• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于代謝組學(xué)慢性心力衰竭腎陽(yáng)虛證代謝模式的研究

    2017-08-22 05:07:13鄭海生
    關(guān)鍵詞:陽(yáng)虛證氣陰腎陽(yáng)虛

    鄭海生,蔣 健

    (1.寧夏醫(yī)科大學(xué),銀川 750004; 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 200021)

    【中醫(yī)多學(xué)科研究】

    基于代謝組學(xué)慢性心力衰竭腎陽(yáng)虛證代謝模式的研究

    鄭海生1,蔣 健2△

    (1.寧夏醫(yī)科大學(xué),銀川 750004; 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 200021)

    目的: 探討基于色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)及模式識(shí)別為主的代謝組學(xué)技術(shù)及其方法,研究慢性心力衰竭腎陽(yáng)虛證的代謝模式及相應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。方法: 收集正常人以及臨床常見(jiàn)慢性心力衰竭腎陽(yáng)虛證與氣陰兩虛證病例的尿樣,以LC/MS為代謝組學(xué)研究方法,檢測(cè)分析各組間尿樣中代謝模式的差異。結(jié)果:代謝組學(xué)研究表明,與正常組比較慢性心衰組有21種內(nèi)源性化合物含量與正常組有明顯不同;與氣陰兩虛組比較,慢性心力衰竭腎陽(yáng)虛組有16種內(nèi)源性化合物含量與氣陰兩虛組有明顯不同。結(jié)論:以代謝模式改變?yōu)橐罁?jù)的代謝組學(xué)研究方法,通過(guò)代謝通路成功地將不同證型加以區(qū)分,說(shuō)明代謝組學(xué)技術(shù)及其方法研究中醫(yī)學(xué)證本質(zhì)的思路及方法可行,從代謝模式的角度闡述中醫(yī)證本質(zhì)是中醫(yī)現(xiàn)代化可實(shí)踐和深化的技術(shù)和方法學(xué)體系。

    腎陽(yáng)虛證;證本質(zhì);代謝組學(xué);同病異證

    代謝組學(xué)正處于快速發(fā)展階段,日益成為研究的熱點(diǎn)。高通量、高分辨率的分析技術(shù)與生物信息學(xué)相整合,對(duì)生物代謝層面進(jìn)行研究提供了解生物體的獨(dú)特視角。代謝組中各代謝產(chǎn)物水平的高低與發(fā)育、生理、病理狀態(tài)有關(guān),代謝組是一個(gè)細(xì)胞或組織的生物化學(xué)表現(xiàn)型[1](the biochemical phenotype of a cell or tissue)。代謝組學(xué)通過(guò)整體、動(dòng)態(tài)的方法研究人體生理病理狀態(tài),可把與臟腑生理病理密切相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化反映出來(lái)。

    本研究將從臨床慢性心力衰竭(CHF)腎陽(yáng)虛病人著手,探討臨床腎陽(yáng)虛病例與非腎陽(yáng)虛病例之間不同的代謝網(wǎng)絡(luò)變化模式,試圖找到這些疾病共性的代謝途徑,即腎陽(yáng)虛代謝組學(xué)特征譜,探究中醫(yī)證候?qū)W在代謝網(wǎng)絡(luò)層面的生物學(xué)本質(zhì),為尋找中西醫(yī)結(jié)合治療這些疾病提供思路和途徑。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料

    選取2008年6月至2008年12月上海市曙光醫(yī)院心內(nèi)科確診的慢性心衰患者72例,其中腎陽(yáng)虛組38人,年齡(65.12±6.78)歲;氣陰兩虛組24人,年齡(68.43±10.60)歲;正常對(duì)照組48人,年齡(67.56±11.26)歲。所有樣本排除應(yīng)激及冠心病、溶血性疾病、肝腎功能異常及感染者、精神病患者;妊娠或哺乳期婦女。各證型組患者年齡、病程、心衰水平分級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

