蘭科菌根真菌對干旱脅迫下鐵皮石斛生長和抗氧化能力及相關(guān)基因表達(dá)的影響

魏 明，童秦怡，柴瑞娟，丁佳紅

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬珍稀藥用植物[1]，由于缺乏有效保護(hù)，野生鐵皮石斛已處于瀕危狀態(tài)。隨著植物離體繁殖技術(shù)的發(fā)展[2]，鐵皮石斛已經(jīng)實現(xiàn)了規(guī)模化栽培，但是其藥用品質(zhì)不及野生鐵皮石斛。因此,仿野生栽培成為提高鐵皮石斛品質(zhì)的有效途徑。鐵皮石斛屬于喜陰植物，一般生長在空氣濕潤的地方，在鐵皮石斛仿野生栽培過程中常遇到環(huán)境水分不足，最終影響鐵皮石斛在野生環(huán)境中的正常生長。

水分是植物進(jìn)行新陳代謝和生長發(fā)育的重要因子，水分不足會影響植物的生長[3]。干旱脅迫能引起植物體內(nèi)的活性氧大量積累，而過多的活性氧會使細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)，細(xì)胞膜受到傷害，嚴(yán)重影響植物的生長[4]。植物體內(nèi)的抗氧化酶可以清除多余的活性氧[5]，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)，減少細(xì)胞膜損傷[6]。植物能通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性提高植株對干旱的耐受性[7]。

菌根技術(shù)是一種先進(jìn)的真菌肥料技術(shù)，在自然界中，大多數(shù)石斛在生長過程中能與相應(yīng)的真菌形成共生體[8]。研究表明，菌根真菌能促進(jìn)石斛根系吸收水分和營養(yǎng)成分，增強植株抗病性和抗逆性[9,10]，提高幼苗的生理活性，促進(jìn)幼苗生長[11]。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)干旱能提高石斛次生代謝產(chǎn)物的積累[12]，對石斛藥用品質(zhì)的形成具有一定的作用。本試驗通過接種菌根真菌來研究干旱脅迫下菌根真菌對鐵皮石斛幼苗生長和抗氧化防御能力及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討蘭科菌根真菌對鐵皮石斛干旱脅迫的緩解作用及機制，為鐵皮石斛的菌根化栽培提供理論依據(jù)，也為鐵皮石斛仿野生化栽培提供方法，對提高鐵皮石斛藥用品質(zhì)具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛無菌苗由安徽工程大學(xué)組培基地提供，蘭科菌根真菌(OM)為本實驗室從野生金釵石斛中分離的絲核菌(編號為OM12)，初步鑒定為角菌根菌屬(Ceratorhizasp.)，由本實驗室保存；栽培培養(yǎng)基為粉碎的樹皮，營養(yǎng)源為腐熟的豆餅。

1.2 試驗設(shè)計

將菌種接種在PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 d，得到液體菌劑備用。試驗在安徽工程大學(xué)溫室中進(jìn)行，試驗設(shè)計分為接種菌根真菌(+M)和不接種菌根真菌(-M)兩種處理，選生長一致的鐵皮石斛無菌苗(苗高4 cm左右)為原始試驗材料，以盆栽的方式進(jìn)行培養(yǎng)。栽種之前，盆子和培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行滅菌處理，培養(yǎng)溫度為(25±0.5) ℃, 相對濕度為80%，光照強度為200 μmol·m-2·s-1，光照時間為12 h/d，培養(yǎng)基中添腐熟的豆餅作為營養(yǎng)源，樹皮和豆餅的比例為7∶3。菌根真菌接種時，每次接種菌劑10 mL，每隔6 d接種1次，連續(xù)接種3次，以不接種真菌作為對照(-M)，培養(yǎng)30 d后獲得菌根化苗(+M)和非菌根化苗(-M)。

挑選長勢一致的菌根化苗和非菌根化苗進(jìn)行干旱模擬試驗。為了模仿自然環(huán)境的干旱情況，試驗設(shè)計不同水分處理，包括正常水分對照組(well watered ，簡寫CK，培養(yǎng)基質(zhì)持水量75%～80%)、輕度干旱脅迫(light drought stress, 簡寫LS，培養(yǎng)基質(zhì)持水量為55%～60%)、中度干旱脅迫(moderate drought stress，簡寫DS，培養(yǎng)基質(zhì)持水量為40%～45%)和重度干旱脅迫(severe drought stress，簡寫SS，培養(yǎng)基質(zhì)持水量為25%～30%)。每個處理包含菌根化苗(+M)和非菌根化苗(-M)2種材料，每個處理10盆，每盆3株。用時域反射儀(TZS-1R，北京博普特科技有限公司)檢測培養(yǎng)基質(zhì)中的水分含量，水分不足時進(jìn)行補水，并記錄補水量，使各個處理水分穩(wěn)定在設(shè)定的范圍內(nèi)。培養(yǎng)時間從2017年4月至2017年9月，培養(yǎng)結(jié)束后測定各項指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)及測定方法

