枯草芽孢桿菌NBF809防治番茄棒孢葉斑病研究

黃大野 曹春霞 張亞妮 王開梅 饒 犇 萬中義 周榮華 楊自文

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北武漢430064）

番茄棒孢葉斑病是由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的一種重要病害，在世界多數(shù)番茄種植區(qū)域都有發(fā)生，近年來傳入我國(guó)，對(duì)我國(guó)番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響（Kodama & Hasama，1994；Schlub et al.，2009；李明遠(yuǎn)，2015；杜公福 等，2017）。多主棒孢寄主廣泛，除了侵染番茄，還能侵染黃瓜和茄子等蔬菜以及花卉和橡膠等5 300余種植物，侵染破壞力強(qiáng)，傳播途徑廣，極易變異，導(dǎo)致其由次要病害上升為世界公認(rèn)的主要病害（Smith et al.，2009；高葦 等，2011；李寶聚 等，2012）。

國(guó)內(nèi)缺少相應(yīng)的番茄抗性品種，化學(xué)防治仍然是防治棒孢葉斑病的主要手段。但該病菌極易產(chǎn)生抗藥性，目前已有其對(duì)苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、乙霉威和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道（Hasama et al.，1991；Date et al.，2004；Ishii et al.，2007；Miyamoto et al.，2009；Huang et al.，2013）。同時(shí)，化學(xué)殺菌劑的頻繁使用也會(huì)對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成影響，因此亟須更為安全有效的防治方法。近年來應(yīng)用芽孢桿菌作為生防菌防控真菌性和細(xì)菌性病害已經(jīng)有大量報(bào)道，因其能有效預(yù)防和控制作物病害，被普遍認(rèn)為是一種環(huán)境友好且安全有效的防治方法（K?berl et al.，2013）。

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisNBF809是由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存的具有高殺菌活力的菌株，前期研究表明其對(duì)多種植物病原菌有良好的抑制作用，本試驗(yàn)研究其對(duì)番茄棒孢葉斑病的防治效果，以期為以后的田間示范和應(yīng)用推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌NBF809分離自番茄根際土壤。番茄棒孢葉斑病菌由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離保存。50%啶酰菌胺水分散粒劑由德國(guó)巴斯夫公司生產(chǎn)。番茄品種為中雜109，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育。細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，Marker D2000購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 離體對(duì)峙試驗(yàn)

將NBF809菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，25℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h備用。番茄棒孢葉斑病菌經(jīng)斜面活化到PDA平板5 d后，用打孔器打取4 mm菌餅接種于PDA平板中央，在距離菌餅25 mm處等距離取4個(gè)點(diǎn)接種NBF809，每點(diǎn)5 μL。以不接種NBF809作為對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)6 d后觀察抑菌效果。刮取抑菌帶邊緣棒孢葉斑病菌菌絲，在顯微鏡（OLYMPUS CX21，Tokyo，Japan）下觀察其與對(duì)照菌絲的形態(tài)區(qū)別。

1.3 枯草芽孢桿菌NBF809對(duì)番茄棒孢葉斑病的防效

盆栽試驗(yàn)于2017年7月在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玻璃溫室進(jìn)行，播種催芽的番茄種子，在常規(guī)管理下培養(yǎng)30 d后備用。多主棒孢C. cassiicola孢子制備按照Miyamoto等（2009）的方法。將斜面保存的多主棒孢接種到PDA平板上活化并繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)繁，25 ℃黑暗培養(yǎng)10 d，隨后用無菌手術(shù)刀片刮去菌絲，在BLB（black light blue）燈下25 ℃培養(yǎng)3 d產(chǎn)孢（李寶聚 等，2012）。刷取孢子溶于無菌水中，利用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度到1×104個(gè)·mL-1備用。

按照1.2的方法制備NBF809發(fā)酵液，調(diào)整芽孢數(shù)為1×108cfu·mL-1，噴施于番茄葉片表面至飽和，以50%啶酰菌胺水分散粒劑有效成分用量200 μg·mL-1為藥劑對(duì)照，噴施清水為空白對(duì)照。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)32株番茄。24 h后噴施病原菌孢子懸浮液至葉片飽和，25 ℃保濕培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)對(duì)照和各處理病情指數(shù)并計(jì)算防效。

