茶樹CsASMT基因的克隆和表達分析

師 聰, 師環(huán)環(huán), 劉恩岐，劉 輝，秦 杰

(1 徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院，江蘇徐州 221018；2 徐州工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州 221018)

褪黑素(melatonin, MT)是大腦里“松果體腺” 分泌的一種荷爾蒙，生命必需的吲哚胺類物質(zhì)[1-2]。在1995年，褪黑素被發(fā)現(xiàn)存在于各種植物中。在植物體中，褪黑素具有很強的抗氧化性，可以大量清除活性氧和活性氮。同時它還起著信號分子的作用[3-5]，可以誘導(dǎo)或抑制與信號傳導(dǎo)[6]、細胞生長[7]、衰老[8]和葉綠素降解[9]相關(guān)的基因，進而影響植物生理功能。此外，褪黑素通過提高防御相關(guān)酶的活性來提高植物的抗病性[10]。由于褪黑素的生理功能，植物已經(jīng)形成了與褪黑素合成相關(guān)的復(fù)雜系統(tǒng)，來響應(yīng)各種環(huán)境刺激如溫度[11-12]、水脅迫[11-13]、光照強度[14-15]以及內(nèi)源性信號分子乙烯和脫落酸[12]。

高等植物中褪黑素的合成是由芳香族氨基酸色氨酸經(jīng)4種酶連續(xù)反應(yīng)生成，隨著越來越多對褪黑素的研究，催化合成褪黑素途徑相關(guān)編碼酶的基因被克隆。其中N-乙?；?5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶(ASMT)是褪黑素的合成途徑的關(guān)鍵酶。ASMT可以催化N-乙?；?5-羥色胺(N-acetylserotonin)生成褪黑素，當(dāng)5-羥色胺轉(zhuǎn)化成褪黑素急劇減少時，這步反應(yīng)是最關(guān)鍵的調(diào)控步驟[14-16]。目前，ASMT基因在水稻中被克隆[17-19]。

茶樹屬于中國重要的經(jīng)濟作物，茶葉更是人們喜歡的飲品，它與咖啡、可可被稱為世界三大飲料。但茶樹在生長過程中會遭受蟲害等生物脅迫以及低溫、干旱等非生物脅迫的困擾，嚴重影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。ASMT基因在植物抗逆等生理活動中具有重要的作用，據(jù)文獻報道水稻中ASMT基因在葉片衰老、除草劑、重金屬等逆境條件下被顯著誘導(dǎo)，在黑暗和高溫條件下，ASMT的酶活性提高進而增加褪黑素的合成[20]。另外，水稻中ASMT基因均受ABA和MeJA不同程度的誘導(dǎo)表達[21]。在擬南芥中過量表達珠美海棠的ASMT基因后，擬南芥中的活性氧水平降低，提高了植株的抗旱性[22]。進一步研究ASMT基因抗逆的分子機制將為茶樹抗逆分子育種提供理論依據(jù)。該研究基于本實驗室茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出一條ASMT，通過RACE技術(shù)克隆基因全長，并進行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建pET-32a(+)/CsASMT和pMal-c2X/CsASMT原核表達質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達CsASMT蛋白，并采用熒光定量 PCR 技術(shù)，分析CsASMT在褪黑素處理、茶尺蠖取食和不同激素處理下的表達模式，有助于揭示CsASMT對生物脅迫和非生物脅迫信號響應(yīng)過程中的作用，為進一步研究該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