    慢性心力衰竭的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Framingham心力衰竭標(biāo)準(zhǔn)[2]。慢性心力衰竭中醫(yī)腎陽(yáng)虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[3]。正常對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn):健康體檢者經(jīng)詳細(xì)體檢及胸透、心電圖、血壓、血尿常規(guī)、血糖、肝腎功能等理化檢查,評(píng)定無(wú)心、腦、肝、腎、肺和內(nèi)分泌等主要器官系統(tǒng)的實(shí)質(zhì)性病變者。

    2 檢測(cè)儀器及方法

    2.1 檢測(cè)儀器

    實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑由上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心提供。色譜純甲醇、色譜純乙腈、色譜純甲酸均購(gòu)自Merck公司;Waters 中國(guó)有限公司超高效液相色譜單級(jí)四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/QTOFMS型號(hào)Acquity Ultra Performance LC-Q-TOF premie)、Waters 中國(guó)有限公司UPLC C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Millipore中國(guó)有限公司Milli-Q超純水系統(tǒng)(型號(hào)Milli-Q Adventage)Waters中國(guó)有限公司MassLynx操作系統(tǒng)。所用試劑氯甲酸乙酯(ECF)、氯仿、無(wú)水乙醇、吡啶、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鈉皆為分析純,購(gòu)自上海潤(rùn)潔化學(xué)試劑有限公司。內(nèi)標(biāo):L-2-氯苯丙氨酸,購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。

    2.2 尿液樣品的采集及預(yù)處理

    采集納入研究的慢性心力衰竭和慢性腎功能衰竭患者的腎陽(yáng)虛證和非腎陽(yáng)虛證及健康對(duì)照者的空腹晨尿(用樣品桶收集患者入院當(dāng)日晚上12∶00至次日晨8∶00的尿液混勻)約10 ml,置于15ml有蓋圓底塑料離心管,立即放置于低溫冰箱-80℃冷凍保存待實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前將尿液樣品取出,常溫下解凍、搖勻,采集2 ml放入離心機(jī)5000 r/min(rpm)離心5 min,進(jìn)行LC-MS分析。

    2.3 流動(dòng)相條件

    試驗(yàn)中流動(dòng)相設(shè)定為流動(dòng)相A:水+0.1%甲酸;流動(dòng)相B:乙腈+0.1%甲酸。

    2.4 UPLC/QTOFMS分析條件

    質(zhì)譜條件:以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣;電噴霧電離正離子模式;飛行管檢測(cè)模式V型;毛細(xì)管電壓(capillary voltage) 3.5 kV;錐孔電壓(Sampling cone) 35v;萃取錐孔(Extraction cone) 3v;源溫 (Source temperature) 100℃;脫溶劑氣溫度(Desolvation temperation) 400℃;反向錐孔氣流(Cone gas flow) 50l/h;脫溶劑氣(Desolvation gas flow) 600 l/h;低質(zhì)量區(qū)分辨率(Lm resolution) 4.7v;高質(zhì)量區(qū)分辨率(Hm resolution)15v;離子能量(Ion energy) 0;碰撞能量(Collision energy) 6v;碰撞池入口(Collision cell entrance) 2v;碰撞池出口(Collision cell exit) -10v;碰撞氣流速(Collision gas flow) 0.5 mL/min;檢測(cè)器(Detector) 1700v;掃描時(shí)間(Scan time) 1s;掃描時(shí)間間隔(Inter scan time) 0.02s; 質(zhì)荷比范圍:50~1000 m/z。

