豬流行性腹瀉病原學特征及其診斷與防治

羅虎臣 陳清華

摘要：豬流行性腹瀉是一種由豬流行性腹瀉病毒感染的具有高傳染性、高致病性和高死亡率的疾病，自出現(xiàn)至今對全球畜牧行業(yè)造成了巨大的損失，本文結合國內(nèi)外最新研究進展，從流行性腹瀉病毒的病原學特征和發(fā)病機制到疾病的診斷方法和預防免疫措施進行總結和綜述，以期為有效的診斷和預防流行性腹瀉病提供理論依據(jù).

關鍵詞：豬流行性腹瀉;仔豬;診斷方法;防治方式。

豬流行性腹瀉（ Porcineepidemic diarrhea，PED）是一種高度接觸性腸道傳染病.其病原為流行性腹瀉病毒（Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV），臨床癥狀主要表現(xiàn)為急性腸炎、腹瀉、嘔吐、脫水等。這種病毒發(fā)病力強，流行廣，傳染率高.對各個階段的豬健康生產(chǎn)都存在巨大的威脅.免疫等機能未完善的仔豬更易于傳染和發(fā)病，且死亡率高達100%，但死亡率也會隨豬年齡增長而降低。流行性腹瀉病最早于1971年發(fā)現(xiàn).在1978年成功分離出病毒，命名為CV777。2001年首次完成了CV777病毒的全基因組測序.解析了PEDV的基因組結構。然而，雖然隨著研究的開展，人們對PEDV的了解日益深入，但在1970至今.PEDV的疫情先后席卷了歐洲和亞洲甚至北美洲等眾多國家，造成了龐大的經(jīng)濟損失。因此，本文總結了國內(nèi)外對PEDV的病理學和生理學特征、發(fā)病機制、診斷方法以及可用于預防PEDV感染的控制措施作一綜述.以期為養(yǎng)殖和生產(chǎn)中對于PED的應對提供理論基礎和實證總結。

1.PEDV病原學特征和生物學性質(zhì)

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的一種.病毒形態(tài)近似球形.但在糞中的病毒具有長且多形性的特點，直徑在95～190nm之間，均值130nm.外覆囊膜，且囊膜上具有花瓣狀纖突結構，這些纖突結構具有一定間隔，呈放射分布。病毒內(nèi)核酸屬線性單股正鏈RNA，具有侵染能力，基因組由27000～33000個核苷酸組成.相對分子量在6—8x106，其基因組大小為28kb，包含S、N、P、M四大主要結構基因，以及ORF3附屬基因。在豬體內(nèi)PEDV中幾大結構基因的表達都保持在較高水平.因此，S、N、M、ORF3編碼的蛋白常作為PEDV的診斷和變異檢測的重要依據(jù)。PEDV對外界抵抗能力較弱，很容易被醚或氯仿滅活，同時，對高溫的耐受性不強.在4～500C的溫度范圍內(nèi).其活性相對穩(wěn)定。在4℃下，pH3—10范圍的細胞培養(yǎng)基中孵育6小時后.PEDV表現(xiàn)出低至中等的殘留感染性，而在37。C下6小時，其僅可在pH5～8.5之間的范圍保持其感染性。在小于4和大于9時完全失活。這些數(shù)據(jù)結果表明，如果PEDV在超過370C的較高溫度環(huán)境下暴露一段時間，使用酸性或堿性消毒劑可將其滅活。研究發(fā)現(xiàn).PEDV只能在腸上皮組織的培養(yǎng)物內(nèi)增殖.傳統(tǒng)犢牛血清培養(yǎng)基會抑制PEDV與紅細胞中受體的結合，故而，細胞培養(yǎng)方式難以成功。但也有學者發(fā)現(xiàn)其生長與培養(yǎng)液中的胰蛋白酶有緊密的聯(lián)系。