材料為安徽舒城德昌2年生扦插苗盆栽，品種為國家無性系良種‘舒茶早’，茶尺蠖幼蟲采自安徽潛山茶場。選取長勢相對一致、健康、無病蟲害侵害的‘舒茶早’茶苗，用褪黑素(100 μmol/L melatonin)、水楊酸(1 mmol/L SA)、脫落酸(100 μmol/L ABA)、茉莉酸甲酯(1 mmol/L MeJA含0.05% Tween-20)噴施葉面，用清水處理作為對照。取2～3齡茶尺蠖幼蟲放于葉片上，待約1/3葉片被取食后移走幼蟲，以未取食的作為對照。每個處理做3個生物學(xué)重復(fù)，按照處理3、6、9、12和24 h后采集相同葉位的幼嫩葉片，并立即置于液氮中，放入-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1茶樹總RNA提取及cDNA合成按照RNAprep pure Plant Kit提取試劑盒說明書，以葉片為材料提取總RNA，用核酸蛋白測定儀檢測總RNA 樣品的濃度，1.2%凝膠電泳檢測總RNA的完整性。按照PrimeScriptTMReverse Transcriptase Kit試劑盒說明書以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2茶樹CsASMT基因的全長克隆利用軟件Primer Premier 5 分別設(shè)計3′-RACE和5′-RACE引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，參照SMARTTMRACE (Clontech)試劑盒說明書進行操作。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目的條帶并克隆，交由通用生物公司測序。測序結(jié)果利用Editseq軟件進行拼接，根據(jù)拼接序列設(shè)計全長驗證引物(表1)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃反應(yīng)60 s，72 ℃延伸10 min，30個循環(huán)。膠回收目的條帶、克隆、測序。

1.2.3茶樹CsASMT基因生物信息學(xué)分析蛋白的分子量和等電點利用ProtParam tool網(wǎng)站計算，TMHMM2.0預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP4.1預(yù)測蛋白的信號肽，Scratch protein Predictor對蛋白質(zhì)的二硫鍵及二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，使用SWISS-MODEL同源建模CsASMT蛋白的三級結(jié)構(gòu)，用NCBI網(wǎng)站中的blastp在線分析軟件和DNAMAN軟件對序列進行比對分析，MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4原核表達載體的構(gòu)建根據(jù)CsASMTORF和pET-32a(+)載體，設(shè)計帶有BamHI和XhoI酶切位點的上下游引物(表1)，根據(jù)pMal-c2X載體，設(shè)計帶有BamHI和PstI酶切位點的上下游引物(表1)。參照TransStartFastPfuDNA Polymerase試劑盒說明書擴增完整開放閱讀框，用限制性內(nèi)切酶分別酶切純化產(chǎn)物和載體，用 T4 DNA 連接酶在16 ℃連接過夜，再轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞，用雙酶切和測序驗證。

表1 引物序列

1.2.5CsASMT基因的原核表達參考文獻[23]方法，分別挑取測序正確的單克隆菌落接種于LB 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜，然后擴大培養(yǎng)至OD600為 0.6左右，取1 mL培養(yǎng)液至1.5 mL離心管中，10 000 r·min-1離心收集菌株。向剩余的菌液中加入50 μL的1 mol/L IPTG，28 ℃誘導(dǎo)表達6 h，取1 mL菌液備用，將最后剩余的誘導(dǎo)菌液，離心，棄盡上清，加入4 mL 1×PBS，并用移液器充分吹打混勻后，進行超聲破碎處理。用SDS-PAGE檢測蛋白表達情況，對照組分別為空載體pET-32a(+)和空載體pMal-c2X。

1.2.6CsASMT基因的表達分析熒光定量PCR分析在茶尺蠖取食、褪黑素、SA、ABA和MeJA處理后CsASMT的表達特征。提取樣品總RNA，參照TAKARA公司SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit說明書，反轉(zhuǎn)錄成熒光定量PCR模板。設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)，以茶樹GAPDH為內(nèi)參基因，參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行操作，定量結(jié)果采用2-ΔΔCt[24]分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsASMT基因的全長克隆

根據(jù)篩選的CsASMT的EST序列，以茶樹葉片cDNA為模板，采用RACE技術(shù)進行非嵌套和嵌套擴增，最終獲得3′末端序列長度為490 bp(圖1，A)，5′末端序列長度為710 bp(圖1，B)，將序列進行拼接，用設(shè)計的全長引物進行cDNA 全長的特異性擴增，通過克隆測序獲得CsASMT全長為1 282 bp(圖1，C)。