    表1 流動(dòng)相洗脫梯度

    2.5 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    數(shù)據(jù)的提取方法用UPLC/QTOFMS配套的MarkerLynx (waters)軟件,進(jìn)行基線矯正、峰判別與匹配、內(nèi)標(biāo)和系統(tǒng)雜峰的排除和峰的歸一化等計(jì)算過(guò)程,最終得到由指定的峰序列號(hào)(保留時(shí)間/質(zhì)荷比)、觀測(cè)點(diǎn)(樣品號(hào))以及歸一化后峰面積組成的三維矩陣數(shù)據(jù)集,導(dǎo)入Simca-P12.0軟件進(jìn)行OPLS-DA(正交偏最小二乘法判別)分析,運(yùn)用變量投影重要性分析(VIP, variable importance for the projection)方法區(qū)分組間代謝輪廓貢獻(xiàn)較大的代謝物。多維統(tǒng)計(jì)中找到的差異代謝物,應(yīng)用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和單因素ANOVA分析驗(yàn)證,結(jié)合VIP值大于5并差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的代謝物確定為潛在標(biāo)記物。

    3 結(jié)果

    3.1 各組尿液代謝物分析在同一保留時(shí)間,各組尿液色譜峰大小、高低表達(dá)有差異(圖1)。模式識(shí)別分析結(jié)果顯示,正常對(duì)照組與慢性心力衰竭組尿液代謝物呈明顯的分離趨勢(shì) (圖2),慢性心衰腎陽(yáng)虛組與氣陰兩虛組尿液代謝物完全分離(圖5)。

    圖1 心衰病人與正常人尿樣UPLC/QTOFMS總離子流圖

    圖2 正常組與慢性心衰組尿液代謝組學(xué)PLS-DA得分圖注:CLASS1=正常組,CLASS2=心衰組

    圖3 正常組與慢性心衰組尿液SIMCA-P12.0-PLS分析結(jié)果負(fù)載圖

    圖4 VIP>5的物質(zhì)28個(gè),其中能初步鑒定20個(gè)

    圖5 慢性心衰中腎陽(yáng)虛VS氣陰兩虛尿液代謝組學(xué)PLS-DA得分圖注:CLASS1=氣陰兩虛,CLASS2=腎陽(yáng)虛

    圖7 S_PLOT VIP>5共21個(gè),可以初步鑒定的物質(zhì)16個(gè)

    3.2 潛在標(biāo)記物采用UPLC/QTOFMS自帶的相似性匹配軟件結(jié)合保留時(shí)間,將正常組與慢性心力衰竭各個(gè)峰歸屬為特定的物質(zhì),找到2組共有的內(nèi)源性物質(zhì)29種(圖3);慢性心衰腎陽(yáng)虛組與氣陰兩虛組共有內(nèi)源性物質(zhì)21種(圖6)。進(jìn)一步用OPLS-DA法對(duì)正常組與慢性心衰組尿液樣本共有的29種代謝物重新建模,尋找VIP>5的高度相關(guān)代謝物。通過(guò)NISTOS標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照進(jìn)行質(zhì)譜信息匹配,對(duì)可能的代謝標(biāo)記物進(jìn)行初步鑒定。與正常組比較,慢性心衰組有21種內(nèi)源性化合物含量與正常組有明顯不同(圖4)。為尋找與各中醫(yī)證型高度相關(guān)的代謝物,用OPLS-DA法對(duì)慢性心衰腎陽(yáng)虛組與氣陰兩虛組尿液樣本共有的21種代謝物重新建模,尋找VIP>5的高度相關(guān)代謝物,與氣陰兩虛組比較,慢性心衰腎陽(yáng)虛組有16種內(nèi)源性化合物含量與氣陰兩虛組有明顯不同(圖7)。

    4 討論

    本功研究顯示,從單個(gè)病種的研究中,慢性心力衰竭患者的代謝模式圖與正常組在空間分布上呈分離趨勢(shì),并得到可以確認(rèn)的21種含量不同的代謝產(chǎn)物,即代謝組學(xué)技術(shù)成功地進(jìn)行了“辨病”。 進(jìn)一步以慢性心力衰竭腎陽(yáng)虛組和氣陰兩虛組進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),慢性心力衰竭患者的腎陽(yáng)虛組和氣陰兩虛組代謝模式圖在空間分布上呈分離趨勢(shì),并得到2組間可以確認(rèn)的16種含量不同的代謝產(chǎn)物,提示利用代謝組學(xué)技術(shù)及方法可以實(shí)現(xiàn)中醫(yī)證型的區(qū)分,達(dá)到“辨證”的目的。