病害分級(jí)按照Ishii等（2007）的標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí)：無病斑，0.1級(jí)：病斑占葉面積＜1%，0.5級(jí)：病斑占葉面積1%～5%，1級(jí)：病斑占葉面積6%～10%，2級(jí)：病斑占葉面積11%～20%，3級(jí)：病斑占葉面積21%～30%，4級(jí)：病斑占葉面積31%～40%，5級(jí)：病斑占葉面積41%～50%，6級(jí)：病斑占葉面積51%～60%，7級(jí)：病斑占葉面積61%～70%，8級(jí)：病斑占葉面積71%～80%，9級(jí)：病斑占葉面積81%～90%，10級(jí)：病斑占葉面積＞90%。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)植株數(shù)×級(jí)別）/（調(diào)查總株數(shù)×最高代表級(jí)別）×100

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.4 NBF809菌株抗菌素生物合成基因的鑒定

以細(xì)菌DNA提取試劑盒提取NBF809菌株基因組DNA，通過PCR對(duì)NBF809菌株的抗生素生物合成基因進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)23組基因（表1），合成 Bacillomycin D、Bacilysin、Ericin、Fengycin、Iturin、Mersacidin、Mycosubtilin、Sublancin、Subtilin、Subtilosin和Surfactin 11種抗菌素，引物序列和反應(yīng)條件參考Chung等（2008）的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 9.1.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，在0.05水平下進(jìn)行單因素差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NBF809菌株對(duì)多主棒孢的離體抑制效果

NBF809菌株和多主棒孢對(duì)峙培養(yǎng)6 d后，病菌菌落和NBF809之間具有明顯的抑菌帶（圖1）。通過光學(xué)顯微鏡下（40倍）觀察，和對(duì)照菌絲相比，抑菌帶邊緣多主棒孢菌絲發(fā)生明顯的腫脹變形及扭曲（圖2）。

圖1 離體對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果

圖2 顯微鏡下NBF809對(duì)峙培養(yǎng)多主棒孢的菌絲形態(tài)

2.2 NBF809菌株對(duì)番茄棒孢葉斑病的防效

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），施用1×108cfu·mL-1枯草芽孢桿菌NBF809發(fā)酵液對(duì)番茄棒孢葉斑病具有良好的防治效果，病情指數(shù)顯著低于清水對(duì)照，防治效果達(dá)到73.26%，對(duì)照藥劑50%啶酰菌胺水分散粒劑的防效最佳。

表1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)NBF809抗菌素生物合成基因

2.3 NBF809菌株抗菌素生物合成基因的鑒定

通過23組抗菌素合成基因的篩選，對(duì)NBF809菌株產(chǎn)生抗菌素基因進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到5個(gè)合成抗菌素基因，分別為bacD、ituC、ituD、mrsM和mycC（圖3），所對(duì)應(yīng)抗菌素為Bacilysin、Iturin、Mersacidin 和Mycosubtilin 。片段大小與預(yù)期相似，序列相似度均大于95%。

表2 枯草芽孢桿菌NBF809對(duì)番茄棒孢葉斑病的防效

圖3 合成抗菌素基因的擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，從番茄根際土壤分離到的枯草芽孢桿菌NBF809在溫室條件下對(duì)番茄棒孢葉斑病具有良好的防治效果。通過對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生4種抗菌素，這些成分可能在病害防治中起到重要作用。除了抗菌代謝產(chǎn)物的分泌，其他的作用機(jī)制如誘導(dǎo)抗性、在番茄葉片的定殖能力等需要進(jìn)一步確定（Ukness et al.，1993；Pieterse et al.，1998；Bais et al.，2004）。

枯草芽孢桿菌可以防治灰霉病、白粉病、枯萎病和稻瘟病等多種病害（陳志誼，2015），但在番茄棒孢葉斑病上的生物防治應(yīng)用為首次報(bào)道。棒孢葉斑病極易產(chǎn)生抗藥性，NBF809菌株對(duì)于棒孢葉斑病抗性菌株的治理具有一定的作用，同時(shí)NBF809菌株與化學(xué)殺菌劑的混用有助于延緩殺菌劑對(duì)病原菌的抗性壓力，NBF9809菌株與化學(xué)殺菌劑的相容性、最佳配比及田間應(yīng)用技術(shù)需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)開展了離體抑菌和活體盆栽試驗(yàn)，由于芽孢桿菌在田間應(yīng)用時(shí)會(huì)受到溫度、濕度、土壤、pH值等外界因素的影響（van Rij et al.，2004），因此其田間防治效果需要進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)價(jià)。