2.2 CsASMT基因的生物信息學(xué)與系統(tǒng)進化樹

生物信息學(xué)分析顯示CsASMTORF全長1 065 bp，編碼354個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為38.98 kD，理論等電點為5.37。TMHMM2.0和SignalP4.1分析結(jié)果表明CsASMT蛋白未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，屬于非分泌蛋白。Scratch protein Predictor預(yù)測CsASMT存在3個二硫鍵。利用PredictProtein進行CsASMT蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示α-螺旋占49.44%，β-折疊占14.69%，無規(guī)卷曲占35.88%。用SWISS-MODEL模擬CsASMT蛋白的三維結(jié)構(gòu)，以PDB ID:5icc.1.A為模型進行同源建模(圖2)，其一致性為42.57%，GMEQ值為0.75，說明該模型建立的可信度較高。

利用軟件MEGA6.0中的N-J的方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)，由圖可知CsASMT大致可以分為兩大類，CsASMT與MzASMT9親緣關(guān)系最近。對CsASMT氨基酸序列進行多重序列比對分析(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些不同種類的CsASMT蛋白都具有腺苷蛋氨酸(SAM)結(jié)合位點，以及N-乙酰基-5-羥色胺(NAS)保守結(jié)構(gòu)域。

M. DL2000；A.3′-RACE：1.非嵌套擴增產(chǎn)物；2.嵌套擴增產(chǎn)物；B.5′-RACE：1.非嵌套擴增產(chǎn)物；2.嵌套擴增產(chǎn)物；C.CsASMT圖1 CsASMT基因全長擴增M. DL2000; A. 3′-RACE: 1. The product of Non nested PCR; 2. The product of nested PCR; B. 5′-RACE: 1. The product of Non nested PCR; 2. The product of nested PCR; C. CsASMTFig.1 The full-length amplification of the CsASMT

圖2 預(yù)測的CsASMT 蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure prediction of protein CsASMT

2.3 CsASMT基因的原核表達

用限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行雙酶切，可得到2條帶，其中1條在1 065 bp左右，經(jīng)測序驗證與CsASMT完全一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3) pLysS后，在28 ℃、0.5 mmol/L IPTG、6 h下誘導(dǎo)表達，實驗表明pET-32a(+)/CsASMT誘導(dǎo)后全部以包涵體蛋白的形式表達(圖5，A)，pMal-c2X/CsASMT誘導(dǎo)后蛋白以可溶蛋白和包涵體蛋白兩種形式存在(圖5，B)，在上清分子質(zhì)量約為79 kD處有明顯的新增蛋白帶，而空載體對照在此處無表達條帶。因為表達載體中含有重組麥芽糖結(jié)合蛋白，所以表達的分子量比預(yù)測大。

圖3 CsASMT蛋白與不同種類的ASMT蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic relationship between CsASMT and ASMT proteins from others

2.4 CsASMT基因在不同激素處理后的表達特征分析

采用qRT-PCR對CsASMT基因在茶尺蠖取食、褪黑素、SA、ABA和MeJA處理后的表達進行檢測，結(jié)果顯示(圖6)：在茶尺蠖取食后，CsASMT各個時間點均為下調(diào)表達；在100 μmol/L melatonin處理后，CsASMT經(jīng)誘導(dǎo)6、9和12 h后均為上調(diào)表達，且第9 h表達量達到最高，約是對照的1.7倍；茶樹在1 mmol/L MeJA處理后，CsASMT基因在9 h為上調(diào)表達，約是對照組的1.2倍，在其他時間點均為下調(diào)表達；茶樹在100 μmol/L ABA和1 mmol/L SA處理后，CsASMT在各時間點表達量顯著上調(diào)，都在9 h表達量最高，分別約是對照組的7.3倍和7.5倍。

3 討 論

植物生長發(fā)育過程中常受到蟲害等生物脅迫和高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫的傷害，嚴重時會導(dǎo)致植株死亡，茶樹是極易受到惡劣環(huán)境影響的經(jīng)濟作物之一。 褪黑素作為植物中有效的內(nèi)源性自由基清除劑，或通過參與多胺等物質(zhì)的合成，或通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)酶的基因轉(zhuǎn)錄水平，扮演植物中的第一道防線的角色[25]，防止生物脅迫和非生物脅迫對植物的傷害。N-乙?；?5-羥色胺甲基轉(zhuǎn)移酶(ASMT)是褪黑素合成途徑的關(guān)鍵限速酶，它可以催化N-乙?；?5-羥色胺(N-acetylserotonin)生成褪黑素。