    從代謝組學(xué)所得到的這些不同的差異代謝物是各個(gè)代謝途徑中能反映整體信息的一些關(guān)鍵信息點(diǎn),其可以從能量代謝、微量氨基酸代謝、腸道菌群代謝等具體的代謝網(wǎng)絡(luò)途徑,由點(diǎn)到面地區(qū)分了慢性心力衰竭患者腎陽(yáng)虛組與氣陰兩虛組不同的代謝模式,同時(shí)這些差異性代謝物可反映與具體病理生理相對(duì)應(yīng)的代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常后物質(zhì)和功能的改變。這種以組學(xué)闡釋的方式可以更好地將中醫(yī)證型所具有的多層次、復(fù)合性物質(zhì)變化與整體觀得以明確的表達(dá)。

    與實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)相比,這種以系統(tǒng)整體的角度通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)層面闡述病與證的不同代謝模式的技術(shù)及方法更適合運(yùn)用于中醫(yī)證型本質(zhì)的探討與研究。由于其以組學(xué)的形式和相互關(guān)聯(lián)的多個(gè)代謝標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行相關(guān)病與證的不同的代謝模式的區(qū)分,與實(shí)驗(yàn)室經(jīng)典生化指標(biāo)相比,其可以顧及一般生化指標(biāo)中不被關(guān)注,但極可能是反映“證”概念特點(diǎn)的重要物質(zhì)。并通過(guò)研究其對(duì)應(yīng)的相關(guān)代謝通路,探究并發(fā)現(xiàn)與“證”概念相關(guān)的代謝模式,便于我們更深入地了解具有整體性與復(fù)合性的中醫(yī)“證”概念所反映的病理生理過(guò)程中物質(zhì)和功能的變化過(guò)程。本次的代謝組學(xué)研究結(jié)果說(shuō)明,這種組學(xué)研究方法在區(qū)分不同病或證上已體現(xiàn)出方法學(xué)的優(yōu)勢(shì),這也可能同樣對(duì)于具有相近證概念(如脾陽(yáng)虛證)提供了相應(yīng)的方法學(xué)支持,而彌補(bǔ)或改觀單純靠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)所呈現(xiàn)的區(qū)分“證”型指標(biāo)特異性差的特點(diǎn)。從本次對(duì)慢性心力衰竭病證結(jié)合研究結(jié)果可驗(yàn)證,代謝組學(xué)方法在中醫(yī)證型研究中的方法學(xué)優(yōu)勢(shì)與可行性。本研究從代謝組學(xué)小分子水平初步反映了慢性心力衰竭腎陽(yáng)虛證、氣陰兩虛證代謝特征,從生物代謝角度為研究中醫(yī)證候的現(xiàn)代內(nèi)涵提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),以期為中醫(yī)證候本質(zhì)研究作出有益的探索。

    [1] 邱德有,黃璐琦.代謝組學(xué)研究-功能基因組學(xué)研究的重要組成部分[J].分子植物育種,2004,2(2):165-177.

    [2] 張建,華琦. 心力衰竭的診斷與治療[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:173-175.

    [3] 鄭筱萸. 中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2002:80-81.

    【臨床基礎(chǔ)】

    Kidney-Yang Deficiency Metabolic Mode Research in Chronic Heart Failure Based on Metabonomics

    ZHENG Hai-sheng1,JIANG Jian2△

    (1.NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China; 2.DawnHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China)

