分子生物學(xué)技術(shù)在釀酒微生物研究中的應(yīng)用

文/南博，華潤(rùn)雪花啤酒（中國(guó)）有限公司天津分公司

1 與微生物群系研究相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)

1.1 核酸探針雜交技術(shù)

核酸探針雜交技術(shù)是根據(jù)待檢測(cè)微生物的特異性核苷酸序列合成核酸探針，在特定條件下與微生物核酸進(jìn)行雜交，再用光密度測(cè)定法直接比較核酸雜交所得到的陽(yáng)性條帶或斑點(diǎn)得出定量的結(jié)果，從而反映出相關(guān)微生物的存在及功能。

該方法具有快速、靈敏的特點(diǎn)。標(biāo)記核苷酸探針可直接用來(lái)探測(cè)溶液中、固定在膜上、細(xì)胞或組織內(nèi)的同源核酸序列。探針可以是長(zhǎng)探針（100bp～1000bp），也可以是短的寡核苷酸（10～50bp）。雜交方式可以是菌落雜交、夾縫雜交或原位雜交。

1.2 PCR技術(shù)

PCR是一種體外擴(kuò)增核酸序列從而得到多個(gè)核酸拷貝的技術(shù)。根據(jù)擴(kuò)增的模板，引物序列來(lái)源及反應(yīng)條件的不同可將PCR技術(shù)分為以下幾種:1)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)，是在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，可以用來(lái)分析不同生長(zhǎng)時(shí)期的mRNA表達(dá)狀態(tài)的相關(guān)性。2)競(jìng)爭(zhēng)PCR(C-PCR)，是一種定量PCR，通過(guò)向PCR反應(yīng)體系中加入人工構(gòu)建的帶有突變的競(jìng)爭(zhēng)模板、控制競(jìng)爭(zhēng)模板的濃度來(lái)確定目的模板的濃度，對(duì)目的模板作定量研究。競(jìng)爭(zhēng)性PCR曾被用來(lái)測(cè)定受多環(huán)芳烴污染的沉降物中的編碼鄰基二酚-2，3-加雙氧酶的dmpB基因濃度。3)擴(kuò)增的rDNA限制酶切分析技術(shù)(ARDRA)，是美國(guó)最新發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)現(xiàn)代生物鑒定技術(shù)，它根據(jù)原核生物rDNA序列的保守性將擴(kuò)增的rDNA片段進(jìn)行酶切。然后通過(guò)酶切圖譜來(lái)分析菌間的多樣性。

1.3 SYBR GREEN熒光檢測(cè)技術(shù)

在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量的SYBR熒光染料，SYBR熒光染料能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)射熒光信號(hào)。而不摻入鏈中的SYB R染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加隨PC R產(chǎn)物的增加而增加而檢測(cè)PCR產(chǎn)物，而且可以定量。

1.4 電泳分離及顯示技術(shù)

除我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE分離)銀染的方法外，還有一些通過(guò)特殊的電泳分離技術(shù)而建立的分子標(biāo)記。如變性梯度凝膠電泳(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)等，都是通過(guò)實(shí)施一些變性條件改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(如添加線性梯度的變性劑或建立變性溫度梯度等)，由于序列不同的DNA片段，其部分解鏈程度也不同，不同的結(jié)構(gòu)對(duì)DNA 在凝膠中遷移速率影響很大，結(jié)果不同序列的DNA片段在凝膠上得以高分辨率的分離。PCR-變性梯度凝膠電泳與PCR-溫度梯度凝膠電泳是根據(jù)核酸堿基序列中GC含量不同，其Tm值也不同的原理設(shè)計(jì)的。

PCR-DGGE是在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺或尿素形成從正極到負(fù)極遞增的變性劑梯度。先用特定引物PCR 增幅相同長(zhǎng)度的目的核酸片斷，電泳時(shí)核酸片段的GC含量不同，變性的位置也不同，GC含量低的先變性，含量高的后變性，由于核酸變性后遷移阻力急劇增大，遷移速度十分緩慢，從而把GC含量不同的核酸分離開(kāi)來(lái)。而PCR-TGGE則是從正極到負(fù)極形成一個(gè)遞增溫度梯度，GC含量低的先變性，含量高的后變性，從而把GC含量不同的核酸分離開(kāi)來(lái)。

