極細鏈格孢菌劑的初步研制及其除草作用研究

朱海霞 馬永強 郭青云

摘要

本研究選用一株具有除草活性的生防菌株極細鏈格孢Alternaria tenuissima HZ-1作為研究對象，通過載體和助劑的篩選，初步研制出可濕性粉劑，并對雜草離體葉片、盆栽雜草及田間小區(qū)雜草的致病效果進行了測定。結(jié)果表明，HZ-1最適載體為高嶺土，助劑為羧甲基纖維素、可溶性淀粉和白炭黑，菌株HZ-1可濕性粉劑對不同雜草離體葉片致病性表現(xiàn)為：密花香薷>冬葵>野燕麥>薄蒴草>酸模葉蓼>藜>萹蓄。盆栽致病性結(jié)果顯示，HZ-1可濕性粉劑對薄蒴草、藜和密花香薷致病效果突出，對冬葵和酸模葉蓼次之，對萹蓄、野燕麥無效。小區(qū)試驗顯示對繁縷、藜和密花香薷有顯著除草效果。該菌株可作為防除薄蒴草、藜、密花香薷和繁縷等雜草的生物除草劑進行進一步研究。

關(guān)鍵詞

極細鏈格孢菌HZ-1; 菌劑研制; 除草效果

中圖分類號：

S 432， S 482.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018177

Development of the biocontrol agents of Alternaria tenuissima

HZ-1 and its herbicidal activity

ZHU Haixia， MA Yongqiang， GUO Qingyun

（Academy of Agriculture and Forestry Sciences of Qinghai University， State Key Laboratory of Plateau Ecology and

Agriculture of Qinghai University， Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining， Ministry of

Agriculture， Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province， Xining 810016， China）

Abstract

Alternaria tenuissima HZ-1 was selected as a high virulent strain to weeds. Proper carrier and auxiliary were screened and wettable powder was developed as biological herbicide， and the virulence to different weeds in vitro and in vivo was also determined. The results showed that the optimal vector of HZ-1 was kaolin， the auxiliarges were carboxymethyl cellulose， soluble starch and silica. The susceptibility of strain HZ-1 wet powder to different weeds in vitro was as follows： Elsholtzia densa Benth.>Malva verticillata L.var. crispa>Avena fatua L>Lepyrodiclis holosteoides （C.A.Mey.） Fisch.et Mey.>Polygonum lapathifolium L.>Chenopodium album L.>Polygonum aviculare L.. Pot experiments showed that wet powder of HZ-1 had significant virulence to L. holosteoides， C. album and E. densa， but no virulence to P. aviculare and A. fatua. Field trials demonstrated that wet powder of HZ-1 was highly virulent to Stellaria media， C. album and E. densa. This strain could be further studied as a biological herbicide to control L. holosteoides， C. album， E. densa and Stellaria media.

Key words

Alternaria tenuissima HZ-1; development of agent; control effect to weeds

當今，農(nóng)田雜草控制還是以化學除草劑為主體[1]。隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化水平的提高，全球范圍內(nèi)的除草劑使用量將繼續(xù)增加，因此，市場需求開始面向廣譜、高效、低毒的新型除草劑的研制。微生物除草劑可有效替代部分高毒化學農(nóng)藥，減輕農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期和大量依賴化學除草劑施用所造成的能源和環(huán)境問題。目前，發(fā)展生物除草技術(shù)已逐漸成為全球的共識[1-2]。極細鏈格孢HZ-1是從青海省獨特的生態(tài)條件下篩選出的具有除草活性的生防菌，前期研究發(fā)現(xiàn)該菌株對藜Chenopodium album、冬葵Malva verticillata var. crispa、酸模葉蓼Polygonum lapathifolium等雜草表現(xiàn)出不同程度的致病作用，安全性評價結(jié)果顯示，該菌株除對春油菜有輕微影響外，對春小麥、蠶豆、豌豆和青稞4種作物相對安全，可作為防除藜、酸模葉蓼等闊葉雜草生物除草劑的候選菌株[3]。