    Objective: To investigate kidney yang deficiency metabolic patterns and metabolic networks changes by metabolomics which based on GC/MS and pattern recognition. It is to construct a methodology to suitable for TCM’s syndrome theories. Methods: Collecting urine samples of chronic heart failure patients who appear kidney yang deficiency syndrome and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome. Then their different metabolic patterns is to be distinguished metabolic profiling changes. 72 patients were divide into 2 groups: 38 chronic heart failure cases in the kidney deficiency syndrome group,24 chronic heart failure cases in the Qi deficiency and Yin deficiency syndrome group,48 normal people to be treated as control group. And collecting the first time urine samples after hospitalization is to be collected and applied to study metabolic pattern change of control group,kidney Yang deficiency and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome. Results: The metabolomics indexes showed chronic heart failure and control group’s metabolomic pattern graph distribute different area, at the same time chronic heart failure kidney yang deficiency group and Qi deficiency and Yin deficiency syndrome group metabolomic pattern graph also distribute different area. Conclusion: The metabolomics is showed chronic heart failure and normal people can be distinguished by LC/MS. Meanwhile chronic heart failure and chronic kidney failure disease’s kidney yang deficiency and non-kidney yang deficiency can be distinguished by LC/MS. They discriminate kidney yang deficiency and non-kidney yang deficiency different metabolomic pattern. The results certificate metabolomics technology can be applied in the investigation of TCM syndrome. This technology should be expanded and strengthened.

    Kidney yang deficiency; Syndrome essence;Metabolomics;Same syndrome for different diseases

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30572286)-基于代謝組學(xué)的腎陽(yáng)虛證本質(zhì)的研究

    鄭海生(1975-),男,甘肅渭源人,副教授,醫(yī)學(xué)博士,從事中醫(yī)內(nèi)科理論研究。

    △通訊作者:蔣 健(1956-),男,江蘇蘇州人,主任醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士,從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)科消化病研究,Tel: E-mail:

