復(fù)合免疫親和柱-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定谷物及其制品中9種真菌毒素

王韋崗, 強(qiáng) 敏, 端禮欽

(1. 鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 江蘇 鎮(zhèn)江 212132; 2. 徐州市農(nóng)水畜禽產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心, 江蘇 徐州 221006)

真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物,廣泛存在于糧食和飼料中。目前已知的真菌毒素有400多種,其中對(duì)人類健康影響較大的有黃曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等[1,2],超過(guò)一定攝入量后會(huì)損壞人的肝功能、致癌、致畸并誘發(fā)免疫抑制性疾病[3]。世界衛(wèi)生組織已將真菌毒素納入食品安全體系重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象[4],我國(guó)GB 2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》也對(duì)上述幾種真菌毒素在食品中的限量指標(biāo)有嚴(yán)格的規(guī)定。隨著食品中真菌毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作的不斷深入,其限量指標(biāo)也將進(jìn)一步完善,對(duì)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和靈敏度都提出了更高要求。百奧明公司的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)[5],一些糧食在生長(zhǎng)和貯存過(guò)程中,經(jīng)常被多種真菌毒素污染,因此,有必要建立對(duì)多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的方法。

真菌毒素的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[6]、熒光光度法[7,8]、高效液相色譜法[9-11]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-14]等。酶聯(lián)免疫法每次只能檢測(cè)一種真菌毒素,通常用于快速篩查;熒光光度法易受基質(zhì)干擾,測(cè)定黃曲霉毒素時(shí)需要進(jìn)行化學(xué)衍生;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法由于設(shè)備較為昂貴,不利于檢測(cè)方法的普及與推廣;高效液相色譜法具有選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),是目前測(cè)定真菌毒素使用最為普遍的方法之一。采用高效液相色譜法測(cè)定真菌毒素時(shí),需要從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中分離和富集待測(cè)組分,已有的文獻(xiàn)報(bào)道中通常采用多功能凈化柱[15,16]、固相萃取柱[17-19]或免疫親和柱串聯(lián)[20]的方式對(duì)提取的樣品溶液進(jìn)行凈化處理,但是前兩種方法受樣品基質(zhì)效應(yīng)影響較大,凈化不夠徹底,容易產(chǎn)生干擾;當(dāng)需要測(cè)定的真菌毒素種類較多時(shí),免疫親和柱串聯(lián)的方式也難以適用。近些年,復(fù)合免疫親和柱成了研究的熱點(diǎn)[21-23],然而受到抗體種類的影響,商品化復(fù)合免疫親和柱的使用仍有一定的局限性。

本實(shí)驗(yàn)有針對(duì)性地從商品化免疫親和柱中獲取所需填料,混勻并重新裝填后制成真菌毒素復(fù)合免疫親和柱,在此基礎(chǔ)上,建立了在線光化學(xué)衍生-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定谷物及其制品中黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素M1(AFM1)、黃曲霉毒素M2(AFM2)、赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的檢測(cè)方法,并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化,該方法具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn),適用于實(shí)驗(yàn)室日常分析檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀、2475熒光檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司); ToxinFast光化學(xué)衍生器(由254 nm紫外燈、聚四氟乙烯反應(yīng)管組成,北京華安麥科生物技術(shù)有限公司); 3-30K離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司); CNW 12位固相萃取真空裝置、ANPEL氮?dú)獯蹈蓛x(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司); Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 材料與試劑

黃曲霉毒素總量免疫親和柱(B1、B2、G1和G2)、黃曲霉毒素M族免疫親和柱、赭曲霉毒素免疫親和柱、玉米赤霉烯酮免疫親和柱(均為0.2 mL膠/支,1 mL,美國(guó)Beacon公司);真菌毒素六合一免疫親和凈化柱(1.0 mL膠/支,6 mL,北京華安麥科生物技術(shù)有限公司);真菌毒素復(fù)合免疫親和柱(0.8 mL膠/支,6 mL,實(shí)驗(yàn)室制備);乙腈、甲醇和乙酸(均為色譜純,美國(guó)Tedia公司);氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸和吐溫-20(均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水系統(tǒng)制備的超純水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2(均為3 mg/L,美國(guó)o2si公司);黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A和B(均為10 mg/L,美國(guó)o2si公司);玉米赤霉烯酮(50 mg/L,美國(guó)o2si公司);黃曲霉毒素M2(10 mg/L,美國(guó)Supelco公司)