2 分子生物學(xué)技術(shù)在釀酒微生物群系研究中的應(yīng)用

2.1 PCR技術(shù)用于釀酒微生物鑒定

伴隨著生物技術(shù)進(jìn)步，利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定技術(shù)鑒定菌種的方法已經(jīng)逐漸取代了依靠形態(tài)和生理生化特征的鑒定方法。四川大學(xué)胡承教授采用18SrDNA序列分析方法，驗(yàn)證常規(guī)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，得出在四川某名酒廠窖池中酵母主要以漢遜酵母、酒香酵母、固囊酵母、卵抱酵母、德克酵母和管囊酵母為主。張磊等應(yīng)用18Sr DNA序列分析與常規(guī)分類方法相結(jié)合的方式，對(duì)濃香型大曲中主要酵母菌進(jìn)行分類鑒定。

2.2 PCR-DGGE技術(shù)用于釀酒微生物的監(jiān)測(cè)

白酒釀造過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，窖池微生物、糟醅微生物與曲藥微生物之間的協(xié)調(diào)作用，直接影響著酒體的最終品質(zhì)，所以對(duì)白酒釀造過(guò)程中的微生物檢測(cè)顯得尤其重要。四川大學(xué)張文學(xué)教授利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)四川某名酒廠的濃香型白酒窖池發(fā)酵過(guò)程中，中層糟醅的細(xì)菌和真菌微生物群落的演變過(guò)程進(jìn)行了考察。發(fā)現(xiàn)入窖時(shí)，細(xì)菌和真菌都有較高的多樣性；隨著發(fā)酵過(guò)程的延伸，細(xì)菌的多樣性不斷降低，發(fā)酵一周以后，則只有一種主體細(xì)菌存在；而真菌在發(fā)酵第一周發(fā)生了主體菌的更替，發(fā)酵4周以后則一直是一類GC含量差異很小的真菌占主體。

江南大學(xué)生物工程學(xué)院采用PCR-DGGE技術(shù)，動(dòng)態(tài)檢測(cè)、比較了濃香型和芝麻香型白酒酒醅在窖池發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化過(guò)程，并通過(guò)構(gòu)建16SrRNA基因克隆文庫(kù)，分析、鑒定酒醅中含有的微生物類群。

2.3 PCR-DGGE技術(shù)用于釀酒微生物群系多樣性研究

白酒釀造環(huán)境及工藝孕育了大批寶貴而豐富的釀酒微生物資源，這些微生物通過(guò)自身的生長(zhǎng)繁衍、交替演繹形成了其特殊而復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)和豐富的酶系，使之成為釀造優(yōu)質(zhì)白酒的無(wú)法復(fù)制的核心。因此研究白酒釀造過(guò)程中微生物的多樣性及其消長(zhǎng)規(guī)律對(duì)釀酒行業(yè)具有劃時(shí)代的意義。孟鎮(zhèn)等應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)濃香型白酒大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)研究；羅惠波等應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)濃香型白酒大曲真菌群落進(jìn)行了解析；貴州大學(xué)胡萍教授利用鑲嵌式PCR-DGGE免培養(yǎng)技術(shù)對(duì)醬香型白酒制曲過(guò)程中微生物菌落組成及其動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，得出醬香型大曲間的細(xì)菌組成存在明顯差異，母曲與出倉(cāng)曲的相似性系數(shù)僅為0.29，隨著曲藥的發(fā)酵，細(xì)菌多樣性下降，優(yōu)勢(shì)菌群變化明顯。

3 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，加強(qiáng)對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)在釀酒微生物中應(yīng)用的研究分析，對(duì)于其良好實(shí)踐效果的取得有著十分重要的意義，因此在今后的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)其關(guān)鍵環(huán)節(jié)與重點(diǎn)要素的重視程度，并注重其具體實(shí)施措施與方法的科學(xué)性。

【參考文獻(xiàn)】

[1]王海燕，張曉君，徐巖，等.濃香型和芝麻香型白酒糟醅中微生物的研究[J].釀酒科技.2017（11）：60-62.

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