    R541.6+1

    A

    1006-3250(2017)05-0645-03

    2016-10-21

    猜你喜歡
    陽(yáng)虛證氣陰腎陽(yáng)虛
    實(shí)脾散治療脾腎陽(yáng)虛證糖尿病腎病患者的臨床療效觀察
    溫中止瀉湯聯(lián)合臍療治療腹瀉型腸易激綜合征(脾腎陽(yáng)虛證)臨床觀察
    巴戟天及其炮制品對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠HPA軸功能的改善作用
    中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:57:22
    探討溫腎化瘀利水法治療慢性腎功能衰竭腎陽(yáng)虛、瘀水互結(jié)型的有效性及安全性
    二仙湯及其拆方對(duì)腎陽(yáng)虛證小鼠附睪P34H、Prdx6的影響
    生脈飲在氣陰兩虛型心力衰竭中的應(yīng)用
    糖網(wǎng)1號(hào)方治療氣陰兩虛型糖尿病性視網(wǎng)膜病變玻璃體積血22例
    溫陽(yáng)解郁湯治療脾腎陽(yáng)虛型抑郁癥30例
    治療脾腎陽(yáng)虛型潰瘍性結(jié)腸炎30例
    加味炙甘草湯治療緩慢性心律失常氣陰兩虛型臨床研究
    精品久久久久久久末码| 插逼视频在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产亚洲91精品色在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产美女午夜福利| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av在线蜜桃| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 国产黄a三级三级三级人| 在线观看美女被高潮喷水网站| 一级毛片我不卡| 好男人在线观看高清免费视频| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品熟女久久久久浪| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲av免费高清在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 少妇的逼水好多| 色5月婷婷丁香| 伦理电影大哥的女人| 伦精品一区二区三区| 日本熟妇午夜| 男女边摸边吃奶| 久久久久久久久大av| 99九九线精品视频在线观看视频| 色播亚洲综合网| 男女视频在线观看网站免费| 五月天丁香电影| 高清视频免费观看一区二区 | 97精品久久久久久久久久精品| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲成色77777| 白带黄色成豆腐渣| 黄色配什么色好看| 看免费成人av毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 午夜激情久久久久久久| 少妇的逼好多水| av在线天堂中文字幕| 欧美一区二区亚洲| 久久6这里有精品| 午夜老司机福利剧场| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产一级毛片在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久a久久爽久久v久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美xxⅹ黑人| 国产精品国产三级专区第一集| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久久精品94久久精品| 一边亲一边摸免费视频| 男女国产视频网站| 欧美成人一区二区免费高清观看| 精品一区二区三区视频在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 午夜久久久久精精品| 国产探花极品一区二区| 中文天堂在线官网| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 五月玫瑰六月丁香| 在线观看免费高清a一片| 亚洲人与动物交配视频| 美女高潮的动态| 免费黄网站久久成人精品| 禁无遮挡网站| 大话2 男鬼变身卡| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久99精品国语久久久| 99久久精品热视频| 久久久久久国产a免费观看| 在线观看免费高清a一片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲不卡免费看| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲经典国产精华液单| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 少妇的逼好多水| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲av男天堂| 久久精品综合一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 婷婷色综合www| 久久精品夜色国产| 亚洲在线观看片| 日本熟妇午夜| 国产午夜福利久久久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 国产极品天堂在线| 国产一区二区三区av在线| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美清纯卡通| 一级av片app| 欧美成人午夜免费资源| 免费少妇av软件| 搞女人的毛片| 久久精品人妻少妇| 最新中文字幕久久久久| 欧美性感艳星| 亚洲成人久久爱视频| 观看免费一级毛片| 国产成人精品福利久久| 亚洲精品视频女| 少妇丰满av| 精品一区二区免费观看| 国产成人91sexporn| 国产精品三级大全| 最近视频中文字幕2019在线8| 最近视频中文字幕2019在线8| 69av精品久久久久久| 日本一二三区视频观看| 国产片特级美女逼逼视频| 国产成人aa在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 国产淫语在线视频| 亚洲成人av在线免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲国产精品专区欧美| 我的老师免费观看完整版| 日本-黄色视频高清免费观看| 国内精品美女久久久久久| 天堂网av新在线| 亚洲欧美日韩东京热| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩强制内射视频| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲人与动物交配视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 色5月婷婷丁香| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 午夜福利视频1000在线观看| 又爽又黄a免费视频| 国产伦在线观看视频一区| 日韩一本色道免费dvd| 国产成人福利小说| 亚洲人与动物交配视频| 赤兔流量卡办理| 一区二区三区高清视频在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 免费观看性生交大片5| 国产v大片淫在线免费观看| 尾随美女入室| 在线观看av片永久免费下载| 黑人高潮一二区| 国产精品久久久久久av不卡| 最近的中文字幕免费完整| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 午夜免费男女啪啪视频观看| 直男gayav资源| 激情五月婷婷亚洲| 在线观看美女被高潮喷水网站| 97超碰精品成人国产| 午夜老司机福利剧场| 亚洲成人一二三区av| 久久久欧美国产精品| 日本免费在线观看一区| 免费看光身美女| 丰满少妇做爰视频| 秋霞在线观看毛片| 亚洲在线观看片| 大香蕉久久网| 久久精品人妻少妇| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产免费又黄又爽又色| 免费黄频网站在线观看国产| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久久久久久久中文| 国产一级毛片七仙女欲春2| 少妇丰满av| 亚洲av一区综合| 热99在线观看视频| 