由于微生物除草劑藥效受外界環(huán)境影響很大，選擇合適的劑型及載體助劑保持菌劑的穩(wěn)定性和侵染活力至關(guān)重要[4-7]。鑒于此，本研究以極細鏈格孢HZ-1作為研究對象，通過載體及助劑配方篩選，研制了HZ-1可濕性粉劑，并測定了其對雜草的離體及活體毒力作用，旨在為加快HZ-1制劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試載體和助劑

載體：高嶺土、硅藻土、拉開粉、石灰石、爐渣、沙子、黏土;穩(wěn)定劑：膨潤土、輕質(zhì)碳酸鈣、白炭黑;潤濕劑：SDS、拉開粉;分散劑：羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、SDS、吐溫、木質(zhì)素磺酸鈉;保護劑：腐殖酸、糊精、海藻酸鈉、可溶性淀粉。

1.2 載體和助劑的篩選

將高嶺土、硅藻土、沙子、黏土、聚乙烯醇、SDS、吐溫、拉開粉和羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、膨潤土、輕質(zhì)碳酸鈣、可溶性淀粉等載體和助劑，分別按2%的比例加入PDA培養(yǎng)基。將8 mm的菌餅置于含不同載體或助劑的培養(yǎng)基中，觀察不同載體及助劑對菌株生長的影響。

1.3 菌株HZ-1可濕性粉劑制備

將4℃斜面保藏的菌株HZ-1進行液體培養(yǎng)作為種子液，以麥麩為發(fā)酵基質(zhì)，葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，在25℃培養(yǎng)條件下固體培養(yǎng)9 d。獲得的固體發(fā)酵物烘干粉碎，制成菌粉。

將HZ-1菌粉與篩選出的適宜載體、助劑，按照50%載體、5%保護劑、6%分散劑、1%穩(wěn)定劑和3%潤濕劑的比例混合，將樣品初步磨細、混勻，然后于小型高速粉碎機中粉碎，制成可濕性粉劑[4]。

1.4 HZ-1可濕性粉劑對雜草的防除效果

1.4.1 HZ-1可濕性粉劑對雜草離體葉片的致病性

采集新鮮的雜草葉片，葉表用無菌水清洗后自然晾干，將葉片正放于墊有無菌濾紙和竹簽的培養(yǎng)皿中，加無菌水使濾紙浸濕;制備的HZ-1可濕性粉劑有效活菌數(shù)約為1.0×1010mfu/g（mycelial fragment unit）（下同），將可濕性粉劑溶解，進行離體葉片接種試驗，以只接種清水的葉片為對照，每處理重復(fù)3次。置于25℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，觀察葉片發(fā)病情況。供試雜草葉片為：薄蒴草Lepyrodiclis holosteoides（C.A.Mey.）Fisch.et Mey.、藜Chenopodium album L.、野燕麥Avena fatua L.、萹蓄Polygonum aviculare L.、密花香薷Elsholtzia densa Benth.、酸模葉蓼Polygonum lapathifolium L.、冬葵Malva verticillata L.var. crispa L.。

1.4.2 HZ-1可濕性粉劑對盆栽及田間小區(qū)雜草的致病效果

將田間生長至7～12葉期，葉色正常的薄蒴草、藜、密花香薷、冬葵、酸模葉蓼、萹蓄、野燕麥移栽于花盆（d=15 cm）中，于實驗室內(nèi)培養(yǎng);將HZ-1可濕性粉劑溶解后噴霧接種到移栽的健康雜草植株上。以接種清水的植株作為空白對照，設(shè)3次重復(fù)。接種后的雜草植株置于室溫，7 d后調(diào)查雜草發(fā)病程度，稱鮮重，計算發(fā)病率、鮮重防效，所有數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析。同時將HZ-1可濕性粉劑溶解后噴霧接種到4～6葉期田間小區(qū)雜草藜、密花香薷、灰綠藜Chenopodium glaucum L.和繁縷Stellaria media （L.） Cyr.植株上，試驗小區(qū)面積0.18 m2，每個處理重復(fù)3次，觀察其控制效果，7 d后調(diào)查雜草發(fā)病程度，計算發(fā)病率、鮮重防效。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%;

鮮重防效=（對照雜草鮮重-處理殘存雜草鮮重）/對照雜草鮮重×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體和助劑篩選