1.3.1菌根化苗鑒定和生物量參考Biermann和Linderman[13]描述的方法鑒定菌根的形成情況。將每盆新鮮石斛幼苗取出培養(yǎng)基，用自來水沖洗干凈，再用吸水紙吸干幼苗表面水分。按根和莖葉分開，測定株高，再分別稱取根部和地上部分的生物量， 5個重復(fù)取平均值。

1.3.2相對含水量和脯氨酸含量相對含水量用烘干法測定[14]。取新鮮葉片0.5 g，放入裝滿蒸餾水的試管中，避光放置24 h，葉片充分吸水后，取出葉片，擦干表面水分，稱量飽和鮮重，然后放入干燥箱中于105 ℃烘干至恒重，稱其干重，重復(fù)3次取平均值。相對含水量(RWC, %)=(鮮重-干重)/(飽和鮮重-干重)。游離脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定[14]。

1.3.3電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量電解質(zhì)滲透率用相對電導(dǎo)率表示，相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法測定[14]。取新鮮葉片0.5 g，用蒸餾水洗凈后，除去葉片表面水分，放入裝有10 mL去離子水的試管中，靜置24 h后用電導(dǎo)儀測其初電導(dǎo)率(S1)，再將試管放入沸水中煮大約15 min，直至葉片變黃，冷卻后測定終電導(dǎo)率(S2)。相對電導(dǎo)率(EL, %)=(初電導(dǎo)率S1)/(終電導(dǎo)率S2)×100%。丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定[15]。

過氧化氫(H2O2)含量采用Uchida等[16]的方法進(jìn)行測定。取新鮮葉片0.5 g，加入1∶1比例的丙酮，研磨成勻漿后離心，取1 mL上清液，加入0.2 mL硫酸鈦和0.1 mL濃氨水，形成沉淀后離心，沉淀用丙酮洗滌3次后加入5 mL硫酸，于415 nm處進(jìn)行比色測定吸光值，然后計算H2O2含量。H2O2含量(μmol·g-1)=(C×V)/(F×V1)，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的H2O2的濃度(μmol·L-1)；V為樣品提取液體積(mL)；V1為測定時樣品提取液體積(mL)；F為葉片鮮重(g)。

1.3.5抗氧化酶活性取1 g新鮮葉片加入20 mL磷酸鹽緩沖液，在冰浴中研磨，離心后，上清液用于保護(hù)酶活性測定。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性分別用SOD和CAT試劑盒測定，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行；過氧化物酶(POD)用愈創(chuàng)木酚法測定[17]，單位均為U·g-1。

1.3.6RNA提取及熒光定量PCR分析利用RNA提取試劑盒(上海生物工程公司)提取鐵皮石斛葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，方法參照試劑盒說明書。以鐵皮石斛肌動蛋白基因(β-actin)為內(nèi)參基因[18],根據(jù)鐵皮石斛POD基因設(shè)計半定量引物[19]。由于鐵皮石斛SOD和CAT基因序列未知，從Genbank查找擬南芥、煙草、水稻、玉米、小麥等5種植物的SOD和CAT基因序列，利用DNAMAN軟件做同源序列對比取得保守區(qū)段，設(shè)計簡并引物。SOD-Up 5′-AAGAAGGCCGTCGCAGTCGT-3′，SOD-Down 5′-GGAGTCAAGCCATAACTCC-3′, CAT-Up 5′-ATGGATCCATACAAGTCGTCC-3′, CAT-Down 5′-TTATCCATGTGCCTGTAGT-3′。以合成的鐵皮石斛cDNA為模板分別克隆SOD和CAT基因。使用近緣物種基因序列相似性的TBLASTX分析，對克隆到的鐵皮石斛SOD和CAT基因片段進(jìn)行鑒定。SOD基因片段與水稻中Cu/Zn-SOD(XP-015631402.1)基因序列相似度達(dá)到94%，CAT基因與玉米CAT3(L05934)基因序列相似度達(dá)到97%，因此可以用于設(shè)計引物(表1)。