亚洲经典国产精华液单| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美激情在线99| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产单亲对白刺激| 99久久九九国产精品国产免费| 日韩制服骚丝袜av| 丝袜美腿在线中文| 99久久人妻综合| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 搡老乐熟女国产| 一本一本综合久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲av中文av极速乱| 精品久久国产蜜桃| 免费黄色在线免费观看| 国产色婷婷99| 国产永久视频网站| 舔av片在线| 免费看av在线观看网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩av免费高清视频| 99久国产av精品国产电影| 男女那种视频在线观看| 国产av码专区亚洲av| 国产一区二区在线观看日韩| 成人漫画全彩无遮挡| 精品久久久精品久久久| 亚洲人与动物交配视频| 久久久欧美国产精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 69人妻影院| 国产69精品久久久久777片| 国产成人精品一,二区| 国产精品99久久久久久久久| 国产黄片美女视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产成人精品久久久久久| 激情五月婷婷亚洲| 国产亚洲一区二区精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品人妻视频免费看| 午夜福利视频精品| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 高清av免费在线| 如何舔出高潮| 伦理电影大哥的女人| 亚洲精品色激情综合| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲,欧美,日韩| 男的添女的下面高潮视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成人一二三区av| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产亚洲91精品色在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜福利视频1000在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品一区二区免费观看| 99久久精品国产国产毛片| 久久久欧美国产精品| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美激情在线99| 日韩欧美国产在线观看| 欧美精品一区二区大全| 一级二级三级毛片免费看| 欧美 日韩 精品 国产| 看免费成人av毛片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 黄色配什么色好看| 日韩大片免费观看网站| 99久国产av精品国产电影| 精品久久久久久久久久久久久| 天堂中文最新版在线下载 | 免费人成在线观看视频色| av在线蜜桃| 91久久精品国产一区二区三区| 成年免费大片在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 成人无遮挡网站| 高清在线视频一区二区三区| av福利片在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产一区二区三区综合在线观看 | 五月玫瑰六月丁香| 国产人妻一区二区三区在| a级一级毛片免费在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产高清有码在线观看视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久久久久久久久免费av| 草草在线视频免费看| 一级毛片久久久久久久久女| 97精品久久久久久久久久精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 99热这里只有精品一区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 能在线免费观看的黄片| 国产精品不卡视频一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 一边亲一边摸免费视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 欧美激情国产日韩精品一区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 91精品伊人久久大香线蕉| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产午夜福利久久久久久| 舔av片在线| 国产91av在线免费观看| 色网站视频免费| 少妇被粗大猛烈的视频| 嫩草影院入口| 直男gayav资源| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一夜夜www| 久久久久久久久久久丰满| 在线播放无遮挡| 亚洲无线观看免费| 男的添女的下面高潮视频| 日本免费在线观看一区| 日韩伦理黄色片| 18禁在线播放成人免费| 国产成人aa在线观看| 少妇的逼水好多| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| av在线天堂中文字幕| 欧美极品一区二区三区四区| 国内精品一区二区在线观看| 少妇丰满av| 插阴视频在线观看视频| 国产高清三级在线| 男女边摸边吃奶| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲成人一二三区av| 伦理电影大哥的女人| 床上黄色一级片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产淫片久久久久久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 我的女老师完整版在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产精品人妻久久久影院| 一本一本综合久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 联通29元200g的流量卡| 免费看a级黄色片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 麻豆成人av视频| 国产极品天堂在线| av卡一久久| av专区在线播放| 99久久精品热视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 日本免费在线观看一区| 国产伦精品一区二区三区视频9| av又黄又爽大尺度在线免费看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 一本久久精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久久国产一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 欧美一区二区亚洲| 别揉我奶头 嗯啊视频| 免费高清在线观看视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品人妻熟女av久视频| 一个人看的www免费观看视频| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲av在线观看美女高潮| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| videossex国产| 国产单亲对白刺激| 色综合色国产| 亚洲av福利一区| 久热久热在线精品观看| 免费观看在线日韩| 综合色丁香网| 国产综合懂色| av.