將所有載體和助劑按照2%的比例分別加入PDA培養(yǎng)基中，接入直徑8 mm的菌餅進行平板培養(yǎng)，測量菌落直徑和菌落數(shù)。菌株HZ-1在含不同載體或助劑的培養(yǎng)基上菌落直徑和菌落lgcfu見表1?？梢钥闯?，HZ-1在各種載體及助劑上生長狀態(tài)總體較好，且多數(shù)相差不大，綜合原料成本選擇高嶺土、羧甲基纖維素、可溶性淀粉和白炭黑作為HZ-1的載體和助劑進行后續(xù)試驗。

2.2 菌株HZ-1可濕性粉劑制備

以高嶺土作為載體，羧甲基纖維素作為分散劑，可溶性淀粉作為保護劑，結(jié)合適量的白炭黑作為穩(wěn)定劑，進行可濕性粉劑的制備。雖然拉開粉對菌落生長沒有起到促進作用（表1），但在農(nóng)藥可濕性粉劑配制過程中，它不僅可以保證產(chǎn)品遇水時能夠被快速潤濕，而且能協(xié)助分散劑與原藥粒子迅速結(jié)合，因此，本試驗中選用拉開粉作為潤濕劑。

表1 HZ-1在含有不同載體和助劑的PDA培養(yǎng)基上菌落數(shù)量及直徑

Table 1 Number and diameter of HZ-1 colonies on PDA media with different carrier and auxiliary

將HZ-1菌粉與篩選出的適宜載體、助劑，按照50%高嶺土、5%可溶性淀粉、6%羧甲基纖維素、1%白炭黑和3%拉開粉的比例混合，將樣品初步磨細、混勻，然后于小型高速粉碎機中粉碎，制成可濕性粉劑。

2.3 HZ-1可濕性粉劑對雜草離體葉片的致病性

菌株HZ-1可濕性粉劑溶解后，接種到薄蒴草、藜、野燕麥、萹蓄、密花香薷、酸模葉蓼、冬葵離體葉片上（圖1），接種7 d 后，各種雜草葉片可見不同程度的病斑，并逐漸向四周擴展，酸模葉蓼、藜、萹蓄葉片失綠、發(fā)黃，卷曲;薄蒴草葉片黃化，褐色斑紋逐漸擴展;野燕麥、密花香薷和冬葵葉片變褐、開始發(fā)黑腐爛，葉片上出現(xiàn)大量白色菌絲，90%葉片腐爛壞死。菌株HZ-1可濕性粉劑對不同雜草離體葉片致病性表現(xiàn)為：密花香薷>冬葵>野燕麥>薄蒴草>酸模葉蓼>藜>萹蓄。

圖1 HZ-1可濕性粉劑對不同雜草離體葉片的防效

Fig.1 Control effects of HZ-1 wettable powder on different weeds leaves in vitro

2.4 HZ-1可濕性粉劑對盆栽雜草防治效果

如圖2所示，噴施菌株HZ-1可濕性粉劑后，除萹蓄和野燕麥外，其余5種雜草均表現(xiàn)出受害癥狀，不同程度地出現(xiàn)萎蔫，褪綠變黃，甚至枯萎。結(jié)合發(fā)病率、鮮重防效綜合分析（表2），HZ-1可濕性粉劑對藜、薄蒴草和密花香薷致病效果突出，對冬葵和酸模葉蓼次之，對萹蓄和野燕麥無效。表2結(jié)果顯示，接種后7 d，HZ-1可濕性粉劑對藜的發(fā)病率和鮮重防效分別為63.2%和59.0%，對薄蒴草和密花香薷的發(fā)病率和鮮重防效分別為55.1%、53.5%和55.7%、50.6%。因此，HZ-1可作為防除薄蒴草、藜和密花香薷等農(nóng)田雜草的生物除草劑進行進一步研究。

圖2 HZ-1可濕性粉劑對不同雜草的盆栽防效

Fig.2 Control effects of HZ-1 wettable powder on potted weed plants

表2 菌株HZ-1可濕性粉劑對不同雜草盆栽致病力1）

Table 2 Virulence of strain HZ-1 wettable powder to

different weeds in pot

1） 同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level. The same below.