1.3 測(cè)定條件

色譜柱:Venusil XBP C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相:A為甲醇,B為水(乙酸調(diào)節(jié)pH=3.0)。梯度洗脫:0～23 min, 36%A; 23～34 min, 36%A～80%A; 34～45 min, 80%A。流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣體積:20 μL;柱溫:30 ℃;熒光檢測(cè)器:激發(fā)波長(zhǎng)320 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。光化學(xué)衍生系統(tǒng):光化學(xué)衍生器(254 nm紫外燈,連接于色譜柱,然后通向熒光檢測(cè)器)。

1.4 溶液的配制

磷酸鹽緩沖溶液(PBS):稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀,用900 mL水溶解,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,加水稀釋至1 L。

含1%(體積分?jǐn)?shù),下同)吐溫-20的PBS:取10 mL吐溫-20,用PBS稀釋至1 L。

9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確移取一定體積真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于棕色容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,制備成9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,密封后避光于-20 ℃冰箱中保存。其中黃曲霉毒素B1、G1和M1的質(zhì)量濃度為300 μg/L,黃曲霉毒素B2和G2的質(zhì)量濃度為30 μg/L,黃曲霉毒素M2、赭曲霉毒素A和B的質(zhì)量濃度為100 μg/L,玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度為2 mg/L。臨用前,分別準(zhǔn)確吸取一定體積的9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用初始流動(dòng)相(甲醇:水(乙酸調(diào)節(jié)pH=3.0)=36∶64)逐級(jí)稀釋,配制成相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 樣品前處理

1.5.1真菌毒素復(fù)合免疫親和柱的制備

取6 mL固相萃取柱空柱管,在底部鋪上篩板,分別將黃曲霉毒素總量免疫親和柱(B1、B2、G1、G2)、黃曲霉毒素M族免疫親和柱、赭曲霉毒素免疫親和柱、玉米赤霉烯酮免疫親和柱中的填料全部轉(zhuǎn)移至空柱管中,用PBS沖洗并使填料在柱內(nèi)混合均勻,混勻后用真空泵將填料抽至近干,并用篩板將填料壓實(shí)、壓平,制成0.8 mL膠/支的真菌毒素復(fù)合免疫親和柱。若長(zhǎng)時(shí)間不用,需重新用PBS浸潤(rùn)填料,并放置于4 ℃冰箱中避光保存。

1.5.2樣品提取與凈化

稱取(5.00±0.01) g預(yù)先粉碎并充分混勻的谷物及其制品于50.0 mL聚丙烯離心管中,加入20.0 mL乙腈-水(80∶20, v/v)提取液,渦旋振蕩提取20 min,以6 000 r/min的速度離心5 min,上清液經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾后備用。

準(zhǔn)確移取5.0 mL上清液,加入45.0 mL含1%吐溫-20的PBS,混勻。以1～2滴/s的速度將上述混勻后的溶液全部通過(guò)真菌毒素復(fù)合免疫親和柱,分別加入5.0 mL含1%吐溫-20的PBS和10.0 mL水淋洗免疫親和柱,待水滴完后,用真空泵抽干免疫親和柱。用2.0 mL甲醇以1～2滴/s的速度洗脫免疫親和柱,收集全部洗脫液至試管中。在50 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?加入1.0 mL初始流動(dòng)相,渦旋30 s溶解殘留物,經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾,收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描波長(zhǎng)的選擇

采用Waters 2475熒光檢測(cè)器3D(three-dimensional)掃描功能分別在波長(zhǎng)250～400 nm和350～600 nm范圍內(nèi)對(duì)9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行掃描,測(cè)定9種真菌毒素光化學(xué)衍生產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng),掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,經(jīng)光化學(xué)衍生后,黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A和B的最佳激發(fā)波長(zhǎng)分別為355、355、362.5、355、362.5、355、310、332.5和310 nm;最佳發(fā)射波長(zhǎng)分別為412.5、412.5、437.5、412.5、450、412.5、450、450和450 nm。綜合考慮后選擇激發(fā)波長(zhǎng)320 nm、發(fā)射波長(zhǎng)450 nm作為掃描波長(zhǎng),此時(shí)9種真菌毒素均具有較高的響應(yīng)值。