OsASMT1、OsASMT2、OsASMT3.水稻(AK072740、AK069308、AAL34945)；CsASMT.茶樹; AtASMT.擬南芥(At5g54160)；三角形為腺苷蛋氨酸(SAM)結(jié)合位點，長方形為推測的N-乙?；?5-羥色胺(NAS)結(jié)構(gòu)域圖4 CsASMT和其他植物的ASMT序列比對分析OsASMT1, OsASMT2, OsASMT3. Oryza sativa(AK072740, AK069308, AAL34945); CsASMT. Camellia sinensis; AtASMT. Arabidopsis thaliana(At5g54160); The triangle is the binding site of adenosine methionine (SAM), and the rectangle is the predicted structural domain of N-acetyl-5-hydroxytryptamine (NAS)Fig.4 Alignment of amino acid sequences of CsASMT and other plant ASMT

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；A.pET-32a(+)/CsASMT誘導(dǎo)表達：1.pET-32a(+)誘導(dǎo)前；2.pET-32a(+)誘導(dǎo)后上清；3.pET-32a(+)誘導(dǎo)后沉淀；4.pET-32a(+)/CsASMT誘導(dǎo)前；5.pET-32a(+)/CsASMT誘導(dǎo)后上清；6.pET-32a(+)/CsASMT誘導(dǎo)后沉淀；7.pET-32a(+)/CsASMT破碎后上清；8.pET-32a(+)/CsASMT破碎后沉淀；B.pMal-c2X/CsASMT誘導(dǎo)表達：1.pMal-c2X/CsASMT破碎后沉淀；2.pMal-c2X/CsASMT破碎后上清；3.pMal-c2X/CsASMT誘導(dǎo)后沉淀；4.pMal-c2X/CsASMT誘導(dǎo)后上清；5.pMal-c2X/CsASMT誘導(dǎo)前；6.pMal-c2X誘導(dǎo)后；7.pMal-c2X誘導(dǎo)前圖5 CsASMT誘導(dǎo)表達M. Protein marker; A.pET-32a(+)/ASMT induced expression: 1. pET-32a(+) before induction; 2.pET-32a(+)supernatant after induction; 3.pET-32a(+)precipitation of lysate afterinduction; 4.pET-32a(+)/CsASMT before induction;5.pET-32a(+)/CsASMT supernatant after induction; 6.pET-32a(+)/CsASMT precipitation of lysate afterinduction: 7.pET-32a(+)/CsASMT supernatant aftersonication; 8.pET-32a(+)/CsASMT precipitation of lysate aftesonication;B.pMal-c2X/CsASMT induced expression: 1.pMal-c2X/CsASMT precipitation of lysate after sonication; 2.pMal-c2X/CsASMT supernatant after sonication; 3.pMal-c2X/CsASMT precipitation of lysate after induction: 4.pMal-c2X/CsASMT supernatant after induction; 5.pMal-c2X/CsASMT before induction;6.pMal-c2X after induction; 7.pMal-c2X before inductionFig.5 SDS-PAGE analysis of CsASMT expression

* 代表該處理下CsASMT基因表達量與0 h(未處理)的表達量存在顯著差異(P<0.05)圖6 在不同激素、茶尺蠖取食和褪黑素處理后CsASMT基因相對表達量的qRT-PCR分析* means that the expression of CsASMT gene is significantly different between the treatment time 0 h (untreated conditions) and other treatment time under the same condition at 0.05 levelFig.6 qRT-PCR analysis of CsASMT gene relative expression levels in C. sinesis treated with different hormones, attacked by Ectropic obliqua and treated with melatonin