2.5 HZ-1可濕性粉劑對田間小區(qū)雜草的致病效果

如圖3所示，噴施菌株HZ-1可濕性粉劑后，密花香薷、繁縷、灰綠藜、藜不同程度地出現(xiàn)受害癥狀。結(jié)合發(fā)病率、鮮重防效綜合分析（表3），HZ-1可濕性粉劑對繁縷、藜致病效果突出，對密花香薷和灰綠藜次之。接種后7 d，HZ-1可濕性粉劑對繁縷的發(fā)病率和鮮重防效分別是95.4%和92.27%，對藜和密花香薷的發(fā)病率和鮮重防效分別是78.6%、73.91%和58.5%、47.53%。

表3 菌株HZ-1可濕性粉劑對田間小區(qū)雜草致病力

Table 3 Virulence of strain HZ-1 wettable powder to

weeds in plot fields

3 結(jié)論與討論

微生物除草劑的開發(fā)應(yīng)用比化學農(nóng)藥的開發(fā)存在更大的難度，其藥效受外界環(huán)境影響很大，選擇合適的劑型及載體助劑是生物農(nóng)藥開發(fā)成功與否的關(guān)鍵[8-11]。微生物制劑中的助劑性質(zhì)決定菌劑的各項初始理化性質(zhì)[12]，本研究以具有較強致病活性的生防菌株HZ-1作為研究對象，通過培養(yǎng)基皿內(nèi)試驗篩選法篩選出了HZ-1適合的載體為高嶺土，分散劑為羧甲基纖維素，保護劑為可溶性淀粉，穩(wěn)定劑為白炭黑。通過助劑配方的篩選，確保了制劑有效成分的生物活性。按照“農(nóng)藥制劑加工實驗”[4]中可濕性粉劑的配制方法，將HZ-1菌粉與篩選出的載體、助劑按照50%高嶺土、5%可溶性淀粉、6%羧甲基纖維素、1%白炭黑和3%拉開粉的比例混合、粉碎，初步制備了HZ-1可濕性粉劑。

圖3 HZ-1可濕性粉劑對4種雜草的小區(qū)防效

Fig.3 Control effect of HZ-1 wettable powder on 4 species of weeds in plot fields

可濕性粉劑具有附著性強，漂移少，對環(huán)境污染輕，生產(chǎn)成本低，便于運輸?shù)忍攸c，并可以使不溶于水的微生物加工成可兌水使用的農(nóng)藥制劑。本研究初步得到了菌株HZ-1可濕性粉劑配方，對于該菌劑的各項性能，包括流動性、潤濕性、懸浮性、細度、穩(wěn)定性能等指標，還需要進一步測定。

本研究利用初步研制出的可濕性粉劑，測定了其對雜草離體葉片的致病性以及對盆栽雜草和田間小區(qū)雜草的致病效果。該菌株對不同雜草離體葉片致病性表現(xiàn)為：密花香薷>冬葵>野燕麥>薄蒴草>酸模葉蓼>藜>萹蓄。盆栽試驗中對薄蒴草、藜和密花香薷致病效果突出，小區(qū)試驗中對繁縷、藜和密花香薷有顯著除草效果。因此，該菌株可作為防除薄蒴草、藜、密花香薷和繁縷等雜草的生物除草劑進行進一步研究。同時，有望協(xié)調(diào)運用其他環(huán)境友好型防治技術(shù)，構(gòu)建田間雜草生物防治技術(shù)體系，從而有效替代部分高毒化學農(nóng)藥，緩解和減輕農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期和大量依賴化學除草劑施用所造成的能源和環(huán)境問題。

雜草生防菌劑應(yīng)具備對靶標雜草強致病力的同時，又得保證其穩(wěn)定性[13]。由于微生物細胞本身的生理特性，不能有效解決生物細胞長期常溫保存的技術(shù)瓶頸，使得發(fā)酵基質(zhì)的固體劑型不能像化學除草劑一樣長期貯藏，與化學除草劑相比處于劣勢[14-16]。因此，未來還需探索出一種延長其貨架壽命，提高對不良環(huán)境抵抗力的方法，例如加強不同微生物、微生物菌劑與減量除草劑復(fù)配的研究力度，為該菌株大田應(yīng)用奠定更堅實的基礎(chǔ)。

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（責任編輯： 楊明麗）