圖 1 9種真菌毒素光化學(xué)衍生后的激發(fā)和發(fā)射光譜圖

2.2 流動(dòng)相條件的選擇

分別以乙腈-水、甲醇-水和甲醇-水-乙酸作為流動(dòng)相,考察了不同流動(dòng)相條件對(duì)9種真菌毒素峰形及分離情況的影響。以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí),由于乙腈的洗脫能力較強(qiáng),各組分之間不能完全分離;以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí),通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相之間的比例能夠使9種真菌毒素實(shí)現(xiàn)基線分離。然而,在此流動(dòng)相條件下赭曲霉毒素B的響應(yīng)較低,峰變寬,峰形較差,難以滿足赭曲霉毒素B殘留的檢測(cè)要求。進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相條件,發(fā)現(xiàn)往水相中加入少量乙酸溶液后,赭曲霉毒素B的響應(yīng)明顯增加,展寬消失,同時(shí)赭曲霉毒素A和B的保留時(shí)間都發(fā)生了變化,而其他幾種真菌毒素的保留時(shí)間和峰形均無(wú)影響。調(diào)節(jié)水相中乙酸溶液的加入量,改變流動(dòng)相的pH值,考察pH值對(duì)9種真菌毒素測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果(見(jiàn)圖2)表明,流動(dòng)相pH值對(duì)9種真菌毒素的峰形、分離度和響應(yīng)值有很大影響。當(dāng)pH=3.5時(shí),赭曲霉毒素B與玉米赤霉烯酮的保留時(shí)間完全重合;隨著水相中乙酸溶液加入量的增加,流動(dòng)相pH值減小,赭曲霉毒素A和B的保留時(shí)間變短,當(dāng)pH=3.0時(shí),9種真菌毒素實(shí)現(xiàn)基線分離,且峰形和響應(yīng)值均能滿足檢測(cè)要求;繼續(xù)減小流動(dòng)相pH值,當(dāng)pH=2.8時(shí),黃曲霉毒素的保留時(shí)間變短,響應(yīng)值降低,同時(shí)赭曲霉毒素A與玉米赤霉烯酮的保留時(shí)間完全重合。因此,確定以甲醇-水作為流動(dòng)相,并用乙酸調(diào)節(jié)水相pH=3.0,在此條件下對(duì)9種真菌毒素進(jìn)行測(cè)定。

圖 2 流動(dòng)相pH值對(duì)9種真菌毒素測(cè)定結(jié)果的影響

2.3 光化學(xué)衍生對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

9種真菌毒素中黃曲霉毒素B1和G1在水溶液中會(huì)發(fā)生熒光淬滅,直接測(cè)定時(shí)熒光強(qiáng)度較弱,因此需要采用衍生的方法增強(qiáng)黃曲霉毒素B1和G1的熒光強(qiáng)度。常用的衍生方法有:柱前三氟醋酸衍生、柱后溴衍生和柱后碘衍生[24,25]等,其衍生過(guò)程、檢測(cè)靈敏度及重現(xiàn)性易受衍生溫度、時(shí)間和衍生試劑等因素影響。本試驗(yàn)利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光這一特性,采用在線光化學(xué)衍生技術(shù),以流動(dòng)相中的水作為衍生劑,對(duì)黃曲霉毒素B1和G1進(jìn)行衍生化處理,使流動(dòng)相中的水與黃曲霉毒素B1和G1作用,在芳烴上導(dǎo)入給電子基團(tuán)-OH,生成熒光更強(qiáng)、更穩(wěn)定的化合物,從而解決了黃曲霉毒素B1和G1在水溶液中發(fā)生熒光淬滅的問(wèn)題,增強(qiáng)了黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度[26]。圖3為光化學(xué)衍生前后9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定色譜圖。從圖中可以看出,經(jīng)光化學(xué)衍生之后黃曲霉毒素B1和G1的熒光響應(yīng)強(qiáng)度明顯提高,其他7種真菌毒素的熒光響應(yīng)影響較小。

圖 3 光化學(xué)衍生前后9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜圖

2.4 自制真菌毒素復(fù)合免疫親和柱性能評(píng)價(jià)