在线天堂| 18禁在线播放成人免费| 亚洲人成网站高清观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 有码 亚洲区| 内地一区二区视频在线| 91久久精品电影网| 久久韩国三级中文字幕| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲av免费高清在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产 亚洲一区二区三区 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 成年人午夜在线观看视频 | 国产精品国产三级专区第一集| 久久韩国三级中文字幕| 日韩视频在线欧美| 国产真实伦视频高清在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 午夜免费观看性视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 观看免费一级毛片| 日本黄大片高清| 视频中文字幕在线观看| 成人综合一区亚洲| 亚洲欧美精品专区久久| 最近手机中文字幕大全| 久久久久久久久久成人| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲三级黄色毛片| 久久这里只有精品中国| 三级毛片av免费| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久精品欧美日韩精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费观看a级毛片全部| 熟女人妻精品中文字幕| 国产老妇女一区| 精品久久国产蜜桃| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲最大成人手机在线| 少妇高潮的动态图| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精品一区www在线观看| 亚洲av二区三区四区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 黄色欧美视频在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲av不卡在线观看| 午夜日本视频在线| 毛片女人毛片| 亚洲色图av天堂| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲丝袜综合中文字幕| 一级毛片 在线播放| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 永久网站在线| 床上黄色一级片| 国产免费视频播放在线视频 | 婷婷六月久久综合丁香| 色视频www国产| 欧美xxⅹ黑人| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产在线男女| 亚洲国产欧美在线一区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲乱码一区二区免费版| 午夜福利视频精品| 亚洲性久久影院| 97超视频在线观看视频| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲成人av在线免费| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美日本视频| 亚洲国产欧美在线一区| videos熟女内射| 在线观看一区二区三区| 成年免费大片在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品国产自在天天线| 日韩一区二区三区影片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲国产精品成人综合色| 国产午夜精品论理片| 欧美另类一区| 精品一区二区三卡| 日韩中字成人| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久久九九精品二区国产| 在线 av 中文字幕| 欧美最新免费一区二区三区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品一及| 欧美日韩亚洲高清精品| 三级国产精品欧美在线观看| 最近手机中文字幕大全| 色综合色国产| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久精品免费免费高清| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美成人精品欧美一级黄| 男人舔奶头视频| 午夜爱爱视频在线播放| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产69精品久久久久777片| 久久国产乱子免费精品| 韩国av在线不卡| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 午夜激情欧美在线| 日韩av不卡免费在线播放| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲高清免费不卡视频| 网址你懂的国产日韩在线| 69人妻影院| www.av在线官网国产| 久久韩国三级中文字幕| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 一级黄片播放器| 欧美精品一区二区大全| 三级毛片av免费| 婷婷色麻豆天堂久久| 色视频www国产| av在线观看视频网站免费| a级毛色黄片| 在线观看av片永久免费下载| 国产淫片久久久久久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 老司机影院成人| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 中文在线观看免费www的网站| 高清日韩中文字幕在线| 在线观看人妻少妇| 亚州av有码| 中文字幕久久专区| 一级a做视频免费观看| 午夜视频国产福利| 我要看日韩黄色一级片| 久久亚洲国产成人精品v| 搡老乐熟女国产| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品精品国产色婷婷| 中文资源天堂在线| 国产精品精品国产色婷婷| 内射极品少妇av片p| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产精品国产三级国产专区5o| av在线观看视频网站免费| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 99久国产av精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品久久久久久成人av| 亚洲国产av新网站| 国产一区有黄有色的免费视频 | 成人性生交大片免费视频hd| 国产乱人视频| 久久精品夜色国产| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品久久久久久久久免| 日韩伦理黄色片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 搡女人真爽免费视频火全软件| 伊人久久国产一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 久久久精品免费免费高清| 淫秽高清视频在线观看| 免费看不卡的av| 亚洲最大成人av| 搞女人的毛片| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品不卡视频一区二区| 免费电影在线观看免费观看| 久久久久久久久久久丰满| 国产不卡一卡二| 男女边吃奶边做爰视频| 美女高潮的动态| 日韩欧美精品v在线| 国产久久久一区二区三区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男女那种视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品色激情综合| 中文字幕制服av| 亚洲综合色惰| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲精品国产成人久久av| 青春草视频在线免费观看| 久久精品综合一区二区三区| 久久精品久久久久久久性| 最新中文字幕久久久久| 高清在线视频一区二区三区| 午夜日本视频在线| 99久国产av精品| 久久久久久久久大av| 男人狂女人下面高潮的视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男女那种视频在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 免费观看精品视频网站| 久久久久久久午夜电影| 国产成人a区在线观看| 精品久久国产蜜桃| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲av二区三区四区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品熟女久久久久浪| 九九在线视频观看精品| 国产精品久久久久久精品电影| 99热这里只有是精品在线观看| 插逼视频在线观看|