本研究從茶樹中克隆了一條CsASMT基因的cDNA全長序列，該基因編碼354個氨基酸，分子量為38.98 kD。多序列比對分析表明茶樹的CsASMT在結(jié)構(gòu)和同源性方面與其他植物存在著一定的差異，但不同種類的CsASMT蛋白都具有腺苷蛋氨酸(SAM)結(jié)合位點，以及N-乙?；?5-羥色胺(NAS)保守結(jié)構(gòu)域，這與Kang等[18]首次在水稻中克隆的ASMT結(jié)果相一致。進化樹分析表明，茶樹CsASMT氨基酸序列在進化上與珠美海棠在同一分支上，說明它們在同源關(guān)系上最為接近。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是技術(shù)最成熟、開發(fā)最早的外源蛋白原核表達系統(tǒng)[26]，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌進行誘導(dǎo)表達，pET-32a(+)/CsASMT經(jīng)誘導(dǎo)后蛋白在包涵體中表達，而pMal-c2X/CsASMT經(jīng)誘導(dǎo)后在上清和包涵體內(nèi)均有表達，王志軍[27]同樣采用了這2種原核表達載體，構(gòu)建了EtKR表達質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)表達后結(jié)果與本研究結(jié)果一致。不同的表達載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒誘導(dǎo)蛋白表達的位置不同，分析表達載體特點，表達載體包括眾多元件如啟動子、融合標(biāo)簽、終止子等，在這些元件中對外源蛋白的高效表達影響最大的元件是啟動子和融合標(biāo)簽。pET-32a(+)啟動子為T7啟動子，T7具有很強的啟動轉(zhuǎn)錄功能，而pMal-c2X載體啟動子是Tac，其啟動復(fù)制能力弱于T7啟動子，當(dāng)?shù)鞍妆磉_時，T7啟動子由于具有很強的啟動轉(zhuǎn)錄功能，造成了重組表達的蛋白多肽錯誤的折疊，使蛋白以包涵體的形式存在。另外，pET-32a(+)載體N端帶有Trx和His標(biāo)簽，pMal-c2X載體帶有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽，MBP融合標(biāo)簽在可溶性蛋白表達上具有明顯的優(yōu)勢，它能夠引導(dǎo)重組蛋白的正確折疊，在一定程度上增加所表達蛋白的可溶性，大量可溶性蛋白的獲得為CsASMT蛋白的功能研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

本研究檢測了CsASMT基因在茶尺蠖取食、褪黑素、SA、ABA和MeJA處理后的表達模式，證實該基因與茶樹的逆境響應(yīng)密切相關(guān)。目前, 褪黑素在植物抗蟲性中作用的研究還較少。茶尺蠖取食后，CsASMT基因呈下調(diào)模式，表明該基因在害蟲取食中可能起負調(diào)控作用。據(jù)文獻報道褪黑素是一種植物激素[28]，外源激素與內(nèi)源激素具有協(xié)同與拮抗作用，噴施外源激素后內(nèi)源激素也發(fā)生相應(yīng)的變化[29]。Arnao等[30]發(fā)現(xiàn)外源褪黑素經(jīng)大麥根吸收后，也會誘導(dǎo)內(nèi)源褪黑素含量增加。SUN等[31]用500 μmol/L褪黑素處理番茄后，番茄內(nèi)褪黑素含量約是對照的31倍。本研究發(fā)現(xiàn)外源褪黑素處理后CsASMT能夠上調(diào)表達，從而加快褪黑素的合成。外源激素的噴施對植物生長也具有重要的調(diào)控作用，SA、ABA和MeJA刺激能夠快速誘導(dǎo)植物進行響應(yīng)，Park等[21]對水稻中的3個ASMT同源基因進行了研究，發(fā)現(xiàn)基因表達均受SA、ABA和MeJA的誘導(dǎo)。本研究結(jié)果表明：ABA和SA分別在處理6和3 h后，CsASMT的表達水平就發(fā)生了顯著變化，且上調(diào)倍數(shù)較大。與ABA和SA處理相比，在MeJA 處理后，CsASMT基因只在9 h后呈上調(diào)表達。結(jié)合SA、ABA和MeJA 三者都在植物的抗逆過程中發(fā)揮重要作用，推測CsASMT可能與茶樹抗逆有關(guān)。但是，CsASMT基因在植物抗逆、抗蟲過程中是否發(fā)揮作用，需要通過遺傳轉(zhuǎn)化等手段進行驗證。