吸取1.0 mL相應(yīng)濃度的9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于50 mL聚丙烯離心管中,加入50.0 mL含1%吐溫-20的PBS,混勻,分別采用自制真菌毒素復(fù)合免疫親和柱、商品化的真菌毒素六合一免疫親和凈化柱按照1.5.2節(jié)的方法進(jìn)行過(guò)柱、淋洗、洗脫和測(cè)定,每種免疫親和柱平行測(cè)定3次,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可以看出,自制復(fù)合免疫親和柱與商品化復(fù)合免疫親和柱均具有較好的回收率,回收率均大于85%,自制復(fù)合免疫親和柱的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～2.2%,略低于商品化復(fù)合免疫親和柱(RSD值為0.6%～1.7%)。結(jié)果表明,自制復(fù)合免疫親和柱的回收率和精密度能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表 1 9種真菌毒素在不同免疫親和柱上的平均回收率和精密度(n=3)

表 2 方法的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

y: peak area;x, mass concentration, μg/L.

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

分別準(zhǔn)確吸取適量體積的9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按1.3節(jié)優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定,以峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x, μg/L)作圖,所得回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)(R2)如表2所示。向空白樣品中添加低濃度水平的9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用自制真菌毒素復(fù)合免疫親和柱,按照1.5.2節(jié)的方法進(jìn)行樣品前處理后上機(jī)檢測(cè),以S/N=3確定檢出限(LOD),S/N=10確定定量限(LOQ)。結(jié)果(見(jiàn)表2)表明,采用外標(biāo)峰面積法定量,9種真菌毒素在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.999,該方法線性范圍良好,檢出限低,可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)。

2.6 方法的加標(biāo)回收率和精密度

分別向預(yù)先粉碎并混勻的空白大米、小麥粉和玉米樣品中加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的9種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,采用自制真菌毒素復(fù)合免疫親和柱進(jìn)行樣品前處理,并按照1.3節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定,考察方法的回收率。對(duì)加標(biāo)樣品重復(fù)測(cè)定6次,考察方法的精密度。結(jié)果表明,9種真菌毒素的回收率均在80%以上,RSD為1.0%～5.6%,詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表 3 大米、小麥粉和玉米中9種真菌毒素在不同加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.7 實(shí)際樣品分析

從超市隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)50批谷物及其制品,包含大米、小麥粉、麥片、玉米和玉米面等,采用該方法測(cè)定樣品中9種真菌毒素的殘留量。在2個(gè)麥片樣品和3個(gè)玉米制品中檢出了黃曲霉毒素B1,含量分別為0.25、0.58、0.22、0.31和0.71 μg/kg,玉米赤霉烯酮的檢出率較高,在小麥粉、玉米和玉米淀粉等9個(gè)樣品中均有檢出,含量從19.17至53.06 μg/kg不等,未超過(guò)GB 2761-2017規(guī)定的限量指標(biāo),除此之外的其他7種真菌毒素均未檢出。分別采用GB 5009.22-2016第三法和5009.209-2016第一法測(cè)定陽(yáng)性樣品中的黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮[25,27],測(cè)得黃曲霉毒素B1的含量為0.24～0.73 μg/kg,玉米赤霉烯酮的含量為19.62～55.35 μg/kg。結(jié)果表明,本文建立的在線光化學(xué)衍生-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定谷物及其制品中9種真菌毒素的方法及自制真菌毒素復(fù)合免疫親和柱能夠滿足食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

3 結(jié)論

本文采用自制真菌毒素復(fù)合免疫親和柱凈化樣品,富集谷物及其制品提取液中的9種真菌毒素,并基于紫外光照射能夠增強(qiáng)黃曲霉毒素B1和G1的熒光強(qiáng)度,建立了在線光化學(xué)衍生-高效液相色譜同時(shí)測(cè)定谷物及其制品中9種真菌毒素的方法。采用本方法,可以依據(jù)真菌毒素種類選擇合適填料自制真菌毒素復(fù)合免疫親和柱,既能減少抗體的浪費(fèi),同時(shí)還能夠利用抗體抗原的特異性和高選擇性從復(fù)雜的待測(cè)樣品中提取目標(biāo)化合物,避免無(wú)關(guān)待測(cè)物質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的干擾。該方法的各項(xiàng)指標(biāo)能夠滿足谷物及谷物制品中9種真菌毒素檢測(cè)的要求。