2.PED的發(fā)病機制

PED發(fā)病機制主要是通過口鼻途徑進入機體.豬小腸絨毛狀腸細胞表達大量的氨肽酶N （APN），是一種被鑒定為PEDV的細胞受體的糖基化跨膜蛋白。腸細胞上的高密度受體允許PEDV通過病毒一受體相互作用侵入細胞和進行復制，故而.PEDV可通過此方式侵入小腸。進入小腸后.通過小腸絨毛細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜出芽增殖.在此過程中造成宿主細胞器破壞，線粒體腫脹等情況，最終導致腸絨毛上皮吸收細胞減少.營養(yǎng)物質(zhì)吸收障礙.出現(xiàn)非絨毛萎縮式腹瀉的情況。PEDV是細胞溶解性的.被感染的腸細胞會迅速急性壞死，導致小腸中的絨毛顯著萎縮.絨毛高度與隱窩深度的比值從7：1縮減至3：l，小腸吸收面積顯著減少，營養(yǎng)物質(zhì)吸收出現(xiàn)嚴重障礙。另一方面，腸道內(nèi)ATP酶活性降低.腸上皮的鈉泵失活.腸內(nèi)滲透壓升高，出現(xiàn)滲透性腹瀉，同時，腸道黏膜上皮細胞中的各類消化酶活性和數(shù)量顯著降低.腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和分解受到限制.營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵.刺激腸道蠕動，加重腹瀉癥狀。

3.PED的診斷

PEDV在臨床、病理變化和流行病學等方面，與豬傳染性胃腸炎非常相似.因此需要準確方便的手段對疾病進行診斷，才能快速的做出應對和治療方案，減少經(jīng)濟損失。

3.1 病原學檢測

病原學檢測方法中最直接的方法是通過電鏡下觀察病毒粒子的形態(tài)特征來判斷其感染情況，但PEDV作為冠狀病毒的一種，在形態(tài)學中難以與豬傳染性胃腸炎病毒區(qū)別，所以此法不能作為診斷PED的唯一標準。

病毒分離培養(yǎng)方法通過使用疑似感染的PEDV的病料處理后接種Vero細胞.通過觀察病變情況來判斷是否為PEDV病毒感染.PEDV感染后兩天表現(xiàn)為細胞表面粗糙，顆粒增多，細胞出現(xiàn)空斑和脫落等特征.即可初步感染.后續(xù)通過結合其他檢測手段使結果更加準確。但此法檢測周期長，工序繁瑣，難以迅速便捷的診斷出PEDV的病情。

3.2 免疫學檢測

血清中和試驗法操作便捷，易于判定，因此適合較大數(shù)量的樣品檢測.也是PEDV早期的檢測方法.其原理通過在血清中檢測PEDV抗體的方式鑒定其感染情況，但由于豬腸道中黏膜免疫的特異性.因此豬血清中出現(xiàn)的抗體不一定與對PEDV的防御有關.因此診斷時還需設計對照和回歸分析，因此此法具有不確定性。

免疫熒光抗體檢測技術針對血清中和法的不確定性.通過直接免疫熒光和間接免疫熒光兩種方法，結合間接血凝試驗和電鏡檢測的方式，大大提高了檢測方法的準確性和特異性.但由于檢測周期較長等問題也影響其臨床推廣。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是檢測病毒的標準方法，此法可通過試驗直接檢測出豬糞中的抗原。其主要方法有競爭阻斷ELISA （ELISA-blocking）、斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗（ Dot -ELISA）和快速ELISA等方法。ELISA-blocking優(yōu)勢在于可檢測出存在一年以上的PEDV抗體.Dot-ELISA在敏感性和重復性上優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。

3.3 分子生物學技術

核酸探針雜交法是通過核酸探針直接檢測細胞內(nèi)是否存在相應的靶核酸序列.由于探針本身的優(yōu)勢可以保證組織和細胞本身的完整性.同時可以檢測出病毒核酸的表達.同時通過對核酸的定位了解病毒的傳播情況。但此法操作復雜，檢測周期長，涉及較為高深的分子生物學技術.臨床應用推廣較為困難。

反轉錄一聚合酶鏈式反應（RT-PCR）是病毒檢測手段當中應用最普遍的一種方法，此法具有高靈敏度、特異性強、操作簡便、檢測周期短等優(yōu)點。研究表明.根據(jù)PEDV的CV777毒株的M基因序列建立的RT-PCR檢測方法，可檢測到濃度為lOOpg/μL的PEDVRNA。