利用SYBR Green試劑盒(Takara公司)進(jìn)行熒光定量PCR分析，在AB17500熒光定量PCR儀上進(jìn)行試驗。反應(yīng)體系(共20 μL)：10 μL SYBR Primix Ex TaqTM，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1.0μL，用ddH2O補足至20 μL；RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性15 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30循環(huán)，在72 ℃延伸步驟收集熒光信號后，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析，實驗重復(fù)3次。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)比較不同處理組間的差異顯著性，顯著性水平設(shè)定為α=0.05，采用Origin 8.6軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OM真菌對干旱脅迫下鐵皮石斛生長的影響

由表2可知，干旱脅迫抑制了鐵皮石斛幼苗的生長，鐵皮石斛株高和生物量隨著干旱脅迫程度的增加而逐漸降低；在重度干旱脅迫下，鐵皮石斛幼苗生長緩慢，并伴有黃葉產(chǎn)生，生物量也最低。接種OM真菌可以緩解干旱脅迫，無論是正常水分，還是干旱脅迫，接種OM真菌后，鐵皮石斛幼苗生長比較旺盛，產(chǎn)生新根多，株高、根重、莖葉重和總生物量均不同程度高于未接種組，且在正常水分和在重度干旱脅迫下達(dá)到顯著水平(P<0.05)?？梢?，OM真菌能有效緩解干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗生長的抑制作用，促進(jìn)鐵皮石斛幼苗生長。

2.2 OM真菌對干旱脅迫下鐵皮石斛葉片相對含水量和脯氨酸含量的影響

植物葉片的相對含水量反映了植物在干旱脅迫下整體水分虧缺狀況，而游離脯氨酸是植物體內(nèi)較為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。由圖1, A、B可知，隨著干旱程度的增加，接種和不接種OM真菌的鐵皮石斛葉片相對含水量均逐漸降低，而其葉片游離脯氨酸含量均逐漸增加。在正常水分下，接種OM真菌對鐵皮石斛葉片中相對含水量和游離脯氨酸含量影響不顯著；在干旱脅迫下，接種OM真菌能顯著增加葉片的相對含水量，降低葉片中游離脯氨酸的含量(P<0.05)。可見，OM真菌能夠改善鐵皮石斛水分代謝，緩解干旱脅迫下水分虧缺，促進(jìn)鐵皮石斛生長。

表2 OM真菌和干旱處理下鐵皮石斛幼苗的生長變化

注：表中各列的不同字母表示處理間在0.05水平差異顯著；-M. 未接種OM真菌；+M. 接種OM真菌；下圖同

Note：The different normal letters in same column of table mean significantly different among treatments at 5% level; -M. Non-inoculated OM fungi; +M. Inoculated OM fungi； The same as below figures

圖1 OM真菌和干旱處理下鐵皮石斛葉片相對含水量和脯氨酸含量變化Fig.1 The changes of relative water content and proline content in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatment under drought stress

2.3 OM真菌對干旱脅迫下細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響

電解質(zhì)滲透率是評價植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性的一個重要指標(biāo)，而丙二醛(MDA)是植物細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，MDA的含量通常用來衡量膜脂過氧化的程度，反映了細(xì)胞膜受損程度。由圖2, A、B可知，隨著干旱脅迫程度的增加，接種和不接種OM真菌的鐵皮石斛葉片的電解質(zhì)滲透率和MDA含量均逐漸增加；接種OM真菌可以顯著降低干旱脅迫下葉片的電解質(zhì)滲透率和細(xì)胞內(nèi)MDA含量(P<0.05)。植物在干旱脅迫下，產(chǎn)生的活性氧增多，會增加細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)，增加MDA含量，而OM真菌能降低膜脂過氧化反應(yīng)，降低MDA含量，緩解干旱脅迫對細(xì)胞膜的損傷，提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

2.4 OM真菌對干旱脅迫下超氧陰離子和H2O2含量影響

2.5 OM真菌對干旱脅迫下鐵皮石斛抗氧化酶活性的影響

SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，其活性與植物的抗旱性密切相關(guān)。由圖4可知，隨著干旱脅迫程度的增加，接種和不接種OM真菌鐵皮石斛葉片SOD(圖4, A)、POD(圖4, B)和CAT(圖4, C)的活性均表現(xiàn)出先增加后下降的變化趨勢，并均在中度干旱脅迫下達(dá)到最大值，且各干旱脅迫處理均顯著高于相應(yīng)正常水分對照；與不接種處理相比，接種OM真菌顯著提高了鐵皮石斛葉片的抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性。因此，干旱脅迫能顯著誘導(dǎo)增強鐵皮石斛幼苗葉片中抗氧化酶活性，OM真菌對抗氧化酶活性的增強有顯著促進(jìn)作用，從而提高植株的抗旱能力。

