之后將玻片碼放在電泳槽內，緩緩添加預冷的堿性解旋液(pH>13)，室溫、避光解旋20 min。電泳條件為電壓約0.7 V/cm，電流約300 mA，電泳時間20 min。玻片經中和、脫水處理后晾干。

染色時將稀釋過的SYBR Green I(1∶10 000)加在每孔表面，4 ℃冰箱放置5 min，室溫、避光晾干。使用Komet 6.0(Andor Technology)彗星圖像分析軟件進行分析。每個樣品至少計數(shù)100個彗星細胞的尾部DNA百分率(percentage of tail DNA)和Olive尾矩(Olive tail moment)的中位數(shù)。

1.9 胞質分裂阻斷法微核試驗

A549細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔4×105個，培養(yǎng)約48 h，待細胞生長良好并達到對數(shù)生長期更換不同濃度培養(yǎng)液。在無代謝活化條件下，給予不同濃度的PEG-IONP和Amine-IONP處理48 h；另設滅菌注射用水溶媒對照組和MMC(0.1 μg/mL)陽性對照組處理24 h。每個處理條件設3個復孔。與細胞作用約24 h后更換含CytoB(3 μg/mL)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至約24 h。細胞收獲時，用胰酶-EDTA液消化細胞，將消化后的細胞懸液移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min。用DPBS洗滌2次，加入用預溫的0.075 mol/L KCl溶液2 mL于 37 ℃低滲處理5 min；加入固定液(甲醇∶冰醋酸體積比為3∶1)5 mL固定，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復固定2次。滴片制備標本并編號。固定后的玻片標本浸入5% Giemsa應用液中，染色25～30 min；將染色后的標本先后置于自來水、超純水中沖洗干凈，室溫下自然干燥。

顯微鏡下觀察并計數(shù)每個劑量組的Giemsa染色玻片標本中：每2 000個雙核細胞中微核(micronucleus，MN)和核質橋(nucleoplasmic bridge，NPB)出現(xiàn)率[10]。

1.10 氧自由基清除劑預處理

為評價氧化應激作用對細胞染色體和DNA斷裂的影響，A549細胞經不同濃度Amine-IONP和PEG-IONP處理前，先給予氧自由基清除劑在BHA(100 μmol/L)或NAC(1 mmol/L)預處理30 min。之后分別如前開展ROS水平測定、微核試驗和彗星試驗測定。

1.11 結果分析

2 結 果

2.1 氧化鐵納米顆粒對A549細胞存活率的影響

320 μg/mL Amine-IONP和PEG-IONP與A549細胞作用24 h或48 h后，細胞的形態(tài)無明顯改變且細胞表面無明顯的顆粒團聚(圖1)。處理濃度為160 μg/mL及以下時Amine-IONP和PEG-IONP對細胞存活率均無明顯抑制作用。當處理濃度達到320 μg/mL時，與無菌注射用水溶媒對照組比較，僅PEG-IONP處理48 h后的細胞存活率明顯降低(P<0.01，圖2)。

圖1 A549細胞分別經Amine-IONP和PEG-IONP(320 μg/mL)處理24和48 h后形態(tài)學觀察示例

2.2 氧化鐵納米顆粒對A549細胞增殖的影響

A549細胞經不同受試物處理后，通過染色細胞核來分析其細胞周期，結果發(fā)現(xiàn)兩者均可降低處于S期的細胞比率(表1)。與對照組比較，320 μg/mL Amine-IONP處理后S期細胞比率顯著降低(P<0.01)，而PEGIONP 自20 μg/mL起即明顯減少S期細胞比率(P<0.01)，且均有濃度相關趨勢。提示納米氧化鐵顆粒均可誘導G0/G1期細胞周期阻滯，且PEG-IONP可在較低濃度產生細胞阻滯效應。進一步對與細胞增殖相關的蛋白表達水平進行分析發(fā)現(xiàn)，PEG-IONP處理細胞24 h后可誘導p21與p53表達水平顯著升高(圖3，P<0.05)。

圖2 A549細胞與不同濃度Amine-IONP和PEG-IONP分別作用后的細胞存活率變化

表1 Amine-IONP和PEG-IONP對A549細胞周期的影響(n=3)