逆轉錄一環(huán)街道等溫核酸擴增技術（RT-LAMP）是一種新型的快速檢測PED的方式.目前已在胚胎性別、細菌和病毒的檢測中有較為廣泛的使用，相較于RT-PCR.本法檢測周期更短、污染更小、特異性更高。經(jīng)研究證實，RT-LAMP不僅能夠在樣品中檢測到病毒.并且可以將PDEV與豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒等與其類似的病毒區(qū)分出來，敏感性很高。

套式RT-PCR是一種特異性高、敏感性高的診斷方法.研究表明.此法在RT-PCR的反應基礎上建立起關于PEDV的檢測方法.可以有效降低RT-PCR檢測中的污染和假陽性情況.提高了檢測的準確性。

實時熒光定量（real-time RT-PCR）是基于標準PCR基礎上發(fā)展而來的檢測方式，其最大的優(yōu)勢是不僅可以定性的診斷是否病毒感染.還可通過定量分析了解病料中病毒的豐度和感染程度。研究表明.建立的基于SYBR Green I的野毒株和弱毒株的ORF3基因核苷酸序列的實時熒光定量RT-PCR檢測方法.此方法對于野毒株感染的PED和疫苗免疫效果的快速診斷具有很強的臨床意義。

4.PED的預防

由于PED發(fā)病急、發(fā)病日齡小、致死率高的特征，因此無法有效的采取主動免疫的方式來進行預防.因此通過為母豬注射弱毒或滅活的疫苗，再通過乳汁的傳遞，將特異性的抗體傳遞給仔豬，達到免疫的效果。研究表明，哈藥集團生物疫苗有限公司生產(chǎn)的PEDV和TGEV二聯(lián)滅活疫苗主動免疫保護率可達96%.被動免疫保護率也達到了85%以上。也有學者在探索PEDV、TGEV和RV的三聯(lián)滅活疫苗的應用效果.結果表明.在4個省9個豬場進行的45000頭份的保護率超過95%，免疫效果明顯。在使用疫苗時.可以在母豬分娩前20～30d通過肌肉或者后海穴注射滅活疫苗進行免疫，或者通過口服弱毒苗的方式為妊娠后期的母豬進行免疫程序.口服弱毒苗還可刺激黏膜和血清免疫抗體的產(chǎn)生，增強免疫效果。

在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，除了使用弱毒苗和滅活苗免疫母豬外.還可通過將PEDV中的基因片段轉入煙草中，通過基因表達的方式，將抗原的基因在煙草中表達，進而使用轉基因煙草飼喂動物，具有激發(fā)動物全身和黏膜免疫的效果.也為PED的免疫方法提供了新的思路。也有研究表明，構建了含有PEDV的M、S、sM基因的重組病毒感染Vero細胞，再提取細胞上清液進行免疫.也可有效刺激黏膜免疫和體液免疫水平。葛俊偉等將PEDV的纖突蛋白Sl基因片段重組于干酪乳桿菌中.或者可表達并分泌PEDV Sl蛋白的乳桿菌，再口服方式接種小鼠.可顯著提高小鼠的免疫水平.提高腸道內(nèi)免疫球蛋白的含量。但這類方式通過口服免疫具有抗原基因表達的蛋白.可能會受到消化到內(nèi)消化液等因素的影響，降低免疫效果，也有研究表明，可通過殼聚糖或類似物包被.使其克服消化生理的影響，提高利用率。

5.小結

PED作為一種危害性極強的疾病.對生豬養(yǎng)殖的影響十分深遠，造成了巨大的經(jīng)濟損失。但是隨著研究的不斷深入.我們需要相信將會有更便捷和準確的診斷方法的提出和應用.和更低風險和更高效的疫苗的研制成功.甚至出現(xiàn)直接治愈流行性腹瀉的藥物.來減少和控制甚至消滅PED對畜牧行業(yè)的影響。

參考文獻（略）