圖2 OM真菌和干旱處理下鐵皮石斛葉片電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量變化Fig.2 The changes of electrolyte leakage and MDA content in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatment under drought stress

圖3 OM真菌和干旱處理下鐵皮石斛葉片產(chǎn)生速率和過氧化氫含量變化Fig.3 The changes of generation rate of and H2O2 content in leaves of D. officinale seedlings with OM fungus treatment under drought stress

2.6 OM真菌對干旱脅迫下鐵皮石斛抗氧化酶基因表達(dá)的影響

定量RT-PCR結(jié)果表明，隨著干旱程度的增加，接種和不接種OM真菌鐵皮石斛幼苗葉片內(nèi)SOD(圖5, A)、POD(圖5, B)和CAT(圖5, C)基因的相對表達(dá)量均先增加后降低，并均在中度脅迫下達(dá)到最大值，而在重度干旱脅迫下各基因的表達(dá)量均有所降低，但仍顯著高于正常水分對照；與不接種處理相比，接種OM真菌處理的基因表達(dá)量均不同程度提高，且大多達(dá)到顯著水平。說明適當(dāng)?shù)母珊得{迫誘導(dǎo)了鐵皮石斛幼苗葉片內(nèi)SOD、POD和CAT基因的表達(dá)，而接種OM真菌能進(jìn)一步提高SOD、POD和CAT基因的表達(dá)，這與SOD、POD和CAT活性變化相一致?？梢姡珊得{迫下，OM真菌可以通過誘導(dǎo)抗氧化酶基因的表達(dá)，提高抗氧化酶活性，有效緩解干旱脅迫對鐵皮石斛幼苗的傷害。

圖4 OM真菌和干旱處理下鐵皮石斛抗氧化酶活性變化Fig.4 The changes of antioxidant enzyme activities in D. officinale seedlings with OM fungus treatment under drought stress

3 討 論

圖5 OM真菌和干旱處理下鐵皮石斛抗氧化酶基因表達(dá)Fig.5 The expression of antioxidant enzyme genes in D. officinale seedlings with OM fungus treatment under drought stress

植物的抗逆性與其抗氧化防御系統(tǒng)活性密切相關(guān)，干旱脅迫下，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生更多的活性氧，細(xì)胞內(nèi)自由基平衡被打破，自由基含量增加，造成膜脂過氧化，產(chǎn)生較多的MDA，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，從而影響植物生長[25]，同時干旱脅迫能誘導(dǎo)提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性，增強植物對干旱環(huán)境的耐受性[26]。在植物抗氧化系統(tǒng)中，SOD、POD和CAT等抗氧化酶能清除多余的活性氧，減輕活性氧對植物細(xì)胞的傷害，以維持植物的正常生理代謝[27]。同時，POD還是多功能酶，對植物的生長還具有調(diào)節(jié)作用。植物的保護(hù)酶系統(tǒng)可以在菌根真菌的誘導(dǎo)下提高其活性，維持細(xì)胞內(nèi)自由基的平衡，確保細(xì)胞的正常生理功能。如在干旱脅迫下，叢枝菌根真菌能提高小麥[28]和柏樹[29]抗氧化酶活性，增強幼苗對干旱的耐受性。本研究表明，接種OM真菌上調(diào)了干旱脅迫下SOD、POD和CAT基因的相對表達(dá)量，也不同程度地提高了干旱脅迫下鐵皮石斛SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，說明OM真菌通過調(diào)控多種抗氧化酶活性來增強鐵皮石斛幼苗的抗旱能力，并從分子水平參與了干旱脅迫下抗氧化防御系統(tǒng)的活動。

總之，OM真菌通過與鐵皮石斛形成菌根共生體后，顯著提高了鐵皮石斛幼苗在干旱脅迫下的含水量，改善了干旱情況下植株的水分代謝。通過上調(diào)抗氧化酶SOD、POD和CAT基因的表達(dá)，顯著提高了SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性，有效緩解了干旱脅迫導(dǎo)致的氧化損傷，穩(wěn)定了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增強了鐵皮石斛幼苗對干旱環(huán)境的適應(yīng)能力，促進(jìn)鐵皮石斛幼苗生長。因此，菌根化栽培能提高鐵皮石斛幼苗的抗旱性，為鐵皮石斛的仿野生栽培提供了依據(jù)。