2.3 氧化鐵納米顆粒潛在的氧化應激損傷評價

熒光探針標定結合高內涵檢測結果提示，Amine-IONP作用24 h后即可誘導A549細胞ROS的過量生成，且存在濃度效應關系；而PEG-IONP在處理48 h后才誘導細胞ROS水平顯著升高(圖4)。給藥48 h后，Amine-IONP和PEG-IONP誘導ROS水平顯著升高的起始濃度分別為20和40 μg/mL。此外，分別檢測不同細胞線粒體膜電位和內質網應激狀態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)氧化鐵納米顆?？蓪毎麃喗Y構線粒體、內質網等細胞器造成損傷(圖5和圖6)。Amine-IONP誘導MMP和ER損傷水平顯著性改變的起始濃度均低于PEG-IONP，而相同濃度作用條件下，前者誘導的損傷更為顯著。提示相同濃度作用下，Amine-IONP更易于誘導細胞內氧化應激 效應。

圖3 PEG-IONP對A549細胞p21和p53蛋白表達水平的影響

2.4 氧化鐵納米顆粒致DNA斷裂作用

堿性彗星電泳試驗通常用于評價受試物潛在的細胞毒性和致DNA斷裂性。不同濃度的兩種氧化鐵納米顆粒與細胞分別作用48 h后，均可誘導A549細胞的尾部DNA百分率顯著性升高(P<0.01)(圖7A、B)。在染色體損傷層面，給予納米氧化鐵顆粒48 h后也可誘導A549細胞微核率顯著升高(圖7C)。相同濃度條件下Amine-IONP 誘導的尾部DNA百分率和微核率均高于PEG-IONP。核質橋發(fā)生率整體背景值較低，且僅PEG-IONP在160 μg/mL 以上濃度可顯著誘導核質橋發(fā)生率的升高，而Amine-IONP則對核質橋發(fā)生率無影響(圖7D)。

圖4 Amine-IONP和PEG-IONP作用24或48 h后對A549細胞ROS相對水平的影響

圖5 Amine-IONP和PEG-IONP作用24或48 h后對A549細胞MMP相對水平的影響

為進一步確證氧化應激作用在IONPs誘導的遺傳物質損傷中扮演的角色，分別使用自由基清除劑對細胞進行預處理后再將細胞與Amine-IONP和PEG-IONP作用48 h。細胞經NAC(1 mmol/L)或BHA(100 μmol/L)預處理后均可顯著抑制Amine-IONP和PEG-IONP所誘導的ROS水平、尾部DNA百分率和微核百分率的升高(見圖8)。

3 討 論

IONP是常見的生物醫(yī)用納米材料，已有相關產品(如Ferumoxil和Ferumoxide)在臨床用于臨床醫(yī)學造影診斷[2-3]。與其他含金屬粒子的納米材料比較，IONP的毒性較低但具有多種表面修飾，有助于我們研究納米顆粒表面修飾對其毒性的影響。本研究從細胞存活率、細胞周期、氧化應激和DNA斷裂等多角度，對粒徑接近而表面修飾不同的兩種IONPs (Fe3O4NP)的潛在細胞毒性進行了比較。Amine-IONP更易于誘導氧化應激損傷，細胞內自由基蓄積是兩種IONPs造成DNA損傷的主要原因；而PEG-IONP除氧化應激損傷外，與Amine-IONP相比較更易于抑制細胞增殖，PEG誘導的DNA損傷較弱可能與其細胞周期阻滯作用有關。

圖6 Amine-IONP和PEG-IONP作用24或48 h后對A549細胞ER相對水平的影響

圖7 Amine-IONP和PEG-IONP處理后A549細胞的彗星試驗和微核試驗結果

金屬納米顆粒在應用于生物醫(yī)藥領域前，通常需要通過不同分子對其進行表面修飾從而增強其穩(wěn)定性與生物相容性。常用的納米氧化鐵顆粒表面修飾材料包括聚乙烯-乙酸乙烯酯[poly(ethylene-co-vinyl acetate)]、聚乙烯吡咯烷酮[poly(vinylpyrrolidone)，PVP]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]、PEG等[11]。然而不同表面修飾可對其毒性產生一定影響，如IONP (Fe3O4NP)經PLGA包被后，與未經包被的顆粒對比，其DsRed-Rab7細胞攝取量有所下降且對細胞亞結構的損傷程度顯著減輕，該結果也在NIH小鼠重復給藥試驗中得到驗證[12]。Malvindi等[13]發(fā)現(xiàn)含有二氧化硅外殼的IONP對A549和HeLa細胞的氧化應激作用和細胞亞結構損傷均明顯減輕。某些表面修飾可通過減毒有助于其生物應用。如表面經亞硝酸鈉硝基化的IONP與人外周血淋巴細胞在體外條件下作用24 h后彗星試驗結果為陰性，提示其可作為釋放一氧化氮的納米攜帶者在體內發(fā)揮抗炎功效[14]。而某些表面修飾則可增加納米顆粒的毒性，如與無包被的IONP(Fe3O4NP)相比，油酸鈉(sodium oleate)包被的IONP(Fe3O4NP)對Balb/3T3和COS-1的細胞毒性較大[15]。本研究對比了兩種不同表面修飾且攜帶不同電荷的IONPs，結果顯示Amine-IONP和PEG-IONP均可引起A549細胞總ROS水平升高以及線粒體和內質網損傷，且Amine-IONP誘導氧化應激效應的能力要強于PEGIONP。攜帶正電荷的顆?？赡芨子诒槐砻鎺ж撾姾傻募毎麛z取，考慮帶正電荷的Amine-IONP表現(xiàn)出的更為顯著的氧化應激作用和DNA斷裂效應可能與其細胞攝取水平較高有關[16]。

圖8 NAC和BHA預處理對IONPs誘導的ROS水平、彗星拖尾和微核率的影響

大量研究提示IONP可誘導氧化損傷和DNA損傷，前者是后者的主要作用機制之一，也是IONP在人體殺傷腫瘤細胞和毒性作用的主要機制[17]。粒徑約30~35 nm的IONPs(Fe2O3NP)可誘導大鼠外周血抗氧化酶出現(xiàn)顯著抑制[18]；粒徑約5 nm的IONP可誘導小鼠心肌氧化應激生物標志物如ROS、脂質過氧化(LPO)和超氧化物歧化酶等水平顯著升高，并造成心肌組織DNA損傷(彗星試驗結果陽性)[19]。在體外研究中，10 μg/mL IONP(Fe2O3NP，<50 nm)即可誘導人乳腺癌細胞(MCF-7)的ROS、GSH、LPO、超氧化物歧化酶等指標和尾部DNA百分率顯著性升高[20]。 K?ncz?l等[6]研究提示粒徑約20~60 nm的IONP與A549細胞接觸24 h后可通過內吞作用進入細胞，電鏡下每個細胞含有約幾十至幾百個顆粒，在約1/100的細胞中可見顆粒位于細胞核。該IONP 可誘導微核率和尾部DNA百分率升高，但在自由基清除劑存在的情況下遺傳毒性嚴重程度可顯著性降低。此外，IONP(Fe3O4NP)也通過氧化應激作用誘導線粒體、內質網和溶酶體等細胞亞結構損傷[21]。上述文獻結果與課題組前期研究[8]和本研究中發(fā)現(xiàn)的IONP誘導的氧化應激效應和遺傳物質損傷結果基本相符。

納米材料普遍可對細胞增殖產生抑制作用。如納米銀可誘導敘利亞倉鼠胚胎細胞發(fā)生G0/G1期細胞周期阻滯[22]，而IONP可通過影響細胞周期素依賴性激酶和細胞周期調節(jié)蛋白的表達水平而誘導人間充質干細胞G0/G1期的細胞比例下調[23]。此外，納米材料還可破壞人神經細胞的細胞骨架的穩(wěn)定性，從而干預神經形成穩(wěn)定性來干預有絲分裂的正常進行[24]。本研究中觀察到PEG-IONP在較低濃度條件下(20 μg/mL)就可產生G0/G1期細胞周期阻滯效應，且與相同濃度的Amine-IONP相比抑制效應更為顯著，并可誘導與細胞增殖有關的蛋白質p21和p53的表達量上調。PEG-IONP對A549細胞周期抑制作用是其最主要的毒性表現(xiàn)，與其誘導的NBP百分率升高有關。NBP百分率的顯著性升高提示PEG-IONP可能通過抑制細胞周期進一步干預了處于G0/G1期的細胞中染色體附著于著絲粒的過程，從而形成細胞核分離不完全的雙核細胞結構。上述結果可通過識別著絲粒的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)法微核試驗進一步驗證[25]。

綜上所述，納米顆粒的表面修飾、表面電荷分布等特性可使其細胞/組織攝取機制、毒性機制及毒性表現(xiàn)存在一定差異。就IONP而言，PEG表面修飾產生的細胞毒性和遺傳毒性較低，但PEG-IONP作為異物進入細胞后更易于干擾細胞增殖，作為腫瘤診斷試劑具有一定優(yōu)勢。本研究結果為設計合理的納米材料表面修飾結構，提高生物醫(yī)用納米材料的療效及減毒，進而推動納米材料產業(yè)發(fā)展提供了數(shù)據(jù)支持。